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요약

우리는 나노 아키텍처를 피질 내 미세 전극 장치로 에칭하면 염증 반응을 감소시킬 수 있으며 전기 생리학적 기록을 향상시킬 수있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주었습니다. 본 명세서에 기재된 방법은 나노-아키텍처를 비기능적이고 기능적인 단일 생크 실리콘 의 표면에 에칭하는 접근법을 설명한다.

초록

전자 및 제조 기술의 발전으로, 피질 내 마이크로 전극은 더 큰 해상도와 확장 된 기능을 가진 정교한 마이크로 전극의 생산을 가능하게 상당한 개선을 겪고있다. 제조 기술의 발전은 뇌 의 자렌치마에 원활하게 통합하고, 전극 삽입 후 관찰 된 신경 염증 반응을 감소시키고 품질을 향상시키는 것을 목표로하는 생체 모방 전극의 개발을 지원하고 있으며, 전기 생리학적 기록의 수명. 여기서 우리는 최근 나노 아키텍처로 분류된 생체 모방 접근법을 채택하는 프로토콜을 설명합니다. 집중 된 이온 빔 리소그래피 (FIB)의 사용은 비 기능및 기능적 단일 생크 내 미세 전극의 표면에 특정 나노 아키텍처 기능을 에칭하기 위해이 프로토콜에서 활용되었다. 전극 표면에 나노 아키텍처를 에칭하는 것은 이식 된 장치의 생체 적합성 및 기능성의 가능한 개선을 나타냈다. FIB 사용의 이점 중 하나는 장치를 제조하는 동안과 는 달리 제조 된 장치에 에칭할 수 있다는 것입니다. 본 명세서에 제시된 프로토콜은 다양한 재료 유형, 나노 아키텍처 특징 및 디바이스의 종류에 최적화될 수 있다. 이식된 의료 기기의 표면을 보강하면 장치 성능과 조직 내 통합을 향상시킬 수 있습니다.

서문

피질 내 미세 전극 (IME)은 대뇌 피질1,2내부의 외부 장치와 신경 인구 사이의 직접적인 상호 작용 수단을 제공하는 침습적 전극이다. 이 기술은 신경 기능을 탐구 하는 과학자의 능력을 개선 하기 위해 신경 행동 잠재력을 기록 하기 위한 귀중 한 도구, 신경 질환의 사전 이해 와 잠재적인 치료를 개발. 뇌 기계 인터페이스 (BMI) 시스템의 일부로 사용되는 피질 내 마이크로 전극은 기능적 출력을 생성하는 데 사용할 수있는 모터 의도를 감지하기 위해 뉴런의 개인 또는 작은 그룹에서 행동 전위를 기록 할 수 있습니다3. 실제로, BMI 시스템은 근위축성 측삭 경화증(ALS)4 및 척수 손상5 및 만성 테트라클레아를 앓고 있는 사람들의 움직임을 회복시키기 위해 획득된 감각운동 리듬 조절과 같은 보철 및 치료 목적으로 성공적으로 사용되어 왔다6.

불행히도, IIM은 종종 기계적, 생물학적 및 물질적 인자7,8을포함하는 여러 고장 모드로 인해 시간이 지남에 따라 일관되게 기록하지 못합니다. 전극 이식 후 발생하는 신경염증성 반응은 전극 부전9,10,11, 12,13,14에기여하는 상당한 도전으로 생각된다. 신경 염증 반응은 혈액 뇌 장벽을 단절하고, 국소 뇌 뼈를 손상시키고 신경교 및 신경 세포 네트워크를 방해하는 IME의 초기 삽입 중에 시작됩니다15,16. 이러한 급성 반응은 임플란트 부위17,18,19,20주위의 염증 및 신경 독성 분자를 방출하는 신경교세포(microglia/대식세포 및 성상세포)의 활성화를 특징으로 한다. 신경교 세포의 만성 활성화는 건강한 뇌 조직7,9,12,13,17,21,22에서전극을 분리하는 신경교 흉터의 형성을 특징으로하는 이물질 반응을 초래한다. 궁극적으로, 전극과 뉴런 사이의 물리적 장벽과 뉴런의 변성 및 사망으로 인한 뉴런 작용 전위를 기록하는 전극의 능력을 저해하는23,24,25.

피질 내 미세 전극의 초기 실패는 생체 모방 전략26,27,28,29,30에중점을 둔 차세대 전극 개발에 상당한 연구를 가져왔습니다. 여기서 설명된 프로토콜에 특히 관심이 있는 것은, IME31에대한 생체 모방 표면 변경의 클래스로서 나노 아키텍처의 사용이다. 생체내 자연환경의 구조를 모방한 표면이 생체적합성반응(32, 33,34,35,36)을개선한 것으로 확립되었다. 따라서, 이 프로토콜을 강요하는 가설은 뇌 조직의 거친 구조와 피질 내 미세 전극의 원활한 구조 사이의 불연속이 이식된 ImEs에 대한 신경 염증 및 만성 이물질 반응에 기여할 수 있다는 것이다(전체 검토를 위해 김 등31참조). 우리는 이전에 뇌의 세포외 매트릭스 아키텍처와 유사한 나노 아키텍처 특징의 활용이 나노 아키텍처 기질상에서 배양된 세포로부터 성상세포 염증 마커를 감소시킨다는 것을 보여주었으며, 신경염증의 생체내 및 생체내 모델 모두에서 평평한 대조군 표면에 비해37,38. 더욱이, 우리는 나노 구조에 직접 나노 아키텍처를 에칭하는 집중 된 이온 빔 (FIB) 리소그래피의 응용을 보여주었으며, 매끄러운대조군(26)에비해 나노 아키텍처 프로브에 이식된 동물로부터의 신경 생존력 및 낮은 발현을 크게 증가시켰다. 따라서, 여기에 제시된 프로토콜의 목적은 제조된 피질 내 미세 전극 장치에 대한 나노 아키텍처에 대한 FIB 리소그래피의 사용을 설명하는 것입니다. 이 프로토콜은 나노 아키텍처 크기의 기능을 자동화 및 수동 프로세스를 모두 활용하여 피질 내 마이크로 전극 생크의 실리콘 표면에 식각하도록 설계되었습니다. 이러한 방법은 복잡하지 않고 재현 가능하며 다양한 장치 재료 및 원하는 피처 크기에 맞게 최적화할 수 있습니다.

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프로토콜

참고: 실험실 외투와 장갑과 같은 적절한 개인 보호 장비를 착용한 상태에서 다음 단계를 수행하십시오.

1. 초점 이온 빔 (FIB) 리소그래피용 비기능성 실리콘 프로브 장착

참고 : 1,000 프로브와 SOI 웨이퍼의 제조를 설명하는 전체 절차에 대한, Ereifej 등39를참조하십시오.

  1. 1,000개의 프로브를 포함하는 절연체(SOI) 웨이퍼의 실리콘에서 2-3개의 실리콘 프로브 스트립을 분리합니다. 3개 이상의 실리콘 프로브가 포함된 스트립을 만들지 마십시오. 이로 인해 장착이 느슨해질 가능성이 높아지며 FIB가 잘못 에칭될 수 있습니다.
    참고 : 알루미늄 스텁에 단단히 앉지 않는 스트립 / 프로브는 두 가지 합병증을 일으킬 수 있습니다 : 1) 스테이지가 다음 섹션에서 작동하도록 움직일 때 진동이 있을 것이고 프로브가 정착 할 때까지 밀링이 정확하지 않으며 2) 높은 변형을 일으키고 초점 평면에서 벗어날 수 있습니다.
    1. 장갑을 끼고 있는 동안 미세한 집게를 사용하여 프로브 주위에 압력을 가하여 2~3개의 프로브가 포함된 작은 부분을 끊습니다.
  2. FIB 에칭 전에 모든 먼지와 이물질의 실리콘 프로브를 조심스럽게 청소하십시오. 3 mL / 3 mL / 3 개의 우물 95 % 에탄올을 3 개의 우물로 피펫팅하여 6 개의 잘 폴리스티렌 플레이트를 준비하십시오.
    1. 미세 팁 이나 진공 집게를 사용 하 여 실리콘 프로브의 컷 스트립을 신중 하 게 데리 러 셀 스트레이너에 배치 합니다. 스트레이너당 실리콘 프로브 스트립을 하나만 놓아 프로브가 파손되지 않도록 하십시오. 실리콘 프로브 스트립이 들어있는 여과기를 청소를 위해 95 % 에탄올이 들어있는 첫 번째 우물에 놓습니다. 5 분 동안 첫 번째 우물에서 여과기를 유지하십시오.
    2. 실리콘 프로브를 포함하는 스트레이너를 첫 번째 우물에서 이동하고 다른 5 분 동안 95 % 에탄올을 포함하는 두 번째 우물에 놓습니다.
    3. 세척된 실리콘 프로브가 들어 있는 여과기를 폴리테트라플루오로에틸렌 플레이트에 놓아 공기 건조시. 먼지로 인한 오염을 방지하기 위해 멸균 후드에서 이 단계를 수행하십시오.
  3. 공기 건조 된 실리콘 프로브 스트립을 밀봉 된 용기에 놓고 SEM-FIB로 운반하십시오. 공기 건조 시료를 함유한 여과기를 세척을 유지하기 위해 운반 및/또는 보관을 위해 플라스틱 또는 알루미늄 호일 랩으로 감쌉니다.
  4. 미세 한 팁 또는 진공 집게를 사용하여 실리콘 프로브의 깨끗한 스트립을 조심스럽게 집어 들고 깨끗한 알루미늄 스텁 (SEM-FIB 이미징 / 에칭에 사용)에 놓아 장착준비를하십시오.
  5. 이쑤시개(또는 얇은 전선과 같은 다른 미세한 기울어진 기기)를 사용하여 프로브를 둘러싼 실리콘 기판 가장자리에 은 페인트의 작은 방울(~10 μL)을 놓습니다. 프로브를 둘러싼 실리콘 기판의 측면 주위에 은 페인트를 확산시켜 스트립을 아래로 고정시다. 알루미늄 스텁을 SEM-FIB에 넣기 전에 은색 페인트가 완전히 건조되도록 하십시오.
    참고 : 그것이 에칭 될 부분이기 때문에 전극의 생크에 은색 페인트를 얻지 않도록주의하십시오. 프로브 스트립이 알루미늄 스텁에 단단히 고정되지 않으면 스트립이 처리 중에 이동하거나 다른 초점 평면을 가질 수 있으므로 FIB에 의한 잘못된 밀링이 발생할 수 있습니다. 실리콘 프로브의 여러 스트립은 동일한 알루미늄 스텁에 장착할 수 있으므로 에칭 후 스텁에서 제거할 수 있도록 스트립 사이에 충분한 공간이 있는지 확인합니다. 이렇게 하면 아래에 설명된 자동화된 기능을 사용하여 여러 프로브를 보다 효율적으로 에칭할 수 있습니다.

2. FIB를 실리콘 프로브에 맞추기

  1. 빔 컨트롤 탭의 통풍구 버튼을 클릭하여 챔버를 환기시려면 시프트+F3를 눌러 홈 스테이지를 수행합니다. 팝업 창에서 홈 스테이지 버튼을 선택하여 선택 영역을 확인합니다.
    참고 : 홈 스테이지 작업을 실행하는 것은 단계 축이 소프트웨어에 의해 올바르게 판독되고 현미경이 양호한 상태인지 확인하는 예방 단계입니다.
  2. 홈 스테이지가 완료되면 스테이지를 이동하여 X = 70mm, Y = 70mm, Z = 0mm, T = 0°, R = 0°를 좌표합니다. 챔버가 환기되면 깨끗한 니트릴 장갑을 착용하고 챔버 도어를 엽니다.
    참고: 이전 사용자의 응용 프로그램에 따라 스테이지 어댑터를 변경해야 할 수 있습니다. 표준 스테이지 어댑터(예: FEI 스타일)는 중앙 볼트를 시계 반대 방향으로 풀고 스테이지의 회전 플레이트에 시계 방향으로 나사를 조여 설치하여 제거할 수 있습니다.
  3. 프로브를 고정하는 알루미늄 스텁을 스테이지 어댑터 상단에 삽입합니다. 무대 어댑터 의 측면에 세트 나사를 조여 알루미늄 스텁을 고정합니다. 이 작업에는 1.5mm 육하는 렌치를 사용하십시오.
  4. 어댑터를 시계 방향으로 돌려 스테이지 어댑터의 높이를 조정하여 낮추거나 시계 반대 방향으로 올리도록 합니다. 너트가 스테이지 회전 플레이트에 대해 안전할 때까지 잠금 콘 너트를 시계 방향으로 돌려 스테이지 어댑터를 회전 플레이트에 고정합니다. 잠금 콘 너트를 조이면서 어댑터와 샘플의 회전을 방지하기 위해 다른 손으로 스테이지 어댑터를 잡습니다.
    참고: 제공된 높이 게이지를 사용하여 적절한 높이를 결정합니다. 알루미늄 스텁의 위쪽높이는 높이 게이지에 표시된 최대 선과 같아야 합니다. 콘 너트를 과도하게 조이면 스테이지와 어댑터가 손상될 수 있습니다. 샘플을 고정하기에 충분한 힘만 사용하십시오.
  5. 내비게이션 카메라 이미지를 획득합니다. 내비게이션 카메라 팔이 멈출 때까지 조심스럽게 스윙합니다. 현미경 스테이지는 자동으로 카메라 아래 의 위치로 이동합니다. 현미경 사용자 인터페이스(UI)의 사분면 3에 표시된 라이브 이미지를 시청합니다.
    1. 밝기 레벨 자동이 적절한 수준으로 조정되면 카메라 브래킷의 버튼을 아래로 눌러 이미지를 획득합니다. 사분면 3에 나타나는 일시 중지 기호와 카메라의 조명이 꺼져 있는 전체 이미지 수집이 완료될 때까지 기다려야 합니다. 이것은 약 10 초 걸립니다. 카메라 팔을 닫힌 위치로 다시 스윙하십시오. 스테이지가 원래 위치로 돌아갑니다.
  6. 현미경 챔버 도어를 조심스럽게 닫습니다. 문을 닫는 동안 쿼드런트 4의 CCD 카메라 이미지를 보십시오. 시료와 스테이지가 현미경 챔버의 중요한 구성 요소로부터 안전한 거리인지 확인합니다.
  7. 빔 제어 탭의 펌프 버튼 옆의 아래쪽 화살표를 선택합니다. UI 소프트웨어에서 샘플 청소 버튼이 있는 펌프를 선택하여 챔버 진공 펌프를 시작하고 플라즈마 클리너에 내장합니다. 펌프가 가동되는 동안 도어의 얼굴을 부드럽게 밀어 도어를 밀봉해야 합니다. 현미경 챔버가 완료될 때까지 펌핑 시간과 플라즈마 세척 주기가 약 8분 동안 기다립니다.
    참고: 시스템이 진공 상태일 경우 닫혀 있어야 하는 챔버 도어를 부드럽게 당겨 진공 씰을 확인할 수 있습니다.
  8. UI의 오른쪽 하단에 있는 아이콘이 녹색으로 바뀌면 전자 및 이온 빔을 켜는 빔 컨트롤 탭에서 절전 모드 해제 버튼을 누릅니다. 사분면 1을 선택하고 빔 신호를 전자 빔으로 설정하고(아직 설정하지 않은 경우), 사분면 2를 이온 빔으로 설정합니다(아직 설정되지 않은 경우).
    1. SEM 전압을 5kV로 설정하고 SEM 빔 전류를 0.20 nA로 설정하고 SEM 검출기를 ETD로 설정하고 검출기 모드를 이차 전자로 설정합니다. FIB 전압을 30kV로 설정하고 FIB 빔 전류를 24pA로 설정하고 FIB 검출기를 ICE 검출기로 설정하고 검출기 모드를 이차 전자로 설정합니다.
  9. 내비게이션 카메라 이미지에서 실리콘 프로브를 두 번 클릭하고 사분면 3을 클릭하여 프로브의 대략적인 위치로 스테이지를 이동합니다. 사분면 1을 클릭하여 활성 사분면으로 선택하고 일시 중지 버튼을 눌러 SEM 스캔을 시작합니다. 스캔 거점 시간을 300ns로 설정하고 스캔 인터레이스, 라인 통합및 프레임 평균을 끕니다. 빔 제어 탭에서 스캔 회전을 0으로 설정하고 빔 시프트 2d 조정기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 0을선택합니다.
  10. MUI 패널에서 배율 노브를 시계 반대 방향으로 돌려 배율을 최소값으로 조정합니다. MUI 패널의 노브 또는 자동 대비 밝기 도구 모음 아이콘을 사용하여 이미지 밝기와 대비를 조정합니다.
  11. 피처에서 마우스를 두 번 왼쪽으로 클릭하여 가운데에 있거나 마우스 휠을 누르고 조이스틱 마우스 모드를 활성화하여 스테이지를 이동합니다. 원하는 실리콘 프로브를 SEM 이미지의 중심으로 패턴화하도록 이동합니다.
  12. 가장자리 또는 먼지 입자 또는 스크래치와 같은 기타 피쳐를 찾습니다. 배율 노브를 시계 방향으로 돌려 배율을 2,000배로 늘립니다. 이미지가 초점이 맞을 때까지 MUI의 거칠고 미세한 초점 노브를 돌려 SEM의 초점을 조정합니다. 이미지가 초점이 되면 도구 모음에서 작업 거리 단추에 대한 링크 샘플 Z를 선택합니다.
  13. 탐색 탭에서 Z축 좌표를 확인하여 작업이 완료된지 확인합니다. 값은 약 11mm이어야 합니다. Z 축 위치에서 4.0 mm에 입력하고 마우스로 이동 버튼을 누르거나 키보드의 입력 키를 누르면 스테이지가 4mm 작동 거리로 이동합니다.
  14. 스테이지를 X 및 Y로 이동하여 실리콘 프로브의 어깨를 찾습니다. SEM의 중심에 가능한 한 가깝게 배치합니다. T 좌표에 "52"를 입력하고 입력하여 스테이지 기울기를 52°로 변경합니다. 프로브의 어깨가 이미지에서 위 또는 아래로 이동하는 지 여부를 관찰합니다. 스테이지 Z 슬라이더를 사용하여 프로브의 숄더를 SEM 이미지의 가운데로 되돌려 보냅니다. Z 위치만 조정하고 X, Y, T 또는 R 축을 이동하지 마십시오.
  15. 단계 드롭다운 메뉴에 있는"xT 정렬 기능"명령을 내장하여 실행합니다. 마우스를 사용하여 프로브 가장자리에 평행한 두 점을 클릭합니다. 팝업 창에서 가로 라디오 단추가 선택되어 있는지 확인하고 완료를 클릭합니다. 스테이지는 회전하여 프로브를 스테이지의 X축에 정렬합니다. X,Y에서 스테이지를 조정하여 마우스를 사용하여 프로브의 아래쪽 어깨를 SEM 이미지의 중앙에 다시 배치합니다.
    참고: 첫 번째 점은 프로브의 그립을 향해야 하며 두 번째 점은 프로브의 지점쪽으로 향해야 합니다.
  16. 사분면 2에서 FIB를 선택하고 빔 전류가 여전히 24 pA인지 확인합니다. 배율을 5,000x로 설정하고 거주 시간을 100ns로 설정합니다. 키보드에 Ctrl-F를 입력하여 FIB 포커스를 13.0mm로 설정합니다. 빔 컨트롤 탭에서 오명 2d 조정기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 0을 선택하고 빔 시프트 2d 조정기를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 0을선택합니다. 스캔 회전을 0°로 설정하고 도구 모음에서 자동 대비 밝기 버튼을 누를 수 있습니다.
  17. 사분면 2에서 프로브 숄더의 이미지를 찾습니다. 스냅샷 도구를 사용하여 FIB로 이미지를 가져옵니다. 프로브 숄더가 FIB 이미지의 중앙에 있는지 확인합니다(그렇지 않은 경우)는 프로브 숄더를 두 번 클릭하여 가운데로 이동합니다. 키보드의 왼쪽 화살표 키를 약 10-15회 밀어 스테이지를 왼쪽으로 이동합니다. 다른 스냅샷을 찍고 프로브 측이 FIB의 중심에 있는지 여부를 관찰합니다.
    참고: 그렇지 않은 경우 스테이지 회전을 약간 조정해야 합니다. 프로브가 이미지 중심 위에 있으면 스테이지를 음수 방향으로 회전해야 합니다. 프로브가 중심 아래에 있으면 스테이지를 시계 방향으로 회전해야 합니다. 프로브를 정렬하는 데 필요한 방법에 따라 0.01 ~0.2도의 상대 편평회전을 입력합니다.
  18. 프로브 숄더의 가장자리가 스테이지의 X축과 완벽하게 정렬될 때까지 필요한 만큼 2.16에서 2.17단계를 반복합니다(가장자리는 왼쪽으로 이동하는 동안 FIB의 중심에 유지됩니다).
  19. FIB를 사용하여 스테이지를 프로브의 아래쪽 어깨로 다시 이동합니다. 추가 단추를 클릭하여 순위 목록에서 스테이지 위치를 저장합니다. FIB 빔 전류를 2.5nA로 변경하고 FIB의 배율이 여전히 5000x인지 확인합니다. 자동 밝기 대비 기능을 실행하고 FIB 거주 시간을 100ns로 설정합니다.
  20. 일시 중지 버튼을 눌러 스캔을 시작합니다. MUI 패널의 거친 및 미세 초점 노브와 X 및 Y 낙인 노브를 사용하여 FIB 초점과 난시를 가능한 한 빠르고 정확하게 조정하십시오. 일시 정지 버튼을 눌러 FIB 스캔을 중지합니다.

3. 에칭자동화 프로세스 작성

  1. Windows 시작 메뉴(즉, 시작\프로그램\FEI 회사\응용 프로그램\나노빌더)에서 소프트웨어를 찾아 서 소프트웨어를 시작합니다. UI가 가려지지 않도록 소프트웨어 창을 측면 모니터에 배치합니다. 실리콘 프로브를 패터닝하기 위한 파일을 열고 파일을 클릭한 다음 엽니다. 소프트웨어 스크립트의 위치로 창 브라우저를 직접(보충 파일 1 - 파일 이름은 "Case_Western_2000_micron_Final_11H47M_runtime.jbj").
  2. 소프트웨어 내에서 현미경 드롭다운 메뉴를 선택하고 단계 원예 설정을선택합니다. 소프트웨어 내에서 현미경 드롭다운 메뉴를 선택한 다음 교정 감지기를 선택합니다.
  3. 현미경 UI에서 마우스로 쿼드 1을 한 번 클릭하여 쿼드 1을 선택합니다. 팝업 창에 표시된 다른 지침을 무시하면 이 프로젝트에 필요하지 않습니다. 확인을 클릭하여 보정을 시작합니다. 이 과정은 약 5분 정도 소요됩니다. 다른 검출기에 교정 실패가 있는 경우 괜찮습니다.
  4. 소프트웨어 내에서 현미경 드롭다운 메뉴를 선택하고 실행을 선택하여 패터닝 시퀀스를 시작합니다. 패턴이 완료되면 소프트웨어를 닫습니다.
    참고 : 소프트웨어는 패터닝 및 정렬 기능에 대한 쿼드 3과 4를 인수합니다. 스크립트를 실행하는 데 약 12시간이 소요됩니다. 스크립트가 실행되는 동안 현미경의 매개 변수를 변경하지 마십시오.
  5. 현미경 UI 빔 제어 탭에서"Vent"를 누르고 현미경 빔을 종료하고 통풍구 주기를 시작합니다. 챔버가 환기되는 동안, X = 70mm, Y = 70mm, Z = 0mm, T = 0 °, R = 0 °를 좌표로 무대를 이동합니다. 챔버가 환기되면 깨끗한 니트릴 장갑을 착용하고 챔버 도어를 엽니 다.
  6. 1.5mm 육각 렌치를 사용하여 스텁 어댑터의 세트 나사를 느슨하게 합니다. 챔버에서 패턴 프로브를 포함하는 알루미늄 스텁을 제거합니다. 현미경 챔버 도어를 조심스럽게 닫습니다. 문을 닫는 동안 쿼드런트 4의 CCD 카메라 이미지를 보십시오. 스테이지 어댑터가 현미경 챔버의 중요한 구성 요소로부터 안전한 거리인지 확인합니다.
  7. 빔 제어 탭의 펌프 버튼 옆에 있는 아래쪽 화살표를 선택합니다. 펌프가 가동되는 동안 도어의 얼굴을 부드럽게 밀어 도어를 밀봉해야 합니다.
    참고: 시스템이 진공 상태일 경우 닫혀 있어야 하는 챔버 도어를 부드럽게 당겨 진공 씰을 확인할 수 있습니다. 펌핑 시간은 약 5 분입니다. 단 한 번의 실행 중에 프로브의 한쪽면만 에칭할 수 있습니다.
  8. 프로브의 앞면과 뒷면에 에칭이 필요한 경우 최종 식각을 확인하고 전면을 이미징한 후 실리콘 프로브의 에칭 스트립을 조심스럽게 제거합니다(이미지가 필요한 경우). 은색 페인트를 아세톤으로 녹여 서 조심스럽게 아세톤을 두드리고 칫솔질합니다. 조심스럽게 뒤쪽으로 스트립을 돌려, 다시 마운트, 정렬 및 위에서 설명한 단계에 따라 에칭.

4. 최종 식각 및 이미징 확인

  1. 밀링이 완료되면 더 높은 배율에서 SEM 이미징을 사용하여 상이한 섹션의 균일성을 확인합니다.
    참고: 기울어진 각도로 이미징하면 밀링 깊이의 변동을 더 잘 평가할 수 있습니다. 밀링 위치 사이의 전환 영역에 특별한주의를 기울여야합니다.
  2. 광학 현미경으로 밀링 한 후 샘플을 다시 이미지화하십시오.
    참고: 주기적인 밀링 된 선은 이미징 각도의 함수로 다른 색상을 초래하는 굴절 효과를 초래합니다. 색상이 프로브와 함께 연속되지 않으면 밀링 된 라인의 중단을 명확하게 나타냅니다.

5. FIB 에칭을위한 기능성 실리콘 프로브 장착

  1. 포장에서 기능성 실리콘 전극을 부드럽게 제거합니다. 집게를 사용하여 머리 스테이지를 덮는 플라스틱 보호 탭을 조심스럽게 들어 올립니다. 탭의 한 쪽 모서리를 끈적끈적한 접착제에서 위로 들어 올리고 전체 전극이 제거될 때까지 계속 들어 올리십시오.
  2. 조심스럽게 스테레오 탁시 프레임에 장착 준비를 hemostats와 전극을 고정합니다. 덮개가 있는 탭을 집게로 잡고 실리콘 생크 위의 녹색 샤프트 주위에 곡선 지혈을 부드럽게 놓고, 지주의 곡선 부분이 탭을 향해 위쪽으로 향하도록 합니다. 지혈.
  3. 헤드 스테이지를 덮는 플라스틱 보호 탭을 부드럽게 제거합니다. 지혈대와 전극을 들고있는 동안 조심스럽게 청소를위한 스테레오 택시 프레임에 전극을 클립.
  4. 페트리 요리 3개에 95% 에탄올(페트리 접시당 ~10mL)을 채웁니다. 페트리 접시를 스테레오탁스 프레임에 장착된 전극 아래에 놓고 청소합니다. 생크가 95% 에탄올에 잠기게 되도록 마이크로 매니퓰레이터를 아래쪽으로(100 μm/s)로 돌려 전극을 천천히 낮춥니다.
    참고 : 마이크로 매니퓰레이터가 너무 빠르거나 너무 깊지 않도록주의하십시오.이 경우 전극이 파손 될 수 있습니다 (즉, 전극이 페트리 접시를 만지지 않아야합니다).
  5. 전극 생크를 95% 에탄올에 5분 동안 방치한 다음 마이크로 매니퓰레이터를 위쪽으로(100 μm/s)로 돌려 95% 에탄올에서 전극을 천천히 올립니다. 이 단계를 두 번 더 반복하여 총 3번의 세차면 됩니다. 전극이 5분 동안 공기 건조되도록 하십시오.
  6. 스테레오탁스 프레임에 전극을 장착하고, 스테레오탁스 프레임에서 전극을 제거하는 것과 동일한 기술을 사용한다. 전극의 샤프트 주위에 지혈을 조심스럽게 배치하십시오. 지혈이 단단히 고정되면 스테레오택시 프레임에서 전극을 분리하고 헤드 스테이지를 덮는 플라스틱 보호 탭을 반환하고 청소 된 전극을 포장에 다시 넣습니다.

6. FIB를 이용한 에칭 기능성 실리콘 프로브

  1. 세척된 기능성 실리콘 전극을 알루미늄 스탠드에 장착합니다. 집게를 사용하여 청소 된 기능성 실리콘 전극을 조심스럽게 선택하고 헤드 스테이지에서 보호 탭을 제거하십시오. 전극 생크를 알루미늄 스텁에 놓고 가장자리에 걸리지 않도록 한 다음 작은 Cu 또는 탄소 전도성 테이프를 사용하여 헤드 스테이지를 알루미늄 스텁에 단단히 고정합니다.
    참고: 로우 프로파일 클립 홀더를 사용하여 전극을 누비게 할 수도 있습니다. 전극 생크를 만지지 않도록 주의하십시오.
  2. 위에서 설명한 단계(섹션 2)에 따라 전극을 유중심 높이에 놓고 전극이 SEM 및 FIB 빔의 우연의 일치 지점에 있는지 확인합니다. 생크를 스테이지의 "X" 방향에 맞춥습니다.
  3. 필요한 나노 아키텍처를 밀링하기 위한 최적의 전류로 FIB를 설정하고 초점과 오명이 제대로 수정되었는지 확인합니다. 생크(500 μm 섹션)의 시야를 커버하기 위해 원하는 간격과 길이가 있는 선 배열을 준비합니다. 에칭이 더 얇은 섹션으로 생크아래로 내려감에 따라 선 길이를 조정합니다.
    참고: 기능전극을 에칭할 때 는 공정을 자동화하기 위해 fiducial 마크를 추가할 수 없습니다. 따라서 하위 섹션(~500 μm) 사이를 수동으로 이동합니다.
  4. 첫 번째 섹션의 밀링이 완료된 후 다음 섹션으로 이동하기 전에 밀링 품질을 확인하십시오. 6.3 단계를 반복하여 생크의 다음 섹션을 에칭합니다. 이전 단면의 밀링된 선을 다음 단면에 사용되는 패턴에 맞추어 런 사이에 큰 간격이 발생하지 않도록 합니다.

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결과

단일 생크 내외 프로브 표면에 FIB 에칭 나노 아키텍처
여기서 설명된 방법을 활용하여, 피질 내 프로브는 확립된프로토콜(39)에따른 특정 나노 아키텍처로 에칭되었다. 이러한 방법에 기재된 나노 아키텍처 설계의 치수 및 형상은 여기에 설명된 나노 아키텍처 설계와 배양시 신경교 세포 반응성의 감소를 도시한 시험관내 이전 결과로부터 구현되었다...

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토론

여기에 설명된 제조 프로토콜은 집중된 이온 빔 리소그래피를 사용하여 비기능적이고 기능적인 단일 생크 실리콘 마이크로 전극의 표면에 나노 아키텍처를 효과적이고 재현가능하게 식각합니다. 초점 이온 빔(FIB) 리소그래피는 미세하게 집중된 이온빔(50,51)을이용하여 기판 표면의 선택적 절제를 허용한다. FIB는 나노 스케일 해상도와 높은 종횡비

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공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 연구는 미국(미국) 재향 군인 재활 연구 및 개발 서비스 상(#RX001664-01A1(CDA-1, Ereifej) 및 #RX002628-01A1(CDA-2, Ereifej)에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 미국 재향군인회 또는 미국 정부의 견해를 나타내지 않습니다. 저자는 FEI Co. (지금 Thermofisher 과학의 일부) 직원 지원 및 계측의 사용에 감사드립니다, 이는이 연구에 사용되는 스크립트를 개발하는 데 도움이.

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자료

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16-Channel ZIF-Clip HeadstageTucker Davis TechnologiesZC16The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
1-meter cable, ALL spring wrappedThomas Scientific1213F04Any non treated petri dish will suffice. https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Cell-Culture-Dishes/_/Non-Treated-Petri-Dishes?q=petri%20dish%20cell%20culture
32-Channel ZIF-Clip Headstage HolderTucker Davis TechnologiesZ-ROD32The headstage and headstage holder may need to be changed, depending on the electrode used. https://www.tdt.com/zif-clip-digital-headstages.html
Acetone, Thinner/Extender/Cleaner, 30mlTed Pella16023https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
Baby-Mixter HemostatFine Science Tools13013-14Any curved hemostat will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Hemostats/Baby-Mixter-Hemostat
Carbon Conductive Tape, Double CoatedTed Pella16084-7The protocol suggested three options for mounting the functional electrode to the aluminum stub (copper or carbon conductive tape or a low profile clip. We utilized the carbon conductive tape in our study. https://www.tedpella.com/semmisc_html/semadhes.htm
Corning Costar Not Treated Multiple Well Plates - 6 wellSigma AldrichCLS3736-100EAAny non-treated 6 well plate will suffice. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/
Dumont #5 Fine ForcepsFine Science Tools11251-30Either this fine forceps or the vacuum pump will suffice. https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-5-Forceps/11251-30
Ethanol, 190 proof (95%), USP, Decon LabsFisher Scientific22-032-600Any 95% ethanol will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-190-proof-95-usp-decon-labs-10/22032600
Falcon Cell StrainerFisher Scientific08-771-1https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
FEI, Tescan, Zeiss (also for Philips, Leo, Cambridge, Leica, CamScan), aluminum, grooved edge, Ø32mmTed Pella16148Depending on the SEM machine used, you may need a different size stub. https://www.tedpella.com/SEM_html/SEMpinmount.htm#_16180
Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-gauge rollFisher Scientific01-213-101Any aluminum foil will suffice. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-aluminum-foil-7/p-306250
Fisherbrand Low- and Tall-Form PTFE Evaporating DishesFisher Scientific02-617-149Any Teflon plate will suffice, this is used to dry the probes after washing on a surface they will not stick onto. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-tall-form-ptfe-evaporating-dishes-12/p-88552
Michigan-style silicon functional electrodeNeuroNexusA1x16-3mm-100-177http://neuronexus.com/electrode-array/a1x16-3mm-100-177/
Model 1772 Universal holderKOPFModel 1772Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Model 900-U Small Animal Stereotaxic InstrumentKOPFModel 900-UOther stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-900-small-animal-stereotaxic-instrument1/
Model 960 Electrode Manipulator with AP Slide AssemblyKOPFModel 960Other stereotaxic frames and accessories will suffice. http://kopfinstruments.com/product/model-1772-universal-holder/
Parafilm M 10cm x 76.2m (4" x 250')Ted Pella807-5https://www.tedpella.com/grids_html/807-2.htm
PELCO Vacuum Pick-Up System, 220VTed Pella520-1-220Either this vacuum pump or the fine forceps will suffice. http://www.tedpella.com/grids_html/Vacuum-Pick-Up-Systems.htm#anchor-520
PELCO Conductive Silver PaintTed Pella16062https://www.tedpella.com/SEMmisc_html/SEMpaint.htm#anchor16062
SEM FIB FEI Helios 650 NanolabThermo Fisher ScientificHelios G2 650This is the specific focused ion beam and scanning electron microscope used in the protocol. The Nanobuilder software is what it comes with. If a different FIB instrument is used, it may not be completely compatible with the protocol, specifically the steps requiring the Nanobuilder software. https://www.fei.com/products/dualbeam/helios-nanolab/

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