Un ensayo mejorado basado en proteínas de fluorescencia verde para el estudio del crecimiento de neurita en las neuronas primarias

Resumen

En este informe, describimos un protocolo simple para estudiar el crecimiento de neurita en neuronas corticales de rata embrionaria mediante la co-transfección con EGFP y la proteína de interés.

Resumen

El crecimiento de neurita es un evento fundamental en la formación de los circuitos neuronales durante el desarrollo del sistema nervioso. El daño grave a la neurita y la disfunción sináptica ocurren en diversas enfermedades neurodegenerativas y en la degeneración relacionada con la edad. La investigación de los mecanismos que regulan el crecimiento de las neuritas no sólo arrojaría una valiosa luz sobre los procesos de desarrollo cerebral, sino también sobre estos trastornos neurológicos. Debido a la baja eficiencia de transfección, actualmente es difícil estudiar el efecto de una proteína específica en el crecimiento de neurita en las neuronas primarias de mamíferos. Aquí, describimos un método simple para la investigación del crecimiento de neurita por la co-transfección de neuronas corticales de rata primaria con EGFP y una proteína de interés (POI). Este método permite la identificación de las neuronas transfectó el PDI a través de la señal EGFP, y por lo tanto el efecto del PDI en el crecimiento de neurita se puede determinar con precisión. Este ensayo basado en el EGFP proporciona un enfoque conveniente para la investigación de vías que regulan el crecimiento de las neuritas.

Introducción

Los neuritas, incluyendo axones y dendritas, son las proyecciones de las neuronas implicadas en el establecimiento de las redes neuronales. El crecimiento dinámico de los neurótesis es esencial para el neurodesarrollo. Sin embargo, los mecanismos reglamentarios subyacentes que hay debajo siguen sin estar claros. En particular, el daño de neurita se observa a menudo en varias enfermedades neurodegenerativas y después de lesiones cerebrales¹. Por lo tanto, la investigación de los roles de las moléculas putativas en varias vías reguladoras de crecimiento de neurita mejoraría nuestra comprensión del proceso. Por otra parte, puede revelar nuevas dianas terapéuticas para diversos trastornos neurológicos. Las líneas celulares neuronales son modelos valiosos para estudiar los procesos neuronales, incluido el crecimiento de neurita, ya que son fáciles de manipular y transfectar^2,3. Sin embargo, se ha informado que la deriva genética ocurre en algunas líneas celulares de uso común, lo que podría conducir a variaciones en sus respuestas fisiológicas⁴. Además, se ha demostrado la expresión diferencial de proteínas entre las líneas celulares neuronales y las neuronas primarias. Por ejemplo, PC12, una línea celular neuronal derivada de la glándula suprarrenal de rata que se utiliza ampliamente para el estudio de crecimiento de neurita^2,3, no expresa los receptores NMDA⁵. Además, se ha propuesto que la menor capacidad de respuesta de la línea de neuroblastoma de ratón neuro-2a a las neurotoxinas en comparación con las neuronas primarias se debe a la falta de expresión de ciertos receptores de membrana y canales iónicos^6. Por lo tanto, las neuronas primarias son un modelo más deseable y representativo para la investigación del crecimiento de neurita. Sin embargo, el uso de neuronas primarias se ve obstaculizado por su baja eficiencia de transfección⁷.

Aquí, describimos un método que implica la co-transfección de la proteína de interés (POI) y EGFP a las neuronas corticales de rata primarias. El EGFP actúa como un marcador morfológico para la identificación de las neuronas transpiradas con éxito y permite la medición de neurítos. Validamos este método mediante el uso de compuestos/moléculas que se han informado para modular el crecimiento de neurita. Además, FE65, una proteína adaptadora neuronal que se ha demostrado para estimular el crecimiento de neurita, se utilizó para ilustrar este enfoque^8,9. Este protocolo implica (1) el aislamiento de las neuronas corticales primarias de embriones embrionarios embrionarios embrionarios embrionarios del día 18 (E18), (2) la co-transfección de neuronas con EGFP y el PDI (FE65 en este estudio) y (3) la toma de imágenes y el análisis de las neuronas mediante el procesamiento de imágenes software ImageJ con el plugin NeuronJ^10,11.

Protocolo

Todos los procedimientos seguidos se ajustaron a las normas éticas del comité de ética de experimentación animal de la Universidad China de Hong Kong.

1. Preparación de Coverslips

1. Coloque un cubreobjetos circular escorazado de 18 mm en cada pocal de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos.
2. Cubra el cubreobjetos con una solución de poli-D-lisina de 5 g/ml en una incubadora humidificada de 37 oC durante al menos 1 h.
3. Aspirar la solución de poli-D-lisina de la placa de cultivo de tejido y enjuagar los cubrecubiertas recubiertos una vez con agua estéril.

2. Disección de neuronas embrionarias de rata

1. Sacrificar una rata Sprague-Dawley embarazada embarazada a una edad gestacional de 18 días (E18) por luxación cervical o asfixia por_CO2.
   NOTA: Consulte la normativa local para el sacrificio de ratas embarazadas.
2. Abra la cavidad abdominal de la rata embarazada con tijeras disalizantes y transfiera el útero a un plato Petri de 10 cm.
3. Abra el útero y el saco amniótico cuidadosamente con pequeñas tijeras disembrantes y retire la placenta del embrión de rata usando tijeras disecantes pequeñas. Transfiera todo el embrión a una placa Petri de 10 cm con solución salina tamponada de fosfato preenfriado suplementada con glucosa (PBS-glucosa, fosfatos sódicos de 10 mM, cloruro de potasio de 2,68 mM, cloruro sódico de 140 mM y glucosa de 3 g/L) utilizando un par de pequeños fórceps.
4. Corta a lo largo de la sutura sagital del cráneo y ábrela cuidadosamente con un par de tijeras disecuentes pequeñas. Transfiera el cerebro embrionario con una pequeña espátula plana a una placa Petri de 10 cm con PBS-glucosa helada.
5. Separe los dos hemisferios cerebrales del cerebelo y el tallo cerebral usando dos pinzas #5 bajo un microscopio de disección.
   NOTA: Consulte la referencia¹² para la estructura del cerebro de la rata.
6. Retire las meninges con las pinzas #5.
7. Aísle la corteza de los hemisferios cerebrales con dos pinzas rectas #5.
8. Transfiera la corteza aislada a PBS-glucosa helada en un tubo centrífugo de 15 ml.

3. Cultivo primario de neuronas corticales

NOTA: Todos los procedimientos de los pasos 3 y 4 se realizan dentro de un gabinete de Bioseguridad Clase II.

1. Asentar la corteza aislada por gravedad a 4 oC durante 5 min y aspirar la PBS-glucosa.
2. Añadir 1 mL de 0,05% de trippsina-EDTA a la corteza aislada y mezclar suavemente tocando e incubar el tejido en un baño de agua de 37 oC durante 10 minutos para permitir la digestión enzimática. Toque suavemente el tubo para mezclar cada 2 minutos.
3. Añadir 4 ml de medio de mantenimiento (p. ej., medio neurobasal) a la mezcla de tejido/trippsina.
   NOTA: Todo el medio de mantenimiento utilizado en este protocolo se complementa con Penicilina-Streptomicina y suplemento B-27^13.
4. Disociar el tejido suavemente mediante la trituración utilizando una pipeta de 1 ml.
5. Pellet las células disociadas por centrifugación a 200 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
6. Repita los pasos 3.5 a 3.7 dos veces.
7. Resuspender el pellet celular en 1 ml de medio de mantenimiento.
8. Añadir 10 l de solución de Trypan Blue al 00 l de suspensión celular para el recuento de células viables por un hemocitómetro.
9. Placa las neuronas a una densidad de 65,000/cm² (células viables) en 1 ml de medio de mantenimiento por pozo en una placa de 12 pocillos.

4. Transfección y fijación celular

1. A los 2 días in vitro (DIV2), transfecto 0,5 g de construcción de EGFP (pEGFP-C1) a neuronas junto con o sin 0,5 g de PDI mediante el uso de 1 l de reactivo de transfección (p. ej., Lipofectamine 2000). Siga las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Las construcciones de expresión de mamíferos se prepararon utilizando un kit de preparación de plásmido libre de endotoxinas. El tratamiento con productos químicos/moléculas (en este manuscrito se utilizaron citoclasina D (Cito D) y factor de crecimiento nervioso (NGF)) a las 6 h después de la transfección.
2. Aspirar el medio de cultivo 24 h después de la transfección y lavar las células transfectótas una vez con PBS de 37 oC (10 mM de fosfatos sódicos, 2,68 mM de cloruro de potasio, 140 mM de cloruro sódico).
3. Fijar las células con 4% de paraformaldehído en PBS durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
4. Lave las células fijas tres veces con PBS.
5. Agregue una cantidad mínima de medio de montaje de fluorescencia en una diapositiva de vidrio del microscopio. Transfiera cuidadosamente el cubreobjetos de la placa de 12 pocillos al medio de montaje con la muestra mirando hacia el portaobjetos de vidrio.
   NOTA: Selle el borde de la cubierta con esmalte de uñas si se utiliza un medio de montaje acuoso.

5. Medición del crecimiento de Neurita

1. Utilice un objetivo de 40x para capturar imágenes utilizando un microscopio epifluorescente.
2. Captura imágenes de al menos 40 neuronas intactas con señal EGFP por transfección.
3. Abra la imagen capturada en el software ImageJ con el plugin NeuronJ¹¹ para medir la longitud de la neurita más larga, desde el cuerpo celular hasta la punta del cono de crecimiento, de cada neurona con imagen.
4. Analizar los datos obtenidos con el software para determinar el efecto de las proteínas objetivo en el crecimiento de neurita.

Resultados

Para probar esta metodología, utilizamos Cyto D y factor de crecimiento nervioso NGF, que se ha demostrado para inhibir y estimular el crecimiento de neurita respectivamente^14,15,16. La longitud de neurita de las neuronas transtrófilos o infectadas por la EFP se midió después del tratamiento con Cito D o NGF. La eficiencia de transfección de EGFP a las neuronas fue del 2,7% (1.068 neuronas c...

Discusión

Como se ha dicho antes, PC12 y sus subclones son ampliamente empleados para el estudio de la extensión de neurita porque tienen una excelente eficiencia de transfección^2,3. Por el contrario, las neuronas primarias tienen una baja tasa de transfección, que es un obstáculo importante para el estudio de los reguladores de crecimiento de neurita por transfección⁷. Aquí, describimos un protocolo conveniente para cuantificar el crecimiento...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061