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Resumo

Mostramos que a gravura da nanoarquitetura em dispositivos de microeletrodo intracortical pode reduzir a resposta inflamatória e tem o potencial de melhorar as gravações eletrofisiológicas. Os métodos descritos aqui descrevem uma abordagem para gravar nano-arquiteturas na superfície de microeletrodos intracortical de silício de haste única não funcionais e funcionais.

Resumo

Com os avanços na eletrônica e na tecnologia de fabricação, os microeletrodos intracortical passaram por melhorias substanciais que permitem a produção de microeletrodos sofisticados com maior resolução e capacidades ampliadas. O progresso na tecnologia de fabricação tem apoiado o desenvolvimento de eletrodos biomiméticos, que visam integrar-se perfeitamente no parenchyma cerebral, reduzir a resposta neuroinflamatória observada após a inserção de eletrodos e melhorar a qualidade e longevidade das gravações eletrofisiológicas. Aqui descrevemos um protocolo para empregar uma abordagem biomimética recentemente classificada como nanoarquitetura. O uso de litografia de feixe de íons focados (FIB) foi utilizado neste protocolo para gravar características específicas da nanoarquitetura na superfície de microeletrodos intracortical de pernil único não funcionais e funcionais. A gravura nanoarquiteturas na superfície do eletrodo indicou possíveis melhorias da biocompatibilidade e funcionalidade do dispositivo implantado. Um dos benefícios do uso do FIB é a capacidade de gravar em dispositivos manufaturados, ao contrário durante a fabricação do dispositivo, facilitando possibilidades ilimitadas de modificar inúmeros dispositivos médicos pós-fabricação. O protocolo aqui apresentado pode ser otimizado para vários tipos de materiais, recursos de nanoarquitetura e tipos de dispositivos. Aumentar a superfície dos dispositivos médicos implantados pode melhorar o desempenho do dispositivo e a integração no tecido.

Introdução

Microeletrodos Intracortical (IME) são eletrodos invasivos que fornecem um meio de interligar diretamente entre dispositivos externos e as populações neuronais dentro do córtex cerebral1,2. Esta tecnologia é uma ferramenta inestimável para o registro de potenciais de ação neural para melhorar a capacidade dos cientistas de explorar a função neuronal, avançar a compreensão de doenças neurológicas e desenvolver terapias potenciais. O microeletrodo Intracortical, usado como parte dos sistemas brain machine interface (IMC), permite o registro de potenciais de ação de um indivíduo ou pequenos grupos de neurônios para detectar intenções motoras que podem ser usadas para produzir saídas funcionais3. Na verdade, os sistemas de IMC têm sido usados com sucesso para fins protéticos e terapêuticos, como o controle do ritmo sensório-motor adquirido para operar um cursor de computador em pacientes com esclerose lateral amiotrófica (ELA)4 e lesões na medula espinhal5 e restaurar o movimento em pessoas que sofrem de telegia crônica6.

Infelizmente, imes muitas vezes não conseguem gravar de forma consistente ao longo do tempo devido a vários modos de falha que incluem mecânicos, biológicos e materiais fatores7,8. Acredita-se que a resposta neuroinflamatória que ocorre após a implantação do eletrodo seja um desafio considerável que contribui para a falha do eletrodo9,10,11,12,13, 14. A resposta neuroinflamatória é iniciada durante a inserção inicial do IME que corta a barreira cerebral do sangue, danifica o parenchyma cerebral local e interrompe as redes gliais e neuronais15,16. Esta resposta aguda é caracterizada pela ativação de células gliais (microglia/macrófagos e astrócitos), que liberam moléculas pró-inflamatórias e neurotóxicas ao redor do local do implante17,18,19,20. A ativação crônica das células gliais resulta em uma reação corporal estrangeira caracterizada pela formaçãode uma cicatriz glial isolando o eletrodo do tecido cerebral saudável7,9,12,13, 17,21,22. Em última análise, dificultando a capacidade do eletrodo para registrar potenciais de ação neuronal, devido à barreira física entre o eletrodo e os neurônios e a degeneração e morte dos neurônios23,24,25.

O fracasso precoce dos microeletrodos intracortical trouxe pesquisas consideráveis no desenvolvimento de eletrodos de próxima geração, com ênfase em estratégias biomiméticas26,27,28,29,30. De particular interesse para o protocolo descrito aqui, é o uso da nano-arquitetura como uma classe de alterações de superfície biomimética para IMEs31. Estabeleceu-se que as superfícies que imitam a arquitetura do ambiente in vivo natural têm uma resposta biocompatível melhorada32,33,34,35,36. Assim, a hipótese que obrigando este protocolo é que a descontinuidade entre a arquitetura áspera do tecido cerebral e a arquitetura suave dos microeletrodos intracortical pode contribuir para a resposta neuroinflamatória e crônica do corpo estranho às IMEs implantadas (para uma revisão completa refere-se a Kim et al.31). Já mostramos anteriormente que a utilização de características nanoarquitetura semelhantes à arquitetura de matriz extracelular do cérebro reduz marcadores inflamatórios astrócitos de células cultivadas em substratos nano-arquiteturados, em comparação com superfícies de controle plano em modelos in vitro e ex vivo de neuroinflamação37,38. Além disso, mostramos que a aplicação da litografia de feixe de íons focados (FIB) para gravar nanoarquiteturas diretamente em sondas de silício resultou em um aumento significativo da viabilidade neuronal e menor expressão de genes pró-inflamatórios de animais implantados com as sondas de nanoarquitetura em comparação com o grupo de controle suave26. Portanto, o objetivo do protocolo apresentado aqui é descrever o uso da litografia fib para gravar nanoarquiteturas em dispositivos de microeletrodo intracortical fabricados. Este protocolo foi projetado para gravar características do tamanho de nanoarquitetura em superfícies de silício de hastes de microeletrodos intracortical utilizando processos automatizados e manuais. Estes métodos são descomplicados, reproduzíveis e certamente podem ser otimizados para vários materiais de dispositivos e tamanhos de recurso desejados.

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Protocolo

NOTA: Faça as seguintes etapas ao desgastar o equipamento protetor pessoal apropriado, tal como um revestimento de laboratório e luvas.

1. Montagem de sonda de silício não funcional para litografia de feixe de íons focados (FIB)

NOTA: Para o procedimento completo que descreve a fabricação da bolacha soi com as 1.000 sondas, consulte a Ereifej et al.39.

  1. Isolar uma tira de 2-3 sondas de silício do silício em isolante (SOI) wafer contendo 1.000 sondas. Não faça tiras contendo mais de três sondas de silício. Isso pode aumentar as chances de montagem solta e pode causar desalinhamento, resultando na FIB para gravar incorretamente.
    NOTA: Tiras / sondas não firmemente sentado no canhoto de alumínio pode causar duas complicações: 1) quando o estágio se move para trabalhar na próxima seção, haverá vibrações e a moagem não será preciso até que a sonda se instala e 2) pode causar uma alta variação e estar fora do plano de foco.
    1. Ao usar luvas, use fórceps finos para colocar pressão em torno das sondas para quebrar uma pequena seção contendo duas a três sondas.
  2. Limpe cuidadosamente a sonda de silício de toda a poeira e detritos antes da gravação da FIB. Prepare uma placa de poliestireno de 6 poços, canalizando 3 mL/bem de 95% de etanol em três poços.
    1. Cuidadosamente pegar a tira cortada de sondas de silício usando ponta fina ou fórceps de vácuo e colocá-lo em filtro celular. Coloque apenas uma tira de sondas de silício por filtro para evitar quebrar as sondas. Coloque o filtro contendo as sondas de silício tira no primeiro poço contendo 95% de etanol para limpeza. Mantenha o filtro no primeiro poço por 5 min.
    2. Mova o filtro contendo as sondas de silício a partir do primeiro poço e colocá-lo no segundo poço contendo 95% de etanol para mais 5 min. Repita mais uma vez no terceiro poço.
    3. Coloque o filtro contendo as sondas de silício limpa em uma placa de politetrafluoroetileno ao ar seco. Faça esta etapa em uma capa estéril para evitar a contaminação da poeira.
  3. Coloque a faixa seca de sondas de silício em um recipiente selado para o transporte para o SEM-FIB. Envolva o filtro contendo as amostras secas com um envoltório de folha de plástico ou alumínio para transporte e/ou armazenamento para manter a limpeza.
  4. Use fine tipped ou fórceps de vácuo para pegar cuidadosamente a tira limpa de sondas de silício e colocá-los em um toco de alumínio limpo (usado para imagens SEM-FIB / gravura) para se preparar para a montagem.
  5. Use um palito (ou outro instrumento fino derrubado como um fio elétrico fino), para colocar uma pequena gota (~ 10 μL) de tinta prateada na borda do substrato de silício em torno das sondas. Proteja a tira para baixo espalhando a pintura de prata em torno dos lados do substrato do silicone que cerca a ponta de prova. Deixe a tinta prateada secar completamente antes de colocar o toco de alumínio no SEM-FIB.
    NOTA: Tenha cuidado para não obter tinta prateada na haste do eletrodo, porque essa é a parte que será gravada. Se a tira das pontas de prova não é escorada firmemente ao esboço de alumínio, a tira pode mover-se durante o processamento ou ter um plano de foco diferente, tendo por resultado assim a moagem incorreta pelo FIB. Diversas tiras de pontas de prova do silicone podem ser montadas no mesmo esboço de alumínio, certificando-se que há um espaço amplo entre as tiras para permitir a remoção do esboço após o etching. Isso permitirá uma gravação mais eficiente de várias sondas usando o recurso automatizado descrito abaixo.

2. Alinhar a FIB para as sondas de silício

  1. Clique no botão de ventilação na aba de controle de feixe para desabafar a câmara. Press Shift+F3 para se apresentar em casa. Confirme a seleção selecionando o botão Home Stage na janela pop-up.
    NOTA: Executar a operação de fase doméstica é um passo preventivo para garantir que o eixo de palco seja lido corretamente pelo software e o microscópio esteja em boas condições.
  2. Depois que a fase inicial estiver completa, mova o palco para coordenadas X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0°, R = 0°. Uma vez que a câmara é ventilada, colocar luvas de nitrile limpo e abrir a porta da câmara.
    NOTA: Dependendo do aplicativo do usuário anterior, pode ser necessário alterar o adaptador de estágio. Os adaptadores de palco padrão (por exemplo, estilo FEI) podem ser removidos desaparafusando o parafuso central no sentido anti-horário e instalados parafusando no sentido horário na placa de rotação do palco.
  3. Insira o toco de alumínio segurando as sondas no topo do adaptador de palco. Fixe o coto de alumínio apertando o parafuso do jogo no lado do adaptador do estágio. Use a chave de 30 mm de 1,5 mm para esta tarefa.
  4. Ajuste a altura do adaptador de palco, transformando o adaptador no sentido horário para baizá-lo ou no sentido anti-horário para levantá-lo. Fixe o adaptador de palco para a placa de rotação, transformando a porca de cone de bloqueio no sentido horário até que a porca esteja segura contra a placa de rotação de palco. Segure o adaptador de palco com a outra mão para evitar a rotação do adaptador e amostras, apertando a porca cone de bloqueio.
    NOTA: Use o medidor de altura fornecido para determinar a altura apropriada. A parte superior do stub de alumínio deve ser a mesma altura que a linha máxima mostrada no calibre da altura. Sobre apertar a porca do cone pode causar dano ao estágio e ao adaptador. Use apenas força suficiente para proteger as amostras.
  5. Adquirir uma imagem da câmera de navegação. Balance cuidadosamente o braço da câmera de navegação aberto até que ele pare. O estágio do microscópio mover-se-á automaticamente para uma posição abaixo da câmera. Assista à imagem ao vivo mostrada no Quadrante 3 da interface do usuário do microscópio (UI).
    1. Uma vez que o nível de brilho auto se ajusta a um nível adequado, adquirir a imagem, empurrando o botão para baixo no suporte da câmera. Certifique-se de esperar para a aquisição de imagem inteira para terminar, que é indicado por um símbolo de pausa que aparece no Quadrante 3 e a iluminação da câmera desligar. Isso leva aproximadamente 10 s. Balance o braço da câmera de volta para a posição fechada. O palco voltará à posição original.
  6. Feche cuidadosamente a porta da câmara do microscópio. Assista à imagem da câmera CCD no Quadrante 4 enquanto fecha a porta. Certifique-se de que as amostras e o estágio estejam a uma distância segura de qualquer componente crítico na câmara do microscópio.
  7. Selecione a seta para baixo ao lado do botão Bomba na aba de controle de feixe. Selecione Bomba com botão de limpeza de amostras no software de interface do dia para iniciar a bomba de vácuo de câmara e construída em aspirador de plasma. Certifique-se que a porta está selada empurrando delicadamente na cara da porta quando a bomba funcionar. Aguarde aproximadamente 8 min para o tempo de bombeamento e ciclo de limpeza de plasma para a câmara do microscópio a ser concluída.
    NOTA: Um selo de vácuo pode ser confirmado puxando suavemente a porta da câmara, que deve permanecer fechada se o sistema estiver vácuo.
  8. Uma vez que o ícone no canto inferior direito da interface do dia fica verde, pressione o botão Wake-Up na aba de controle de feixe que liga os feixes de elétrons e íons. Selecione o quadrante 1 e defina o sinal de feixe para feixe de elétrons (se não for definido já), definir quadrante 2 a feixe de íons (se não definido já).
    1. Defina a tensão SEM para 5 kV, defina a corrente de feixe SEM para 0,20 nA, defina o detector SEM para ETD, defina o modo detector de elétrons secundários. Defina a tensão da FIB para 30 kV, defina a corrente do feixe FIB para 24 pA, defina o detector fib para detector de gelo, defina o modo detector para o elétron secundário.
  9. Clique duas vezes na sonda de silício na imagem da câmera de navegação, quadrante 3 para mover o palco para a localização aproximada da sonda. Clique no quadrante 1 para selecioná-lo como o quadrante ativo e aperte o botão de pausa para iniciar a digitalização do SEM. Defina o tempo de digitalização habitar a 300 ns e desligar o scan interlacing,integração da linha,e quadro de média. Ajuste a rotação da varredura a 0 na aba do controle do feixe e clique direito no ajustador 2d do deslocamento do feixe e selecione zero.
  10. Ajuste a ampliação ao valor mínimo girando o botão de ampliação no sentido anti-horário no painel MUI. Ajuste o brilho e o contraste da imagem usando os botões no painel MUI ou o ícone da barra de ferramentas Auto Contrast Brightness.
  11. Mova o palco por dupla esquerda clicando no mouse em um recurso para centralá-lo, ou pressionando para baixo a roda do mouse e ativando o modo mouse joystick. Mova a sonda de silício desejada para ser modelada para o centro da imagem SEM.
  12. Localizar uma borda ou outras características, como uma partícula de poeira ou zero. Aumentar a ampliação para 2.000x, transformando o botão de ampliação no sentido horário. Ajuste o foco do SEM girando os botões grosseiros e finos do foco no MUI até que a imagem esteja no foco. Uma vez que a imagem está em foco, selecione a amostra De Link Z para o botão de distância de trabalho na barra de ferramentas.
  13. Confirme que a operação foi concluída olhando para a coordenada z-eixo na guia de navegação. O valor deve ser de aproximadamente 11 mm. Digite 4,0 mm na posição do eixo Z e aperte o botão Go To com o mouse ou aperte a tecla de entrada no teclado e o palco se mova para 4 mm de distância de trabalho.
  14. Mova o palco em X e Y para localizar o ombro da sonda de silício. Posicioná-lo o mais próximo possível do centro do SEM. Mude a inclinação do palco para 52° digitando "52" na coordenada T e batendo entrar. Observe se o ombro da sonda parece se mover para cima ou para baixo na imagem. Use o controle deslizante do Estágio Z para trazer o ombro da sonda de volta ao centro da imagem SEM. Ajuste somente a posição de Z, não mova x, Y, T, ou eixo de R.
  15. Executar o built in "xT Align Feature" comando localizado no palco drop down menu. Use o mouse para clicar em dois pontos paralelos à borda da sonda. Certifique-se de que o botão de rádio horizontal seja selecionado na janela pop-up e clique no acabamento. O palco girará para alinhar a sonda com o eixo X do palco. Ajuste o estágio em X,Y usando o mouse para colocar o ombro inferior da sonda no centro da imagem SEM novamente.
    NOTA: O primeiro ponto deve ser para o aperto da sonda e o segundo ponto deve ser para o ponto da sonda.
  16. Selecione o FIB no quadrante 2 e certifique-se que a corrente do feixe é ainda 24 pA. Defina a ampliação para 5.000x e o tempo de habitação para 100 ns. Digite Ctrl-F no teclado para definir o foco FIB para 13,0 mm. Na aba de controle de feixe, clique direito no ajustador 2d estigmator e selecione zero e, também, clique direito no ajustador Beam Shift 2d e selecione zero. Defina a rotação da digitalização para 0° e aperte o botão de brilho de contraste automático na barra de ferramentas.
  17. Procure uma imagem do ombro da ponta de prova no quadrante 2. Use a ferramenta instantâneo para adquirir uma imagem com a FIB. Confirme que o ombro da sonda está no centro da imagem da FIB, se não, clique duas vezes no ombro da sonda para movê-lo para o centro. Mova o palco para a esquerda, empurrando a chave da seta esquerda no teclado aproximadamente 10-15 vezes. Tire outro instantâneo e observe se o lado da sonda ainda está no centro da FIB.
    NOTA: Se não, a rotação do estágio deve ser ajustada ligeiramente. Se a sonda estiver acima do centro da imagem, o palco deve ser girado na direção negativa. Se a sonda estiver abaixo do centro, o palco deve ser girado no sentido horário. Digite uma rotação compucentric relativa de 0,01 a 0,2 graus, dependendo de que maneira é necessária para alinhar a sonda.
  18. Repita os passos 2.16 a 2.17 quantas vezes for em medida o necessário até que a borda do ombro da sonda esteja perfeitamente alinhada com o eixo X do palco,(a borda permanece no centro da FIB enquanto se move para a esquerda).
  19. Usando o FIB, mova o palco de volta para o ombro inferior da sonda. Salve a posição de palco na lista de posição clicando no botão Adicionar. Mude a corrente do feixe fib para 2,5 nA e certifique-se de que a ampliação da FIB ainda é 5000x. Executar a função de contraste de brilho automático e definir o tempo de habitar FIB para 100 ns.
  20. Aperte o botão de pausa para começar a digitalizar. Ajuste o foco da FIB e o astigmatismo, o mais rápido e precisamente possível, usando os botões de foco grosseiros e finos, e os botões estigmateiro X e Y no painel MUI. Aperte o botão de pausa para parar a digitalização da FIB.

3. Escrever um processo automatizado para gravura

  1. Iniciar o software, localizando-o no menu inicial do Windows (ou seja, Start\Programs\FEI Company\Applications\Nanobuilder). Posicione a janela de software no monitor lateral para que a ui não seja encoberta. Abra o arquivo para modelar as sondas de silício clicando em arquivo e, em seguida, aberto. Direcione o navegador windows para a localização do script de software(Arquivo Suplementar 1 - o nome do arquivo é "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.jbj").
  2. Dentro do software, selecione o menu de queda do microscópio e selecione a origem do palco set. Dentro do software, selecione o menu de queda do microscópio e, em seguida, selecione Calibrar Detectores.
  3. Na ui do microscópio, clique no Quad 1 uma vez com o mouse para selecionar quad 1. Ignore as outras instruções mostradas na janela pop-up, eles não são necessários para este projeto. Clique OK para iniciar a calibração. O processo levará cerca de 5 min. Certifique-se de que os detectores De ETD e ICE calibram. Está tudo bem se outros detectores tiverem falhas de calibração.
  4. Dentro do software, selecione o menu de dropdown do microscópio e escolha execute para iniciar a sequência de padronização. Quando o padrão estiver completo, feche o software.
    NOTA: O software assumirá quad 3 e 4 para as funções de padronização e alinhamento. O script levará aproximadamente 12 h para ser executado. Enquanto o script está em execução, não altere nenhum parâmetro no microscópio.
  5. Hit "Vent" na aba de controle de feixe de ui microscópio para desligar os feixes de microscópio e iniciar o ciclo de ventilação. Enquanto a câmara está desabafando, mova o palco para coordenadas X = 70 mm, Y = 70 mm, Z = 0 mm, T = 0°, R = 0°. Uma vez que a câmara é ventilada, colocar luvas de nitrile limpo e abrir a porta da câmara.
  6. Solte o parafuso conjunto no adaptador de toco usando a chave de feitiço de 1,5 mm. Retire o toco de alumínio contendo a sonda padrão da câmara. Feche cuidadosamente a porta da câmara do microscópio. Assista à imagem da câmera CCD no Quadrante 4 enquanto fecha a porta. Certifique-se de que o adaptador de palco está a uma distância segura de qualquer componente crítico na câmara do microscópio.
  7. Selecione a seta para baixo ao lado do botão Bomba na aba de controle de feixe. Certifique-se que a porta está selada empurrando delicadamente na cara da porta quando a bomba funcionar.
    NOTA: Um selo de vácuo pode ser confirmado puxando suavemente a porta da câmara, que deve permanecer fechada se o sistema estiver vácuo. O tempo de bombeamento será de aproximadamente 5 min. Apenas um lado da sonda pode ser gravado durante uma única corrida.
  8. Se a parte frontal e traseira da sonda requer gravura, em seguida, retire cuidadosamente a tira gravada de sondas de silício depois de verificar o último etch e imagem do lado da frente (se as imagens são necessárias). Dissolva a tinta prateada com acetona, cautelosamente dabbing / escovar a acetona sobre a tinta prateada. Vire cuidadosamente a faixa em torno da parte traseira, re-montar, alinhar e gravar seguindo os passos descritos acima.

4. Verificando o Etch final e imagem

  1. Uma vez que a moagem é completa verificar a uniformidade das diferentes seções usando imagens SEM em uma ampliação maior.
    NOTA: A imagem latente no ângulo inclinado permite uma avaliação melhor da variação na profundidade do moagem. Deve ser dada especial atenção às regiões de transição entre os locais de moagem.
  2. Imagem das amostras novamente após a moagem com um microscópio óptico.
    NOTA: As linhas moídicas periódicas resultam em um efeito de refração dando origem a cores diferentes em função do ângulo de imagem. Se a cor não é contínua, juntamente com a sonda que é uma indicação clara da interrupção nas linhas moídas.

5. Montagem de uma sonda de silício funcional para a gravação da FIB

  1. Remova delicadamente o elétrodo funcional do silicone de seu empacotamento. Use fórceps para levantar cuidadosamente a guia protetora de plástico que cobre o palco da cabeça. Comece levantar um canto da aba acima da colagem pegajosa que prende a no lugar e mantenha levantar até que o elétrodo inteiro esteja removido.
  2. Cuidadosamente apertar o eletrodo com hemostats para se preparar para a montagem no quadro estereotaxic. Ao prender a aba coberta com os fórceps, coloc delicadamente hemostats curvados em torno do eixo verde acima do shank do silicone, com a parte curvada dos hemostats que enfrentam para cima para a aba. Trave os hemostats no lugar para assegurar-se de que o elétrodo não deixe cair fora de os hemostats.
  3. Retire delicadamente a aba protetora de plástico que cobre o palco da cabeça. Ao prender o elétrodo com os hemostats, grampee com cuidado o elétrodo no frame stereotaxic para a limpeza.
  4. Encha 3 placas de Petri com 95% de etanol (~10 mL por placa de Petri). Coloque a placa de Petri o eletrodo que é montado no quadro estereotipado para limpeza. Lentamente abaixe o eletrodo, transformando o micromanipulador para baixo (100 μm/s) para que o shank seja submerso no etanol de 95%.
    NOTA: Tenha cuidado para não transformar o micromanipulador muito rápido ou muito profundo, isso pode causar o eletrodo para quebrar (ou seja, o eletrodo não deve tocar a placa de Petri).
  5. Deixe o fioto de eletrodo no etanol de 95% por 5 min e, em seguida, levante lentamente o eletrodo do etanol de 95%, transformando o micromanipulador para cima (100 μm/s). Repita este passo mais duas vezes, para um total de três lavações. Deixe o eletrodo secar por cinco minutos.
  6. Use a mesma técnica para montar o eletrodo no quadro estereotipado, para remover o eletrodo do quadro estereotaxico. Coloque cuidadosamente os hemostats ao redor do eixo do eletrodo. Uma vez que os hemostats são apertados, libere o elétrodo do frame stereotaxic, devolva a aba protetora plástica que cobre o estágio principal, e põr o elétrodo limpado de novo em seu empacotamento.

6. Sonda de Silício Funcional de gravura usando FIB

  1. Monte o eletrodo de silício funcional limpo em um suporte de alumínio. Cuidadosamente pegar o eletrodo de silício funcional limpo usando fórceps e remover a guia protetora do palco da cabeça. Coloque o haste de eletrodo no canhoto de alumínio para que ele não paire sobre qualquer borda, em seguida, usando um pequeno pedaço de ou fita condutora de carbono, pino do farol com segurança para o canhoto de alumínio.
    NOTA: Alternativamente, um suporte de clipe de baixo perfil pode ser usado para segurar o eletrodo para baixo. Tenha cuidado para não tocar o shank eletrodo.
  2. Seguindo os passos descritos acima (Seção 2), posicione o eletrodo na altura eucêntrica e certifique-se de que o eletrodo esteja no ponto de coincidência dos feixes sem e FIB. Alinhe a haste com a direção "X" do palco.
  3. Defina a FIB como a corrente ideal para a moagem da nanoarquitetura necessária e certifique-se de que o foco e o estigma sejam devidamente corrigidos. Prepare uma variedade de linhas com espaçamento e comprimento desejados para cobrir o campo de visão da haste (500 seções μm). Ajuste os comprimentos da linha enquanto a gravura começ abaixo do shank às seções mais finas.
    NOTA: Ao gravar o eletrodo funcional, não é possível adicionar marcas fiduciais para automatizar o processo. Portanto, mover-se entre as sub-seções (~500 μm) é feito manualmente.
  4. Depois que a moagem da primeira seção estiver concluída, certifique-se de verificar a qualidade da moagem antes de passar para a próxima seção. Repita o passo 6.3 para gravar a próxima seção do shank. Alinhar as linhas moídas da seção anterior para os padrões utilizados para a próxima seção para evitar grandes lacunas entre as corridas.

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Resultados

FIB gravado Nano-arquitetura nas superfícies de sondas intracortical único shank
Utilizando os métodos descritos aqui, sondas intracortical foram gravadas com nano-arquiteturas específicas seguindo protocolos estabelecidos39. Dimensões e forma do projeto nano-arquitetura descrito nestes métodos foram implementados a partir de resultados in vitro anteriores, retratando uma diminuição na reatividade das células gliais, quando cultivada com o projeto de nano-arquitetura d...

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Discussão

O protocolo de fabricação delineado aqui utiliza litografia de feixe de íons focados para efetivamente e reprodutivelmente gravar nano-arquiteturas na superfície de microeletrodos de silício de pernil único não funcionais e funcionais. A litografia focada em feixe de íons (FIB) permite a ablação seletiva da superfície do substrato usando um feixe de íons finamente focado50,51. FIB é uma técnica de escrita direta que pode produzir várias caracterís...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelos prêmios do Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento de Reabilitação de Assuntos de Veteranos dos Estados Unidos (EUA): #RX001664-01A1 (CDA-1, Ereifej) e #RX002628-01A1 (CDA-2, Ereifej). O conteúdo não representa as opiniões do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA ou do Governo dos Estados Unidos. Os autores gostariam de agradecer à FEI Co. (Agora parte da Thermofisher Scientific) pela assistência e uso da instrumentação por pessoal, o que ajudou no desenvolvimento dos roteiros utilizados nesta pesquisa.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
16-Channel ZIF-Clip HeadstageTucker Davis TechnologiesZC16The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
1-meter cable, ALL spring wrappedThomas Scientific1213F04Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture
32-Channel ZIF-Clip Headstage HolderTucker Davis TechnologiesZ-ROD32The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30mlTed Pella16023https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
Baby-Mixter HemostatFine Science Tools13013-14Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat
Carbon Conductive Tape, Double CoatedTed Pella16084-7The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm
Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 wellSigma AldrichCLS3736-100EAAny non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/
Dumont #5 Fine ForcepsFine Science Tools11251-30Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30
Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon LabsFisher Scientific22-032-600Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600
Falcon Cell StrainerFisher Scientific08-771-1https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mmTed Pella16148Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180
Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge rollFisher Scientific01-213-101Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250
Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating DishesFisher Scientific02-617-149Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552
Michigan-style silicon functional electrodeNeuroNexusA1x16-3mm-100-177http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/
Model 1772 Universal holderKOPFModel 1772Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Model 900-U Small Animal Stereotaxic InstrumentKOPFModel 900-UOther stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/
Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide AssemblyKOPFModel 960Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250')Ted Pella807-5https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm
PELCO Vacuum Pick-Up System, 220VTed Pella520-1-220Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520
PELCO Conductive Silver PaintTed Pella16062https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
SEM FIB FEI Helios 650 NanolabThermo Fisher ScientificHelios G2 650This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/

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