זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות 5-hydroxyמתילציטוסין בתאים ורקמות המוח, ניצול immunofluorescence כתמים ושיטות כתמי נקודה DNA.

Abstract

שינויי דנ א מרובים זוהו בגנום היונקים. מתוך זה, 5-מתילציטוסין ו-5-הידרוגרד מתילציטוסין-בתיווך מנגנונים גנטיים נחקרו באופן אינטנסיבי. 5-hydroxyמתילציטוסינוס מציג תכונות דינמיות במהלך פיתוח המוח העובריים והפוסט-לידתיים, משחק תפקיד רגולטורי בביטוי הגנים, והוא מעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות. כאן, אנו מתארים את השיטות המפורטות כולל כתמים immunofluorescence ו-DNA נקודה-כתם כדי לזהות 5-hydroxyמתילציטוסין בתאים מתורבתים ורקמות המוח של העכבר.

Introduction

שינויים אפיגנטיים, כולל שינוי ה-DNA, שינוי היסטון ו-RNA שינוי, הוכחו לשחק פונקציות חיוניות בתהליכים ביולוגיים שונים ומחלות^{1,2,3, ד ,} מיכל ^{5 ,} מיכל בן ^{6 , 7}. במשך זמן רב, מתילציה DNA (כלומר, 5-מתיל ציטוסין (5-mC)) הוצג כסמן מאוד יציב אפיגנטי ולא ניתן לשנות עוד בגנום. לאחרונה, זה נמצא כי 5-mC יכול להיות תחמוצת ל 5-הידרוxyמתילציטוסין (5-hmc) על ידי ט (10-11 טרנסמקומות) משפחה חלבונים כולל TET1, TET2, ו TET3^8,9. מחקרים נוספים מראים כי 5-hmc יכול לשמש סמן יציב ולשחק תפקידים ביולוגיים באמצעות ויסות גן ביטוי^4,10,11,12.

הראיות הקיימות מצביעות על כך 5-hmc הוא מועשר מאוד ברקמות הנוירואליות/תאים ביחס לסוגים אחרים של רקמות יונקים, ומציג תכונות דינמיות במהלך פיתוח עצבי^13,14. במערכת עצביים, 5-hmC בתיווך אפיגנטי שינויים לשחק תפקיד חשוב בוויסות תאי גזע עצביים, פעילות עצבית, למידה וזיכרון, והוא מעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות כולל תסמונת רט, אוטיזם, אלצהיימר מחלה, מחלת הנטינגטון, וכו '^{2,13,15,16,17,18,19,20}.

ישנן מספר גישות לגילוי 5-hmc בתאים ורקמות^{14,21,22,23,24}. כאן, אנו מתארים שתי שיטות כדי לזהות את קיומו של 5-hmC ולכמת את הרמה הגלובלית של 5-hmC: מכתים החיסונית של כתמים ו-DNA נקודה-כתם. שתי שיטות אלה הן נוחות ורגישות, ובשימוש בהצלחה במחקרים קודמים^{25,26,27,28,29,30}. השלבים העיקריים של שתי שיטות אלה הם denaturation DNA. עבור מכתים החיסונית של 5-hmC, טרום טיפול של דגימות עם HCl 1 M נדרש. עבור 5-hmC נקודה-כתם, דנ א הדנטורציה מבוצעת עם פתרון NaOH. שתי שיטות אלה יחד עם רצף הדור הבא הם כלים שימושיים מאוד לחקירת הפונקציה של 5-hmC.

Protocol

כל ההליכים בעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג.

1. התרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים ונוירונים

1. בידוד בתאי גזע עצביים מבוגרים מן המוח הקדמי של מבוגר (8-10 בן שבוע) C57/BL6 עכבר זכר כמתואר בעבר^31,32.
2. תרבות תאי גזע עצביים למבוגרים בלבד/F-12 בינונית המכילה 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 תוספת, 1% אנטיביוטי-antimycotic, ו 2 מ"מ L-גלוטמין בחממה 5% CO₂ ב 37 ° c. לגרום הבידול של תאים גזע עצבי מבוגרים עם חומצה retinoic 1 μm ו 5 μm forskolin עבור 48 h כמתואר בעבר^31,32.
3. בידוד נוירונים מן היום העובריים 17 (E17) היפוקמאני של העכבר והתרבות עם מדיום נוירוסיס המכיל של 0.25% L-גלוטמין, 0.125% גלוטמקס ו 2% B27 תוספת בחממה 5% CO₂ ב 37 ° צ' כמתואר לעיל³³.

2. הטרנס הפרזיה של העכבר

1. הכינו 10% כלוראל הידרוקסיד, 4% פאראפורמלדהיד (הכלט) ו פוספט מאגור באגירה (PBS) יום אחד לפני הניסוי, ולאחסן ב 4 ° c.
2. מורדם בוגר זכר או נקבה C57 BL/6J עכבר עם 10% כלוראל הידרוקסיד (50 מ"ג/ק"ג, כלומר), ולהבטיח כי החיה הוא מורדם עמוקות על ידי בדיקת תגובת הגוף. תקן כל איבר בסרט דביק על לוח פלסטיק (במצב פנים-למעלה).
3. חותכים את העור ואז את השריר עם מספריים ניתוח. פתח את חלל בית החזה. עם מספריים כירורגיים לחשוף את הלב ולחתוך חלק קטן של האטריום הימני עם מספריים כירורגית נאה.
4. מבשם העכבר עם מזרק 10 mL חד פעמיות מחדר שמאל עם PBS קר (סביב 30 mL לעכבר למבוגרים).
5. מבשם העכבר עם 4% בכיוון התנועה (כ -30 מ ל ב -10 דקות למבוגר) עד שהוא נוקשה.
6. לפתוח את הגולגולת של העכבר עם מלקחיים עצם. הסירו את המוח והכניסו לתוך 5 מ ל של 4% כלפי התחתית בצינורית צנטריפוגה של 15 מ"ל לפוסט-קיבוע ב -4 ° c.
   הערה: לנקות את האזור כירורגי לאחר הניתוח הסתיים.
7. לפחות 24 שעות מאוחר יותר, להעביר את דגימות המוח לתוך 30% סוכרוז פתרון להתייבשות מלאה ב 4 ° c.

3. בנייה מוחית

1. הטמע את דגימות המוח בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) במיכל קטן, וצנן את הטמפרטורה ב-20 ° c לפחות 1 h.
2. דגימות מוח מקטע בעובי של 20-40 יקרומטר עם מיקרוסטט קריוטום.
3. לאסוף מקטעים לתוך PBS ולאחסן ב 4 ° c.

4. מאימונולואובורנציה

1. לאסוף את הסעיפים עם אזורי המוח ממוקד ולשים אותם לתוך צלחת 24-היטב עם PBS. עבור תאים מתורבתים על מחליק, ללכת ישירות לשלב 4.2.
2. לשטוף עם PBS על שייקר בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות.. חזור על זה פעמיים
3. הסירו את ה-PBS, והתייחסו לרשימת הHCl של 1 מ' במשך 30 דקות ב-37 ° c.
   הערה: להכין הHCl 1 M על ידי הוספת 1 מ ל של חומצה הידרוכלורית (36-38%) לתוך 10 מ ל של מים בשכונה כימית. מחממים את הHCl 1 מ' בחממה ב 37 ° c.
4. שטוף את הדגימות עם ה-PBS במשך 5 דקות.. חזור על זה פעמיים
5. דגימות בלוק עם PBS המכילה 3% סרום עז רגיל 0.1% טריטון X-100 עבור 1 h על שייקר בטמפרטורת החדר.
6. לילה ב -4 ° c על שייקר.
   הערה: השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: נוגדנים מפולי-שבטיים anti-5-הידרוקסימתילציטוסין (1:5000), העכבר נוגדן מונושבטיים אנטי NeuN (1:500).
7. , תוציא את הדגימות. ועוד מודרות בטמפרטורת החדר לשעה
8. שטפו את הדגימות בערוץ הPBS במשך 10 דקות.. חזור על זה פעמיים
9. מודטה עם נוגדנים משניים המתאימים לנוגדנים העיקריים בטמפרטורת החדר עבור 1 h על שייקר. . כסו את הצלחת באלומיניום
   הערה: השתמש בנוגדנים המשניים הבאים: אלקסה Fluor 488 עז נגד ארנבת IgG (1:500), אלקסה Fluor 568 עז נגד עכבר מבוססי-IgG (1:500). גרעיני נגד כתמים עם 4 ′ -6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI).
10. רחץ את הדגימות עם PBS עבור 10 דקות על שייקר. . חזור על זה פעמיים
11. הר מקטעי המוח על השקופיות, להוסיף כמות נאותה של בינונית הרכבה antifade (סביב 100-150 μL), ולכסות עם זכוכית כיסוי פרימיום. . חותם עם לק
12. לקחת תמונות עם מיקרוסקופ רגיל או קונפוקלית וקד הקרינה.

5. דנ א גנומית בידוד

1. המתת חסד למבוגרים C57 BL/6J העכבר (זכר או נקבה) על ידי פריקה צוואר הרחם ולהסיר את המוח.
2. מנתח את ההיפוקמפוס, הקליפה ואת הרקמות המוח על צלחת מקורר קרח. טוחנים רקמות עם מטחנת רקמות ב 1 מ ל של מאגר לפירוק DNA והעברה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי. הוסף 250 μg of פרוטטינואז K לכל 600 μL של מאגר הליזה. עבור כדורי תא, ישירות להוסיף מאגר הליזה, פרוטטינואז K, ו לערבב ביסודיות.
   הערה: הכנת מאגר לפירוק ה-DNA: 5 מ"מ EDTA, 0.2% SDS, 200 mM הנאקל ב-100 mM טריס-HCl, pH 8.5. רוחצים ומקלבים את מטחנת הרקמה לפני הניסוי.
3. ביום השני, להוסיף כ 50 μg של RNase A לכל מדגם עבור לפחות 12 h ב 37 ° c.
4. הוסף נפח שווה של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (25:24:1) ולערבב לחלוטין.
5. צנטריפוגה ב 20,817 x g עבור 15 דקות, ולהסיר את supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
6. הוסף 600 μL של כלורופורם ל-supernatant כדי לזרז את ה-DNA, ולערבב היטב.
7. צנטריפוגה ב 20,817 x g עבור 15 דקות, ולהסיר את הסופרנטנט לתוך צינור חדש אחר.
8. הוסף 500 μL של איזופנול לסופרנטאנט, וערבב היטב.
9. צנטריפוגה ב 20,817 x g עבור 15 דקות, ולהסיר את supernatant לחלוטין.
10. לשטוף את המשקעים עם 1 מ ל של 70% אתנול, צנטריפוגה ב 20,817 x g עבור 1 דקות, ולהסיר את supernatant לחלוטין. . חזור על זה פעם אחת
11. . תייבש את הגלולה לגמרי
12. התמוססות את הגלולה DNA עם מאגר של Tris-HCl (pH 8.5) לריכוז הנכון.

6. כתם דנ א של נקודה

1. הכינו את הפתרונות: 2 M NaOH, מאגר Tris-HCl (pH 8.5), 6x מלוחים נתרן ציטראט (מתחת לס).
2. הפוך את הדוגמה לתערובת כטבלה 1.
3. דגימות דנ א בספרות ב 100 ° c עבור 10 דקות, ולהתקרר על קרח.
4. חותכים את הגודל המתאים של קרום ניילון (למשל, Hybond-N +) ולשטוף עם התחנה התחתית 6x.
5. לשים את הקרום על מכשיר כתמי נקודה ולהתחבר למשאבת ואקום. ספוט 6 μL של תערובת לכל נקודה על הקרום.
6. Hybridize עבור 30 דקות ב 80 ° c, ולחסום את קרום לדוגמה עם חלב ללא שומן ב מלוחים באגירה Tris (TBS) עבור 1 h.
7. דגירה עם נוגדן ראשי ב 4 ° c לילה.
   הערה: הנוגדן העיקרי הבא: ארנב רב-שבטיים אנטי-5-הידרוקסימתיל (1:5000).
8. ביום השני, מודפה את הקרומים לדוגמה בטמפרטורת החדר במשך 1 h. לשטוף עם TBS עבור 10 דקות. חזור על השטיפה. הזאת פעמיים יותר
9. דגירה את הקרום עם נוגדן אנטי ארנב משני (1:5000) עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
10. לשטוף עם TBS במשך 10 דקות. חזור על השטיפה הזאת פעמיים.
11. . ומכמת את עוצמות האות

תוצאות

כדי לחשוף את ההתפלגות של 5-hmC בהיפוקמפוס של עכברים למבוגרים, ביצעו immunofluorescence עם נוגדנים נגד תאים עצביים (NeuN) ו 5-hmC. בהיפוקמפוס, 5-hmC שיתוף מקומי היטב עם סמן תא עצבי NeuN (איור 1A-H), המציעה העשרה של 5-hmc ב נוירונים.

כדי לקבוע את הדינמיקה של 5-hmC במהלך התפתחות עצב?...

Discussion

שינויים אפיגנטיים לשחק תפקידים חיוניים במהלך התפתחות המוח, התבגרות, ותפקוד. כסמן יציב עבור שינוי DNA, דינמי 5-hmC מגיב לעיבוד התנהגותי, פעילות עצבית, והוא מתואם באופן חיובי עם ביטוי גנים; לכן, הוא מעורב בתפקוד תקין של המוח והפרעה נוירולוגית⁴. כדי לחקור את תפקידה בתאים ורקמות, יש צור...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )	Sigma-Aldrich	D8417
Adobe Photoshop software	Adobe Inc.	/
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher	A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher	A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine	Active Motif	39769
anti-NeuN	Millipore	MAB377
B27 supplement	Gibco	12587-010
B27 supplement	Gibco	12580-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
Cryostat microtome	Leica	CM1950
DMEM/F-12 medium	OmegaScientific	DM25
Epidermal growth factor	PeproTech	100-15
Fibroblast growth factor-basic	PeproTech	100-18B
Forskolin	Sigma-Aldrich	F6886
GlutaMax	Thermo	35050061
L-Glutamine	Gibco	25030-149
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Normal goat serum	Vector Laboratories	Z0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ )	Amersham Biosciences	RPN303B
OCT	Leica	14020108926
Pen Strep	Gibco	15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )	Sigma-Aldrich	516726
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899-10
Proteinase K	VVR	39450-01-6
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Triton X-100	Solarbio	T8210