マウスの心筋梗塞を研究する凍結傷害モデル

要約

この記事では、マウスの心筋凍結傷害後の心臓リモデリングを研究するモデルを示す。

要約

動物モデルの使用は、急性冠症候群とその合併症の新しい治療戦略を開発するために不可欠です。本稿では、再現性と再現性の高い正確な梗塞サイズを生成するマウス凍結傷害梗塞モデルを示す。簡単に言えば、動物の挿管と立体切除の後、心臓は胸部から持ち上げられます。手持ち式液体窒素送達システムのプローブは、凍結傷害を誘発するために心筋壁に適用される。心室機能の障害と電気伝導は、心エコー検査または光学マッピングで監視することができます。梗塞領域のトランスムラール心筋リモデリングは、コラーゲン沈着および心筋細胞の喪失を特徴とする。他のモデル(例えば、LAD-ligation)と比較して、このモデルはより均一な梗塞のサイズを生成するために手持ち型液体窒素送達システムを利用する。

概要

急性冠症候群(ACS)は、西洋の^世界1、2の主要な死因である。冠状動脈の急性閉塞は、患部心臓^組織3の虚血カスケードおよび壊死の活性化につながる。損傷した心筋は徐々に非収縮性瘢痕組織に置き換えられ、これは心不^全4,5として臨床的に現れる。ACSの治療の最近の進歩にもかかわらず、ACSおよびACS関連心不全の有病率は上昇しており、治療選択肢は^{限られている6、7}である。したがって、ACSとその合併症を研究する動物モデルの開発は非常に興味深い。

現在までに、ACSおよびACS誘発心筋リモデリングを研究するために最も広く使用されている動物モデルは、左下下冠動脈(LAD)のライゲーションである。LADのライゲーションは、ACS中のヒト心筋組織と同様に、心筋の急性虚血につながる。 しかし、一貫性のない梗塞のサイズは、LADライゲーションのアキレス腱のままです。LADの外科的変動および解剖学的変動は、一貫性のない梗塞サイズを引き起こし、この手順8、9、10の再現性および複製性を妨げる。さらに、LADライゲーションは、高い内および後の外科的死亡率を有する。再現性を向上させ、死亡率^を11、12に減らす最近の努力にもかかわらず、多くの動物が反リモデリング療法を適切に評価するために依然として必要とされている。

ACSの代替モデルは、無線^{周波数13、熱14}または低温傷害15、16、17、18を含む、近年提案^され、研究されている。現在の凍結傷害法は、被験体の心臓^組織15,16を損傷するために液体窒素中で予め冷却された金属棒を適用する。しかし、十分な梗塞サイズを生成するには、この手順を数回繰り返す必要があります。組織に比べてロッドの伝導性と低熱容量が高いため、プローブは迅速に温まり、組織は不均一に冷却(したがって梗塞)されます。これらの限界を克服するために、我々は、手持ち型液体窒素送達システムを利用した凍結梗塞モデルを本明細書で説明する。このモデルは再現性、実行が容易であり、速く、確実に確立することができる。冠動脈解剖学に依存しない再現可能なトランスムラール梗塞病変が発生し、最終的には心不全を引き起こす。この方法は、新規治療薬理学および組織工学ベースの戦略の評価のための改造プロセスを研究するのに特に適している。

プロトコル

動物は、実験動物資源研究所が作成し、国立衛生研究所によって発行された実験動物の原則ガイドに従って人道的ケアを受けました。すべての動物プロトコルは、責任ある地方自治体(カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)機関動物ケアおよび使用委員会)によって承認されました。

1. 動物の世話

1. 約27gの重さの14週齢でマウスを得る(例えば、実験動物研究所から)。
   注: BALB/c マウスは、この記事に使用されます。
2. 換気キャビネットで従来の条件下でマウスを保ち、標準的なマウスチョウとオートクレーブ水アドリビタムを供給します。

2. マウスの準備

1. 誘導室を使用して、イソファラン(3.5%)でマウスを麻酔する。
2. ヘアトリマーを使用して、胸と首の上の髪を削除します。
3. 加熱されたパッドの上にマウスを置き、マウスの口と鼻を覆うフェイスマスクで麻酔を維持します。
4. 後ろ足と尾をつまんで、反射神経がないことを確認して、麻酔の十分な深さを確認してください。
5. 鎮鎮薬に皮下ブプレノルフィン(0.03mg/kg)を注入する。
6. 後肢と前肢を広げ、テープを使用して位置を固定します。
7. ポビドネヨウ素を使用して、剃毛領域を消毒し、続いて80%のエタノールでスクラブする。この手順を 2 回繰り返します。
8. 胸骨の下の3分の1から顎に中線の皮膚切開を行うには、小さなはさみを使用してください。
9. 湾曲した鉗子を使用し、慎重に気管を露出させるために首の周りの筋肉を分離します。
10. マイクロハサミを使用して、2番目と3番目の軟骨リングの間に気管切開を行います。
11. 換気器を110/minの換気周波数に設定し、潮の容積は0.5 mLです。
12. フェイスマスクを取り外し、人工呼吸器に接続されたプラスチックカニューレ(20G)を気管に挿入します。動物の換気をする。
    注:両側肺換気を確認することにより、換気カニューレがあまりにも深く挿入されていないことを確認してください。
13. 3番目と7番目の肋骨の間の胸骨起源から右胸筋を切り離すために焼灼を使用してください。
14. 側面斜めのばねはさみを使用して、胸骨にできるだけ近い4番目から6番目の肋骨をカットします。
15. 出血が見える場合は、乳房動脈を焼く。
16. イソファランを2.5%に減少させる。
17. 基礎となる結合組織を解剖し、胸腔内の明確な視野を得る。
18. 鈍い鉗子を使用して心膜を開き、心臓を露出させる。
19. ミニゴールドスタインリトラクターを使用して肋骨を広げ、胸腔を開いたままにします。
20. 鈍い棒で胸腔から心臓を持ち上げる。
21. 胸の開口部を減らし、心臓が後退するのを防ぐために、リトラクタの緊張を下げます。
22. クライオプローブ(直径3mm)を10sで予冷します。
23. 前の左心室壁に凍結プローブを適用し、10sのために凍結し、左心室凍結傷害梗塞を生成する。
    注:凍結プローブは、科学的な質問や必要性に応じて異なる心臓壁に適用することができます。
24. クライオプローブを室温生理生理で灌漑し、左心室壁からプローブを取り外します。
25. リトラクタを使用して胸の開口部を拡大します。
26. 鈍い棒で胸腔に心臓を穏やかに戻す。
27. リトラクタを取り外し、6-0縫合糸を使用して単一の結び目で立体摘出術を接続します。
28. 6-0 ランニング縫合糸を使用して胸腔を閉じます。結び目を結ぶ前に、胸から残りの空気を取り除くために10 mLの注射器を使用してください。
29. 口蓋端で皮膚を適応させ、縫合糸(5-0)で気管開口部の点まで縫合します。
30. イソファランを1.5%に設定し、動物が自発呼吸を得るまで待ちます。
31. 気管カテーテルを取り外し、麻酔を維持するために動物の口と鼻にフェイスマスクを再適用します。
32. 8-0で気管切開を閉じる縫合。
33. 気管を覆うために、腹部の首の筋肉を位置に戻します。
34. 皮膚縫合糸を完成させます。
35. 飲料水にメタミゾール(100mL当たり50mgのメタミゾール)を3日間鎮痛させ、毎日動物を監視します。
    注:このモデルの観察期間は8週間です。鎮鎮薬に関する教育機関のガイドラインに従ってください。.

結果

凍結傷害梗塞モデルは、ACSおよびその合併症を研究するのに適している。低死亡率と効率的な術後回復は、このモデルで見られます。凍結傷害誘発心筋損傷は、心臓機能の低下、電気的結合解除、およびトランスムラールの改造につながる。

心エコー検査は、生体内の心臓機能を非侵襲的に監視するために使用することができる。凍結傷を負った心臓において、心エコ?...

ディスカッション

この記事では、ACSおよび関連する薬理学的および治療的選択肢を調査するマウス凍結傷害モデルについて説明する。

最も重要なステップは、心臓組織上の凍結プローブの適用です。最適な梗塞サイズを得て、再現可能な結果を保証するために、接触時間を厳密に制御する必要があります。心筋の長時間の冷却は、特大梗塞または心室穿孔につながる。対照的に、短い冷?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml Syringe	Thermo Scientific	03-377-23
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
6-0 prolene suture	Ethicon	8706H
8-0 Ethilon suture	Ethicon	2808G
Absorption Spears	Fine Science Tools	18105-01
BALB/c	The Jackson Laboratory	Stock number 000651
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment
Betadine Solution	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
Blunt Forceps	Fine Science Tools	18025-10
Buprenex	Reckitt Benckiser	NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5	Buprenorphine
Cryoprobe 3mm	Brymill Cryogenic Systems	Cry-AC-3 B-800
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Forceps curved	S&T	00284
Forceps fine	Fine Science Tools	11251-20
Forceps standard	Fine Science Tools	11023-10
Gross Anatomy Probe	Fine Science Tools	10088-15
Hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
High temperature cautery kit	Bovie	18010-00
ISOFLURANE	Henry Schein Animal Health	029405
IV Catheter 20G	B. Braun	603028
Mini-Goldstein Retractor	Fine Science Tools	17002-02
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042          Art. Nr.: 3570160	saline
Needle holder	Fine Science Tools	12075-14
Needle Holder, Curved	Harvard Apparatus	72-0146
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Operating Board	Braintree Scientific	39OP
Replaceable Fine Tip	Bovie	H101
Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Small Animal Ventilator	Kent Scientific	RV-01
Spring Scissors - Angled to Side	Fine Science Tools	15006-09
Surgical microscope	Leica	M651
Transpore Surgical Tape	3M	1527-1
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15400-12
Vaporizer	Kent Scientific	VetFlo-1205S