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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Hemos demostrado que el grabado de nanoarquitectura en dispositivos de microelectrodos intracorticales puede reducir la respuesta inflamatoria y tiene el potencial de mejorar las grabaciones electrofisiológicas. Los métodos descritos aquí describen un enfoque de nanoarquitecturas de etch en la superficie de microelectrodos intracorticales de silicio de vástago único no funcionales y funcionales.

Resumen

Con los avances en electrónica y tecnología de fabricación, los microelectrodos intracorticales han experimentado mejoras sustanciales que permiten la producción de sofisticados microelectrodos con mayor resolución y capacidades ampliadas. El progreso en la tecnología de fabricación ha apoyado el desarrollo de electrodos biomiméticos, que tienen como objetivo integrarse perfectamente en el parénquima cerebral, reducir la respuesta neuroinflamatoria observada después de la inserción del electrodo y mejorar la calidad y longevidad de las grabaciones electrofisiológicas. Aquí describimos un protocolo para emplear un enfoque biomimético recientemente clasificado como nano-arquitectura. El uso de litografía de haz iónico focalizado (FIB) se utilizó en este protocolo para grabar características de nanoarquitectura específicas en la superficie de microelectrodos intracorticales de vástago único no funcionales y funcionales. La entrada en nanoarquitecturas en la superficie del electrodo indicó posibles mejoras de biocompatibilidad y funcionalidad del dispositivo implantado. Uno de los beneficios de utilizar FIB es la capacidad de grabar en dispositivos fabricados, a diferencia de durante la fabricación del dispositivo, facilitando posibilidades ilimitadas para modificar numerosos dispositivos médicos post-fabricación. El protocolo presentado en este documento se puede optimizar para varios tipos de materiales, características de nanoarquitectura y tipos de dispositivos. Aumentar la superficie de los dispositivos médicos implantados puede mejorar el rendimiento del dispositivo y la integración en el tejido.

Introducción

Los microelectrodos intracorticales (IME) son electrodos invasivos que proporcionan un medio de interconexión directa entre los dispositivos externos y las poblaciones neuronales dentro de la corteza cerebral1,2. Esta tecnología es una herramienta invaluable para registrar potenciales de acción neuronal para mejorar la capacidad de los científicos para explorar la función neuronal, avanzar en la comprensión de las enfermedades neurológicas y desarrollar terapias potenciales. El microelectrodo intracortical, utilizado como parte de los sistemas de interfaz de máquina cerebral (IMC), permite registrar potenciales de acción de un individuo o pequeños grupos de neuronas para detectar intenciones motoras que se pueden utilizar para producir salidas funcionales3. De hecho, los sistemas de IMC se han utilizado con éxito con fines protésicos y terapéuticos, como el control del ritmo sensorimotor adquirido para operar un cursor informático en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA)4 y lesiones de la médula espinal5 y restaurar el movimiento en personas que sufren de tetraplejia crónica6.

Desafortunadamente, los IME a menudo no graban consistentemente con el tiempo debido a varios modos de falla que incluyen factores mecánicos, biológicos y materiales7,8. La respuesta neuroinflamatoria que se produce después de la implantación del electrodo se cree que es un reto considerable que contribuye a la falla del electrodo9,10,11,12,13,14. La respuesta neuroinflamatoria se inicia durante la inserción inicial del IME que corta la barrera hematoencefálica, daña el parénquima cerebral local y interrumpe las redes gliales y neuronales15,16. Esta respuesta aguda se caracteriza por la activación de células gliales (microglia/macrofagos y astrocitos), que liberan moléculas proinflamatorias y neurotóxicas alrededor del sitio del implante17,18,19,20. La activación crónica de las células gliales da lugar a una reacción del cuerpo extraño caracterizada por la formación de una cicatriz glial aislando el electrodo del tejido cerebral sano7,9,12,13,17,21,22. En última instancia, dificultando la capacidad del electrodo para registrar potenciales de acción neuronal, debido a la barrera física entre el electrodo y las neuronas y la degeneración y muerte de las neuronas23,24,25.

El fracaso temprano de los microelectrodos intracorticales ha llevado a cabo una considerable investigación en el desarrollo de electrodos de próxima generación, con énfasis en las estrategias biomiméticas26,27,28,29,30. De particular interés para el protocolo descrito aquí, es el uso de la nanoarquitectura como una clase de alteraciones biomiméticas de la superficie paraiME 31. Se ha establecido que las superficies que imitan la arquitectura del entorno natural in vivo tienen una respuesta biocompatible mejorada32,33,34,35,36. Por lo tanto, la hipótesis que obliga a este protocolo es que la discontinuidad entre la arquitectura áspera del tejido cerebral y la arquitectura lisa de los microelectrodos intracorticales puede contribuir a la respuesta neuroinflamatoria y crónica del cuerpo extraño a las IME implantadas (para una revisión completa se refieren a Kim et al.31). Hemos demostrado anteriormente que la utilización de características de nanoarquitectura similares a la arquitectura de matriz extracelular del cerebro reduce los marcadores inflamatorios de astrocitos de células cultivadas en sustratos nano-arquitecturados, en comparación con las superficies de control planas en modelos in vitro y ex vivo de neuroinflamación37,38. Además, hemos demostrado la aplicación de litografía de haz iónico focalizado (FIB) a nanoarquitecturas de grabado directamente en sondas de silicio dio lugar a un aumento significativo de la viabilidad neuronal y una menor expresión de genes proinflamatorios de animales implantados con las sondas de nanoarquitectura en comparación con el grupo de control suave26. Por lo tanto, el propósito del protocolo presentado aquí es describir el uso de la litografía FIB para grabar nanoarquitecturas en dispositivos de microelectrodos intracorticales fabricados. Este protocolo fue diseñado para grabar características de tamaño nano-arquitectura en superficies de silicio de vástagos de microelectrodos intracorticales utilizando procesos automatizados y manuales. Estos métodos son sencillos, reproducibles y, sin duda, se pueden optimizar para diversos materiales de dispositivos y tamaños de características deseados.

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Protocolo

NOTA: Realice los siguientes pasos mientras usa el equipo de protección personal adecuado, como una capa de laboratorio y guantes.

1. Montaje de la sonda de silicio no funcional para la litografía del haz de iones focalizado (FIB)

NOTA: Para el procedimiento completo que describe la fabricación de la oblea SOI con las 1.000 sondas, consulte Ereifej et al.39.

  1. Aísle una tira de 2-3 sondas de silicio del silicio en la oblea aislante (SOI) que contiene 1.000 sondas. No haga tiras que contengan más de tres sondas de silicio. Esto puede aumentar las posibilidades de un montaje suelto y puede causar una desalineación, lo que puede provocar que la FIB se conste incorrectamente.
    NOTA: Las tiras/sondas que no estén firmemente sentadas en el talón de aluminio pueden causar dos complicaciones: 1) cuando el escenario se mueve para trabajar en la siguiente sección, habrá vibraciones y el fresado no será preciso hasta que la sonda se asiente y 2) puede causar una alta variación y estar fuera del plano de enfoque.
    1. Mientras usa guantes, utilice fórceps finos para poner presión alrededor de las sondas para romper una pequeña sección que contiene de dos a tres sondas.
  2. Limpie cuidadosamente la sonda de silicio de todo el polvo y los residuos antes del grabado de la FIB. Preparar una placa de poliestireno de 6 pocillos pipeteando 3 ml/pozo de etanol al 95% en tres pozos.
    1. Recoja cuidadosamente la tira cortada de las sondas de silicio usando punta fina o fórceps de vacío y colóquela en el colador de la célula. Coloque sólo una tira de sondas de silicio por colador para evitar que se rompan las sondas. Coloque el colador que contiene la tira de sondas de silicio en el primer pozo que contiene 95% de etanol para la limpieza. Mantenga el colador en el primer pozo durante 5 minutos.
    2. Mueva el colador que contiene las sondas de silicio del primer pozo y colóquelo en el segundo pozo que contenga 95% de etanol durante otros 5 minutos. Repetir una vez más en el tercer pozo.
    3. Coloque el colador que contiene las sondas de silicio limpias en una placa de politetrafluoroetileno para secarse al aire. Realice este paso en una campana estéril para evitar la contaminación por el polvo.
  3. Coloque la tira seca por aire de las sondas de silicio en un contenedor sellado para su transporte al SEM-FIB. Envuelva el colador que contiene las muestras secas al aire con una envoltura de plástico o papel de aluminio para su transporte y/o almacenamiento para mantener la limpieza.
  4. Utilice fórceps de punta fina o fórceps de vacío para recoger cuidadosamente la tira limpia de sondas de silicio y colocarlas en un talón de aluminio limpio (utilizado para imágenes/grabados SEM-FIB) para prepararse para el montaje.
  5. Utilice un palillo de dientes (u otro instrumento de punta fina como un alambre eléctrico delgado), para colocar una pequeña gota (-10 l) de pintura plateada en el borde del sustrato de silicio que rodea las sondas. Asegure la tira extendiendo la pintura plateada alrededor de los lados del sustrato de silicio que rodea la sonda. Deje que la pintura plateada se seque completamente antes de colocar el talón de aluminio en el SEM-FIB.
    NOTA: Tenga cuidado de no obtener pintura plateada en el vástago del electrodo porque esa es la parte que se grabará. Si la tira de sondas no está anclada de forma segura al talón de aluminio, la tira puede moverse durante el procesamiento o tener un plano focal diferente, lo que resulta en un fresado incorrecto por parte de la FIB. Varias tiras de sondas de silicio se pueden montar en el mismo talón de aluminio, asegurándose de que hay un amplio espacio entre las tiras para permitir la eliminación del talón después del grabado. Esto permitirá un grabado más eficiente de múltiples sondas utilizando la función automatizada que se describe a continuación.

2. Alineación de la FIB con las sondas de silicio

  1. Haga clic en el botón de ventilación en la pestaña de control de haz para ventilar la cámara. Pulse Mayús+F3 para realizar la etapa de inicio. Confirme la selección seleccionando el botón Etapa de inicio en la ventana emergente.
    NOTA: Ejecutar la operación de la etapa doméstica es un paso preventivo para garantizar que el software lea correctamente el eje del escenario y que el microscopio esté en buenas condiciones.
  2. Una vez completada la etapa de inicio, mueva el escenario a las coordenadas de X a 70 mm, Y a 70 mm, Z a 0 mm, T a 0o, R a 0o. Una vez ventilada la cámara, ponte guantes de nitrilo limpios y abre la puerta de la cámara.
    NOTA: Dependiendo de la aplicación del usuario anterior, puede ser necesario cambiar el adaptador de etapa. Los adaptadores de etapa estándar (por ejemplo, estilo FEI) se pueden quitar desenroscando el perno central en sentido antihorario e instalados atornillando en el sentido de las agujas del reloj en la placa de rotación de la etapa.
  3. Inserte el talón de aluminio que sujeta las sondas en la parte superior del adaptador de escenario. Fije el talón de aluminio apretando el tornillo de ajuste en el lado del adaptador de escenario. Utilice la llave hexagonal de 1,5 mm para esta tarea.
  4. Ajuste la altura del adaptador de escenario girando el adaptador en el sentido de las agujas del reloj para bajarlo o en sentido contrario a las agujas del reloj para elevarlo. Fije el adaptador de etapa a la placa de rotación girando la tuerca del cono de bloqueo en el sentido de las agujas del reloj hasta que la tuerca esté asegurada contra la placa de rotación del escenario. Sujete el adaptador de escenario con la otra mano para evitar la rotación del adaptador y las muestras mientras aprieta la tuerca del cono de bloqueo.
    NOTA: Utilice el medidor de altura proporcionado para determinar la altura adecuada. La parte superior del talón de aluminio debe tener la misma altura que la línea máxima que se muestra en el medidor de altura. Sobre apretar la tuerca del cono puede causar daños en el escenario y el adaptador. Utilice sólo la fuerza suficiente para asegurar las muestras.
  5. Adquiera una imagen de cámara de navegación. Gire con cuidado el brazo de la cámara de navegación abierto hasta que se detenga. La etapa del microscopio se moverá automáticamente a una posición debajo de la cámara. Vea la imagen en vivo que se muestra en el cuadrante 3 de la interfaz de usuario (UI) del microscopio.
    1. Una vez que el nivel de brillo se ajusta automáticamente a un nivel adecuado, adquiera la imagen presionando el botón hacia abajo en el soporte de la cámara. Asegúrese de esperar a que finalice toda la adquisición de la imagen, que se indica mediante un símbolo de pausa que aparece en el cuadrante 3 y la iluminación de la cámara apagada. Esto toma aproximadamente 10 s. Gire el brazo de la cámara de nuevo a la posición cerrada. La etapa volverá a la posición original.
  6. Cierre con cuidado la puerta de la cámara del microscopio. Vea la imagen de la cámara CCD en el cuadrante 4 mientras cierra la puerta. Asegúrese de que las muestras y el escenario estén a una distancia segura de cualquier componente crítico de la cámara del microscopio.
  7. Seleccione la flecha hacia abajo junto al botón Bomba en la pestaña de control de haz. Asegúrese de que la puerta esté sellada empujando suavemente la cara de la puerta mientras la bomba está en marcha. Espere aproximadamente 8 minutos para el tiempo de bombeo y el ciclo de limpieza de plasma para que la cámara del microscopio se complete.
    NOTA: Un sello de vacío se puede confirmar tirando suavemente de la puerta de la cámara, que debe permanecer cerrada si el sistema está bajo vacío.
  8. Una vez que el icono en la esquina inferior derecha de la interfaz de usuario se vuelve verde, presione el botón De activación en la pestaña de control de haz que enciende los haces de electrones e iones. Seleccione el cuadrante 1 y establezca la señal de haz en haz de electrones (si no se ha establecido ya), establezca el cuadrante 2 en el haz iónico (si aún no se ha establecido).
    1. Ajuste la tensión SEM a 5 kV, ajuste la corriente del haz SEM a 0,20 nA, establezca el detector SEM en ETD, ajuste el modo de detector a Electron secundario. Ajuste la tensión FIB a 30 kV, ajuste la corriente del haz FIB a 24 pA, ajuste el detector FIB al detector ICE, ajuste el modo de detector al electrón secundario.
  9. Haga doble clic en la sonda de silicio en la imagen de la cámara de navegación, cuadrante 3 para mover el escenario a la ubicación aproximada de la sonda. Haga clic en el cuadrante 1 para seleccionarlo como el cuadrante activo y pulse el botón de pausa para iniciar el escaneo SEM. Establezca el tiempo de permanencia del escaneado en 300 ns y desactive el entrelazadode escaneado, la integraciónde líneas y el promedio de fotogramas. Establezca la rotación de escaneado en 0 en la pestaña de control de viga y haga clic con el botón derecho en el ajustador 2d de desplazamiento de viga y seleccione cero.
  10. Ajuste el aumento al valor mínimo girando la perilla de ampliación en sentido antihorario en el panel MUI. Ajuste el brillo y el contraste de la imagen con los mandos del panel MUI o en el icono de la barra de herramientas Brillo de contraste automático.
  11. Mueva el escenario haciendo doble clic izquierdo en el ratón sobre una entidad para centrarla, o presionando hacia abajo la rueda del ratón y activando el modo de ratón joystick. Mueva la sonda de silicio deseada para ser modelada en el centro de la imagen SEM.
  12. Localice una arista u otras características, como una partícula de polvo o un rasguño. Aumente la ampliación a 2.000x girando la perilla de ampliación en el sentido de las agujas del reloj. Ajuste el enfoque del SEM girando las perillas de enfoque gruesas y finas de la MUI hasta que la imagen esté enfocada. Una vez que la imagen esté enfocada, seleccione el botón Vincular muestra Z a distancia de trabajo en la barra de herramientas.
  13. Confirme que la operación se completó examinando la coordenada del eje Z en la pestaña de navegación. El valor debe ser de aproximadamente 11 mm. Escriba en 4,0 mm en la posición del eje Z y presione el botón Ir a con el ratón o presione la tecla Intro en el teclado y el escenario se moverá a una distancia de trabajo de 4 mm.
  14. Mueva la etapa en X e Y para localizar el hombro de la sonda de silicio. Colóquelo lo más cerca posible del centro del SEM. Cambie la inclinación del escenario a 52o escribiendo "52" en la coordenada T y pulsando enter. Observe si el hombro de la sonda parece moverse hacia arriba o hacia abajo en la imagen. Utilice el control deslizante Etapa Z para devolver el hombro de la sonda al centro de la imagen SEM. Sólo ajuste la posición Z, no mueva los ejes X, Y, T o R.
  15. Ejecute el comando integrado "xT Align Feature" ubicado en el menú desplegable del escenario. Utilice el ratón para hacer clic en dos puntos paralelos al borde de la sonda. Asegúrese de que el botón de opción horizontal esté seleccionado en la ventana emergente y haga clic en Finalizar. La etapa girará para alinear la sonda con el eje X de la etapa. Ajuste el escenario en X,Y usando el ratón para poner el hombro inferior de la sonda en el centro de la imagen SEM de nuevo.
    NOTA: El primer punto debe ser hacia el agarre de la sonda y el segundo punto debe ser hacia el punto de la sonda.
  16. Seleccione la BOLA en el cuadrante 2 y asegúrese de que la corriente de la viga sigue siendo 24 pA. Establezca el aumento en 5.000x y el tiempo de permanencia en 100 ns. Escriba Ctrl-F en el teclado para establecer el foco FIB en 13,0 mm. En la pestaña de control de viga, haga clic con el botón derecho en el ajustador 2d del estigma y seleccione cero y, también, haga clic con el botón derecho en el Ajustador 2d de Beam Shift y seleccione cero. Establezca la rotación de escaneado en 0o y pulse el botón de brillo de contraste automático en la barra de herramientas.
  17. Busque una imagen del hombro de la sonda en el cuadrante 2. Utilice la herramienta de instantáneas para adquirir una imagen con la FIB. Confirme que el hombro de la sonda está en el centro de la imagen FIB, si no, haga doble clic en el hombro de la sonda para moverlo al centro. Mueva el escenario hacia la izquierda presionando la tecla de flecha izquierda en el teclado aproximadamente 10-15 veces. Tome otra instantánea y observe si el lado de la sonda todavía está en el centro de la BOLA.
    NOTA: Si no es así, la rotación de la etapa debe ajustarse ligeramente. Si la sonda está por encima del centro de la imagen, el escenario debe girarse en la dirección negativa. Si la sonda está por debajo del centro, el escenario debe girarse en el sentido de las agujas del reloj. Introduzca una rotación compucéntrica relativa de 0,01 a 0,2 grados, dependiendo de la forma en que sea necesario para alinear la sonda.
  18. Repita los pasos 2.16 a 2.17 tantas veces como sea necesario hasta que el borde del hombro de la sonda esté perfectamente alineado con el eje X del escenario, (el borde permanece en el centro de la BOLA mientras se mueve a la izquierda).
  19. Con la FIB, mueva el escenario de nuevo al hombro inferior de la sonda. Guarde la posición del escenario en la lista de posiciones haciendo clic en el botón Agregar. Cambie la corriente de la viga FIB a 2.5 nA y asegúrese de que la ampliación de la BOLA es todavía 5000x. Ejecute la función de contraste de brillo automático y ajuste el tiempo de permanencia de la BOLA a 100 ns.
  20. Pulse el botón de pausa para iniciar el escaneo. Ajuste el enfoque y el astigmatismo de la FIB, de la forma más rápida y precisa posible, utilizando las perillas de enfoque grueso y fino, y las perillas del estigma X e Y en el panel MUI. Pulse el botón de pausa para detener el escaneo de la FIB.

3. Escribir un proceso automatizado para el grabado

  1. Inicie el software localizándolo en el menú de inicio de Windows (es decir, Inicio, Programas, Empresa FEI, Aplicaciones, Nanobuilder). Coloque la ventana de software en el monitor lateral para que la interfaz de usuario no esté cubierta. Abra el archivo para el patrón de las sondas de silicio haciendo clic en el archivo y, a continuación, abra . Dirija el navegador de Windows a la ubicación del script de software(Archivo complementario 1 - el nombre del archivo es "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.jbj").
  2. En el software, seleccione el menú desplegable del microscopio y seleccione Establecer origen de etapa. En el software, seleccione el menú desplegable del microscopio y, a continuación, seleccione Calibrar detectores.
  3. En la interfaz de usuario del microscopio, haga clic en Quad 1 una vez con el ratón para seleccionar Quad 1. Ignore las otras instrucciones que se muestran en la ventana emergente, no son necesarias para este proyecto. Haga clic en Aceptar para iniciar la calibración. El proceso tomará alrededor de 5 minutos. Asegúrese de que los detectores ETD y ICE se calibran. Está bien si cualquier otro detector tiene fallas de calibración.
  4. En el software, seleccione el menú desplegable del microscopio y elija Ejecutar para iniciar la secuencia de patrones. Cuando el patrón esté completo, cierre el software.
    NOTA: El software se hará cargo de los quads 3 y 4 para las funciones de patrón y alineación. El script tardará aproximadamente 12 h en ejecutarse. Mientras se ejecuta el script, no cambie ningún parámetro en el microscopio.
  5. Pulse "Vent" en la pestaña de control del haz de la interfaz de usuario del microscopio para apagar los haces del microscopio e iniciar el ciclo de ventilación. Mientras la cámara se está ventilando, mueva el escenario para coordinar X a 70 mm, Y a 70 mm, Z a 0 mm, T a 0o, R a 0o. Una vez ventilada la cámara, ponte guantes de nitrilo limpios y abre la puerta de la cámara.
  6. Afloje el tornillo de fijación del adaptador de talón con la llave hexagonal de 1,5 mm. Retire el talón de aluminio que contiene la sonda estampada de la cámara. Cierre con cuidado la puerta de la cámara del microscopio. Vea la imagen de la cámara CCD en el cuadrante 4 mientras cierra la puerta. Asegúrese de que el adaptador de etapa esté a una distancia segura de cualquier componente crítico de la cámara del microscopio.
  7. Seleccione la flecha hacia abajo junto al botón Bomba en la pestaña de control de haz. Asegúrese de que la puerta esté sellada empujando suavemente la cara de la puerta mientras la bomba está en marcha.
    NOTA: Un sello de vacío se puede confirmar tirando suavemente de la puerta de la cámara, que debe permanecer cerrada si el sistema está bajo vacío. El tiempo de bombeo será de aproximadamente 5 min. Solo se puede grabar un lado de la sonda durante una sola ejecución.
  8. Si la parte delantera y trasera de la sonda requiere aguafuerte, retire cuidadosamente la tira grabada de sondas de silicio después de comprobar el grabado final y la imagen del lado frontal (si se necesitan imágenes). Disolver la pintura plateada con acetona, delicadamente dabbing / cepillado de la acetona en la pintura de plata. Gire con cuidado la tira hacia atrás, vuelva a montarla, alinee y etch siguiendo los pasos descritos anteriormente.

4. Comprobación del etch final y las imágenes

  1. Una vez completado el fresado, verifique la uniformidad de las diferentes secciones utilizando imágenes SEM con un aumento más alto.
    NOTA: La imagen en el ángulo inclinado permite una mejor evaluación de la variación en la profundidad de fresado. Se debe prestar especial atención a las regiones de transición entre las ubicaciones de fresado.
  2. Vuelva a tomar una imagen de las muestras después de fresarlas con un microscopio óptico.
    NOTA: Las líneas fresadas periódicas dan como resultado un efecto de refracción que da lugar a diferentes colores en función del ángulo de imagen. Si el color no es continuo junto con la sonda que es una clara indicación de la interrupción en las líneas fresadas.

5. Montaje de una sonda de silicio funcional para el grabado FIB

  1. Retire suavemente el electrodo de silicio funcional de su embalaje. Utilice fórceps para levantar cuidadosamente la pestaña protectora de plástico que cubre la etapa de la cabeza. Comience a levantar una esquina de la pestaña hacia arriba del pegamento pegajoso que lo mantiene en su lugar y siga levantando hasta que se retire todo el electrodo.
  2. Sujete cuidadosamente el electrodo con hemostats para prepararse para el montaje en el marco estereotaxico. Mientras sostiene la pestaña cubierta con los fórceps, coloque suavemente hemostats curvos alrededor del eje verde por encima del vástago de silicio, con la parte curva da la cara de los hemostats hacia arriba hacia la pestaña. los hemostats.
  3. Retire suavemente la pestaña protectora de plástico que cubre la etapa de la cabeza. Mientras sostiene el electrodo con los hemostats, sujete cuidadosamente el electrodo en el marco estereotaxico para su limpieza.
  4. Llenar 3 platos de Petri con 95% de etanol (10 ml por plato de petri). Coloque la placa Petri debajo del electrodo que se monta en el marco estereotaxico para su limpieza. Baje lentamente el electrodo girando el micromanipulador hacia abajo (100 m/s) para que el vástago se sumerde en el etanol del 95%.
    NOTA: Tenga cuidado de no girar el micromanipulador demasiado rápido o demasiado profundo, esto puede hacer que el electrodo se rompa (es decir, el electrodo no debe tocar la placa Petri).
  5. Deje el mango del electrodo en el etanol del 95% durante 5 minutos, y luego levante lentamente el electrodo del etanol del 95% girando el micromanipulador hacia arriba (100 m/s). Repita este paso dos veces más, para un total de tres lavados. Deje que el electrodo se seque al aire durante cinco minutos.
  6. Utilice la misma técnica para montar el electrodo en el marco estereotaxico, para eliminar el electrodo del marco estereotaxico. Coloque cuidadosamente los hemostats alrededor del eje del electrodo. Una vez que los hemostats estén apretados, suelte el electrodo del marco estereotaxico, devuelva la pestaña protectora de plástico que cubre la etapa de la cabeza y vuelva a colocar el electrodo limpio en su embalaje.

6. Sonda de silicio funcional de grabado con FIB

  1. Monte el electrodo de silicio funcional limpiado en un soporte de aluminio. Recoja cuidadosamente el electrodo de silicio funcional limpiado usando fórceps y retire la pestaña protectora del escenario. Coloque el vástago del electrodo en el talón de aluminio para que no cuelgue sobre ningún borde, luego usando una pequeña pieza de Cu o cinta conductora de carbono, fija el escenario firmemente al talón de aluminio.
    NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un soporte de clip de bajo perfil para mantener el electrodo hacia abajo. Tenga cuidado de no tocar el vástago del electrodo.
  2. Siguiendo los pasos descritos anteriormente (Sección 2), coloque el electrodo a la altura eucéntrica y asegúrese de que el electrodo está en el punto de coincidencia de los haces SEM y FIB. Alinee el vástago con la dirección "X" del escenario.
  3. Fije la FIB a la corriente óptima para fresar la nanoarquitectura requerida y asegúrese de que el enfoque y la estigmas se corrijan correctamente. Prepare una matriz de líneas con el espaciado y la longitud deseados para cubrir el campo de visión del vástago (secciones de 500 m). Ajuste las longitudes de línea a medida que el grabado baja el vástago hasta las secciones más delgadas.
    NOTA: Al grabar el electrodo funcional, no es posible añadir marcas fiduciales para automatizar el proceso. Por lo tanto, el movimiento entre las subsecciones (500 m) se realiza manualmente.
  4. Una vez completado el fresado de la primera sección, asegúrese de comprobar la calidad del fresado antes de pasar a la siguiente sección. Repita el paso 6.3 para grabar la siguiente sección del vástago. Alinee las líneas fresadas de la sección anterior con los patrones utilizados para la siguiente sección para evitar grandes separaciones entre corridas.

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Resultados

FIB Grabado Nano-arquitectura en las superficies de las sondas intracorticales de un solo vástago
Utilizando los métodos descritos aquí, las sondas intracorticales fueron grabadas con nanoarquitecturas específicas siguiendo los protocolos establecidos39. Las dimensiones y la forma del diseño de nanoarquitectura descrito en estos métodos se implementaron a partir de resultados in vitro anteriores que representan una disminución en la reactividad de las células gliales cu...

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Discusión

El protocolo de fabricación descrito aquí utiliza litografía de haz iónico focalizado para grabar de manera efectiva y reproducible nanoarquitecturas en la superficie de microelectrodos de silicio de un solo vástago no funcionales y funcionales. La litografía de haz iónico focalizado (FIB) permite la ablación selectiva de la superficie del sustrato mediante el uso de un haz de iones finamente enfocado50,51. FIB es una técnica de escritura directa que pue...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por los premios del Servicio de Investigación y Desarrollo de Rehabilitación de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos (EE.UU.): #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) y #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). El contenido no representa las opiniones del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos ni del Gobierno de los Estados Unidos. Los autores desean agradecer a FEI Co. (Ahora parte de Thermofisher Scientific) por la asistencia del personal y el uso de la instrumentación, que ayudó en el desarrollo de los guiones utilizados en esta investigación.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
16-Channel ZIF-Clip HeadstageTucker Davis TechnologiesZC16The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
1-meter cable, ALL spring wrappedThomas Scientific1213F04Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture
32-Channel ZIF-Clip Headstage HolderTucker Davis TechnologiesZ-ROD32The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30mlTed Pella16023https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
Baby-Mixter HemostatFine Science Tools13013-14Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat
Carbon Conductive Tape, Double CoatedTed Pella16084-7The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm
Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 wellSigma AldrichCLS3736-100EAAny non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/
Dumont #5 Fine ForcepsFine Science Tools11251-30Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30
Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon LabsFisher Scientific22-032-600Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600
Falcon Cell StrainerFisher Scientific08-771-1https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mmTed Pella16148Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180
Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge rollFisher Scientific01-213-101Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250
Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating DishesFisher Scientific02-617-149Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552
Michigan-style silicon functional electrodeNeuroNexusA1x16-3mm-100-177http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/
Model 1772 Universal holderKOPFModel 1772Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Model 900-U Small Animal Stereotaxic InstrumentKOPFModel 900-UOther stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/
Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide AssemblyKOPFModel 960Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250')Ted Pella807-5https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm
PELCO Vacuum Pick-Up System, 220VTed Pella520-1-220Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520
PELCO Conductive Silver PaintTed Pella16062https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
SEM FIB FEI Helios 650 NanolabThermo Fisher ScientificHelios G2 650This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/

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