研究小鼠心肌梗死的低温损伤模型

摘要

本文演示了研究小鼠心肌低温损伤后心脏重塑的模型。

摘要

使用动物模型对于开发急性冠脉综合征及其并发症的新治疗策略至关重要。在本文中，我们演示了一种鼠低温损伤梗塞模型，该模型可生成具有高可重复性和可复制性的精确梗死大小。简而言之，在动物的插管和绝育后，心脏从胸腔中抬起。将手持式液氮输送系统的探头应用到心肌壁上，引起低温损伤。受损的心室功能和电传导可以通过超声心动图或光学映射进行监测。梗塞区域的外阴心肌重塑具有胶原沉积和心肌细胞损失的特点。与其他型号（例如 LAD 结扎）相比，该模型采用手持式液氮输送系统生成更均匀的ininttt 尺寸。

引言

急性冠状动脉综合征（ACS）是西方^世界1、2的主要死因。冠状动脉的急性闭塞导致缺血级联的激活和受影响的心脏组织坏^死3。受损的心肌逐渐被非收缩性疤痕组织所取代，这在临床上表现为^{心力衰竭4，5。}尽管最近ACS的治疗取得了进展，但ACS和ACS相关心力衰竭的患病率正在上升，^{治疗方案有限。}因此，开发动物模型来研究ACS及其并发症具有极大的意义。

迄今为止，研究ACS和ACS诱导心肌重塑的最广泛使用的动物模型是左降冠状动脉（LAD）的结扎。LAD的结扎导致心肌急性缺血，类似于ACS期间的人心肌组织。 然而，不一致的梗死大小仍然是LAD结扎的致命弱点。LAD的外科变异和解剖变异导致不一致的梗死大小，并阻碍^{这个程序8，9，10}的可重复性和可复制性。此外，LAD结扎具有较高的术内和术后死亡率。尽管最近努力提高可重复性和降低^{死亡率11，12，}大量的动物仍然需要正确评估抗改造疗法。

近年已提出并研究ACS的替代模型，包括无线电^{频率13、热14}或低温损伤15、16、17、18。目前的冷冻损伤方法应用金属棒预冷却在液氮中，以损坏受试者的心脏^{组织15，16。}但是，此过程需要重复多次才能生成足够的梗死大小。由于棒材与组织相比，导电率高，热能低，探头迅速加热，组织异质冷却（从而引起梗死）。为了克服这些限制，我们在此描述了一个使用手持液氮输送系统的低温化模型。该模型可重复、易于执行，可快速可靠地建立。生成独立于冠状动脉解剖学的可重复的可重复的透明梗死病变，最终导致心脏衰竭。该方法特别适用于研究新型治疗药理学和组织工程策略评价的改造过程。

研究方案

动物根据实验室动物资源研究所编写并由国家卫生研究院出版的《实验室动物原则指南》得到人道照顾。所有动物协议都由负责的地方当局（加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物护理和使用委员会批准。

1. 动物护理

1. 在14周时获得体重约27克的小鼠（例如，从实验室动物研究所获得）。
   注: 本文使用 BALB/c 鼠标。
2. 将小鼠保存在通风柜中，喂它们标准小鼠和高压灭水。

2. 鼠标准备

1. 使用感应室用异常胶（3.5%）麻醉小鼠。
2. 使用修剪毛器去除胸部和颈部的头发。
3. 将鼠标放在加热垫上，用覆盖小鼠嘴和鼻子的面罩保持麻醉。
4. 通过捏住后脚和尾巴来验证没有反射，检查麻醉的深度是否足够。
5. 注射皮下丁丙诺啡（0.03毫克/千克）用于麻醉。
6. 展开后肢和前肢，并用胶带固定它们的位置。
7. 用波维酮碘，消毒被擦伤的区域，然后用80%的乙醇擦洗。重复此步骤两次。
8. 使用小剪刀使中线皮肤切口从胸骨的下三分之一到下巴。
9. 使用弯曲的钳子，小心地分离颈部周围的肌肉，以暴露气管。
10. 使用微剪刀在第二和第三软骨环之间进行气管切开术。
11. 将通风机设置为 110/min 的通风频率，潮汐体积为 0.5 mL。
12. 取下面罩，将连接到呼吸机的塑料管（20 G）插入气管。给动物通风。
    注:通过确认双边肺通气，确保通风管没有插入太深。
13. 使用烧灼法从第三肋骨和第七根肋骨之间的胸腔原发物分离右胸肌。
14. 使用侧角弹簧剪刀将第四至第六根肋骨切合尽可能靠近胸骨。
15. 如果出血可见，则烧灼乳腺动脉。
16. 减少至2.5%。
17. 解剖底层结缔组织，以获得进入胸腔的清晰视图。
18. 使用钝钳打开心周六并暴露心脏。
19. 使用迷你 Goldstein 缩回器将肋骨展开并保持胸腔打开。
20. 用钝棒将心脏从胸腔中抬起。
21. 降低伸缩器的张力，以减少胸部开口，防止心脏回落。
22. 预冷却低温探针（直径3毫米）10s。
23. 在前左心室壁上应用低温探针并冻结10s，产生左心室冷冻损伤梗死。
    注:根据科学问题和需要，低温探针可应用于不同的心壁。
24. 用室温盐水灌溉低温探针，将探头从左心室壁上分离。
25. 使用缩回器放大胸部开口。
26. 用钝棒轻轻地将心脏返回到胸腔。
27. 使用 6-0 缝合线取出缩回器，并用单个结连接子宫切除术。
28. 使用 6-0 跑步缝合线关闭胸腔。在打结之前，使用 10 mL 注射器从胸部排出任何剩余空气。
29. 调整皮肤在乳管边缘，并缝合到气管开口与运行缝合（5-0） 点。
30. 将异二苯设置为 1.5%，并等待动物获得自发呼吸。
31. 取出气管导管，将面罩重新涂抹在动物嘴和鼻子上以保持麻醉。
32. 用一个 8-0 关闭气管切口缝合。
33. 将腹腔颈部肌肉重新定位回其位置以覆盖气管。
34. 完成皮肤缝合。
35. 在饮用水中加入甲酰氨基苯甲酸酯（每100 mL50毫克甲氨酰胺），用于疼痛性麻醉3天，并每天监测动物。
    注: 此模型的观察期为 8 周。请务必遵循您所在机构有关麻醉妊娠方案的指南。

结果

低温损伤梗塞模型适用于ACS及其并发症的研究。低死亡率和高效的术后恢复见于此模型。冷冻损伤诱发心肌损伤导致心脏功能降低、电气脱钩和跨体重塑。

回声心动图可用于监测心脏功能在体内非侵入性。在冷冻受伤的心脏中，超声心动图显示射射分数和分数面积变化显著减少（图1a-c）。功能损伤从手术后第7天一直持续到56天的观察终点?...

讨论

本文介绍了一种小鼠冷冻损伤模型，以研究ACS及相关的药理学和治疗方案。

最关键的一步是冷冻探针在心脏组织上的应用。必须严格控制接触持续时间，以获得最佳梗死尺寸并保证可重现的结果。心肌长时间冷却会导致超大的梗死或心室穿孔。相反，缩短的冷却时间会产生有限的表皮病变，并且不会消除所有驻留细胞。因此，在研究再生细胞移植时，这可能令人困惑。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml Syringe	Thermo Scientific	03-377-23
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
6-0 prolene suture	Ethicon	8706H
8-0 Ethilon suture	Ethicon	2808G
Absorption Spears	Fine Science Tools	18105-01
BALB/c	The Jackson Laboratory	Stock number 000651
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment
Betadine Solution	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
Blunt Forceps	Fine Science Tools	18025-10
Buprenex	Reckitt Benckiser	NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5	Buprenorphine
Cryoprobe 3mm	Brymill Cryogenic Systems	Cry-AC-3 B-800
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Forceps curved	S&T	00284
Forceps fine	Fine Science Tools	11251-20
Forceps standard	Fine Science Tools	11023-10
Gross Anatomy Probe	Fine Science Tools	10088-15
Hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
High temperature cautery kit	Bovie	18010-00
ISOFLURANE	Henry Schein Animal Health	029405
IV Catheter 20G	B. Braun	603028
Mini-Goldstein Retractor	Fine Science Tools	17002-02
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042          Art. Nr.: 3570160	saline
Needle holder	Fine Science Tools	12075-14
Needle Holder, Curved	Harvard Apparatus	72-0146
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Operating Board	Braintree Scientific	39OP
Replaceable Fine Tip	Bovie	H101
Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Small Animal Ventilator	Kent Scientific	RV-01
Spring Scissors - Angled to Side	Fine Science Tools	15006-09
Surgical microscope	Leica	M651
Transpore Surgical Tape	3M	1527-1
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15400-12
Vaporizer	Kent Scientific	VetFlo-1205S