Un modelo de criolesiones para estudiar el infarto de miocardio en el ratón

Resumen

Este artículo demuestra un modelo para estudiar la remodelación cardíaca después de la criolesión miocárdica en ratones.

Resumen

El uso de modelos animales es esencial para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el síndrome coronario agudo y sus complicaciones. En este artículo, demostramos un modelo de infarto de criolesión murinos que genera tamaños de infarto precisos con alta reproducibilidad y replicabilidad. En resumen, después de la intubación y la esternotomía del animal, el corazón se levanta del tórax. La sonda de un sistema de administración de nitrógeno líquido portátil se aplica sobre la pared miocárdica para inducir la criolesión. La función ventricular deteriorada y la conducción eléctrica se pueden controlar con ecocardiografía o mapeo óptico. La remodelación miocárdica transmural de la zona infartada se caracteriza por la deposición de colágeno y la pérdida de cardiomiocitos. En comparación con otros modelos (por ejemplo, LAD-ligation), este modelo utiliza un sistema de entrega de nitrógeno líquido portátil para generar tamaños de infarto más uniformes.

Introducción

El síndrome coronario agudo (SCA) es la principal causa de muerte en el mundo occidental^1,2. La oclusión aguda de las arterias coronarias conduce a la activación de la cascada isquémica y la necrosis del tejido cardíaco afectado³. El miocardio dañado se sustituye gradualmente por tejido cicatricial no contrácteo, que se manifiesta clínicamente como una insuficiencia cardíaca^4,5. A pesar de los recientes avances en el tratamiento de la SCA, la prevalencia de la insuficiencia cardíaca relacionada con la SCA y la SCA está aumentando, y las opciones terapéuticas son limitadas^6,7. Por lo tanto, el desarrollo de modelos animales para estudiar ACS y sus complicaciones son de inmenso interés.

Hasta la fecha, el modelo animal más utilizado para estudiar la remodelación miocárdica inducida por ACS y ACS es la ligadura de la arteria coronaria descendente izquierda (LAD). La ligadura del LAD conduce a la isquemia aguda del miocardio, similar al tejido miocárdico humano durante el SCA.  Sin embargo, los tamaños infartos inconsistentes siguen siendo el talón de Aquiles de la ligadura LAD. La variación quirúrgica y la variabilidad anatómica del LAD conducen a tamaños infartos inconsistentes y dificultan la reproducibilidad y replicabilidad de este procedimiento^8,9,10. Además, la ligadura laD tiene una alta mortalidad intra y postquirúrgica. A pesar de los esfuerzos recientes para mejorar la reproducibilidad y reducir la mortalidad^11,12, todavía se necesitan un gran número de animales para evaluar adecuadamente las terapias anti-remodelación.

En los últimos años se han propuesto y estudiado modelos alternativos de ACS, incluyendo radiofrecuencia^13,14 térmicas o lesiones criogénicas^15,16,17,18. Los métodos actuales de criolesiones aplican una varilla metálica preenfriada en nitrógeno líquido para dañar el tejido cardíaco del sujeto^15,16. Sin embargo, este procedimiento debe repetirse varias veces para generar un tamaño de infarto suficiente. Debido a la alta conductividad y baja capacidad de calor de la varilla en comparación con el tejido, la sonda se calienta rápidamente, y el tejido se enfría (y por lo tanto infarta) heterogéneamente. Para superar estas limitaciones, aquí describimos un modelo de crioinfarción utilizando un sistema de entrega de nitrógeno líquido de mano. Este modelo es reproducible, fácil de realizar y se puede establecer de forma rápida y fiable. Se genera una lesión infarto transmural reproducible independiente de la anatomía coronaria, que eventualmente conduce a una insuficiencia cardíaca. Este método es especialmente adecuado para estudiar el proceso de remodelación para la evaluación de nuevas estrategias terapéuticas farmacológicas y basadas en la ingeniería de tejidos.

Protocolo

Los animales recibieron atención humana de conformidad con la Guía para los Principios de los Animales de Laboratorio, preparada por el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio, y publicada por los Institutos Nacionales de Salud. Todos los protocolos de animales fueron aprobados por la autoridad local responsable (el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Francisco (UCSF).

1. Cuidado de animales

1. Obtener ratones a la edad de 14 semanas con un peso aproximado de 27 g (por ejemplo, del Instituto de Animales de Laboratorio).
   NOTA: Los ratones BALB/c se utilizan para este artículo.
2. Mantenga a los ratones en condiciones convencionales en armarios ventilados, alimentándolos con la comida estándar de ratones y agua autoclave ad libitum.

2. Preparación del ratón

1. Utilice una cámara de inducción para anestesiar el ratón con isoflurano (3,5%).
2. Retire el pelo sobre el pecho y el cuello usando una recortadora de pelo.
3. Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla calentada y mantenga la anestesia con una máscara facial que cubre la boca y la nariz del ratón.
4. Compruebe la profundidad suficiente de la anestesia pellizcando los pies traseros y la cola para verificar la ausencia de reflejos.
5. Inyectar buprenorfina subcutánea (0,03 mg/kg) para analgesia.
6. Extienda las extremidades traseras y delanteras y fije su posición con cinta adhesiva.
7. Con yodo de povidona, desinfecte la zona de afeitado, seguido de fregar con 80% de etanol. Repita este paso dos veces.
8. Usa una tijera pequeña para hacer una incisión de la piel de la línea media desde el tercio inferior del esternón hasta la barbilla.
9. Usa fórceps curvos y separa cuidadosamente los músculos alrededor del cuello para exponer la tráquea.
10. Utilice una microtijera para realizar una traqueotomía entre el segundo y el tercer anillo de cartílago.
11. Ajuste el ventilador a una frecuencia de ventilación de 110/min con un volumen de marea de 0,5 ml.
12. Retire la mascarilla e inserte una cánula de plástico (20 G), conectada al respirador, en la tráquea. Ventilar al animal.
    NOTA: Asegúrese de que la cánula de ventilación no esté demasiado profunda confirmando la ventilación pulmonar bilateral.
13. Usa cautery para separar el músculo pectoral derecho de su origen esternal entre la tercera y la séptima costilla.
14. Utilice tijeras de resorte en ángulo lateral para cortar las costillas cuarta a sexta lo más cerca posible del esternón.
15. Cauterizar la arteriamamaria, si el sangrado es visible.
16. Disminuir el isoflurano al 2,5%.
17. Diseccionar el tejido conectivo subyacente para obtener una visión clara de la cavidad torácica.
18. Use fórceps contundentes para abrir el pericardio y exponer el corazón.
19. Usa un mini retractor Goldstein para esparcir las costillas y mantener la cavidad torácica abierta.
20. Levante el corazón de la cavidad torácica con una varilla contundente.
21. Disminuir la tensión del retractor para reducir la abertura torácica y evitar que el corazón se caiga hacia atrás.
22. Preenfriar la criosonda (3 mm de diámetro) durante 10 s.
23. Aplique la criosonda en la pared anterior del ventrículo izquierdo y congele durante 10 s para generar un infarto de criolesión ventricular izquierda.
    NOTA: La criosonda se puede aplicar a diferentes paredes del corazón dependiendo de la pregunta científica y la necesidad.
24. Irrigar la criosonda con salina a temperatura ambiente para separar la sonda de la pared ventricular izquierda.
25. Utilice el retractor para agrandar la abertura torácica.
26. Devuelva suavemente el corazón a la cavidad torácica con una varilla contundente.
27. Retire el retractor y conecte la esternotomía con un solo nudo usando sutura 6-0.
28. Cierre la cavidad torácica con sutura de carrera 6-0. Utilice una jeringa de 10 ml para evacuar el aire restante del pecho antes de atar el nudo.
29. Adaptar la piel en el borde caudal y suturarla hasta el punto de la abertura traqueal con sutura de carrera (5-0).
30. Establezca isoflurano en 1,5% y espere hasta que el animal gane respiración espontánea.
31. Retire el catéter traqueal y vuelva a aplicar la mascarilla en la boca y la nariz del animal para mantener la anestesia.
32. Cierre la incisión traqueal con un 8-0 Sutura.
33. Vuelva a colocar los músculos ventrales del cuello a su posición para cubrir la tráquea.
34. Completa la sutura de la piel.
35. Añadir metamizol al agua potable (50 mg de metamizole por 100 ml) para la analgesia del dolor durante 3 días y controlar al animal diariamente.
    NOTA: El período de observación de este modelo es de 8 semanas. Asegúrese de seguir las pautas de su institución con respecto al régimen de analgesia.

Resultados

El modelo infarto de criolesiones es adecuado para estudiar ACS y sus complicaciones. En este modelo se ven bajas tasas de mortalidad y una recuperación postquirúrgica eficiente. El daño miocárdico inducido por criolesiones reduce la función cardíaca, el desacoplamiento eléctrico y la remodelación transmural.

La ecocardiografía se puede utilizar para controlar la función cardíaca no invasivamente in vivo. En los corazones criolesionados, la ecocardiografía demuestra una reducción ...

Discusión

Este artículo describe un modelo de criolesión de ratón para investigar ACS y opciones farmacológicas y terapéuticas relacionadas.

El paso más crucial es la aplicación de la criosonda en el tejido cardíaco. La duración del contacto debe estar estrechamente controlada para obtener el tamaño óptimo del infarto y garantizar resultados reproducibles. El enfriamiento prolongado del miocardio conducirá a infartos de gran tamaño o perforación ventricular. Por el contrario, el tiempo de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml Syringe	Thermo Scientific	03-377-23
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
6-0 prolene suture	Ethicon	8706H
8-0 Ethilon suture	Ethicon	2808G
Absorption Spears	Fine Science Tools	18105-01
BALB/c	The Jackson Laboratory	Stock number 000651
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment
Betadine Solution	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
Blunt Forceps	Fine Science Tools	18025-10
Buprenex	Reckitt Benckiser	NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5	Buprenorphine
Cryoprobe 3mm	Brymill Cryogenic Systems	Cry-AC-3 B-800
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Forceps curved	S&T	00284
Forceps fine	Fine Science Tools	11251-20
Forceps standard	Fine Science Tools	11023-10
Gross Anatomy Probe	Fine Science Tools	10088-15
Hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
High temperature cautery kit	Bovie	18010-00
ISOFLURANE	Henry Schein Animal Health	029405
IV Catheter 20G	B. Braun	603028
Mini-Goldstein Retractor	Fine Science Tools	17002-02
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042          Art. Nr.: 3570160	saline
Needle holder	Fine Science Tools	12075-14
Needle Holder, Curved	Harvard Apparatus	72-0146
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Operating Board	Braintree Scientific	39OP
Replaceable Fine Tip	Bovie	H101
Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Small Animal Ventilator	Kent Scientific	RV-01
Spring Scissors - Angled to Side	Fine Science Tools	15006-09
Surgical microscope	Leica	M651
Transpore Surgical Tape	3M	1527-1
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15400-12
Vaporizer	Kent Scientific	VetFlo-1205S