Улучшенный зеленый флуоресценции белка основе Анализ для изучения Neurite Outgrowth в первичных нейронов

Резюме

В этом отчете мы описываем простой протокол для изучения невритовых наростов эмбриональных крысиных корковых нейронов путем совместного перевода с EGFP и белка, интересующего.

Аннотация

Невритный рост является фундаментальным событием в формировании нейронных цепей при развитии нервной системы. Тяжелые повреждения неврита и синаптической дисфункции происходят при различных нейродегенеративных заболеваниях и возрастной дегенерации. Исследование механизмов, которые регулируют невритный рост будет не только пролить ценный свет на процессы развития мозга, но и на такие неврологические расстройства. Из-за низкой эффективности трансфекции, в настоящее время сложно изучить влияние конкретного белка на нейрит нарост в первичных нейронов млекопитающих. Здесь мы описываем простой метод исследования невритовых наростов путем со-трансфекции первичных крысиных корковых нейронов с EGFP и белка, представляющих интерес (POI). Этот метод позволяет идентифицировать POI трансинфицированных нейронов через сигнал EGFP, и, таким образом, влияние POI на неврит рост может быть определена точно. Этот результат на основе EGFP обеспечивает удобный подход для исследования путей, регулирующих неврит.

Введение

Нейриты, включая аксоны и дендриты, являются проекциями нейронов, участвующих в создании нейронных сетей. Динамический рост невритов необходим для нейроразвития. Однако основные механизмы регулирования, лежащие в основе, остаются неясными. В частности, повреждение неврита часто наблюдается при различных нейродегенеративных заболеваниях и после травм головного мозга^1. Таким образом, исследование роли индикативных молекул в различных невритовых путях роста улучшило бы наше понимание процесса. Кроме того, он может выявить новые терапевтические цели для различных неврологических расстройств. Нейронные клеточные линии являются ценными моделями для изучения нейронных процессов, включая невритовый рост, поскольку они легко манипулировать и трансфекта^2,3. Тем не менее, генетический дрейф, как сообщается, происходит в некоторых широко используемых клеточных линий, которые могут привести к изменениям в их физиологических реакций⁴. Кроме того, дифференциальная экспрессия белка была показана между нейрональными клеточными линиями и первичными нейронами. Например, PC12, нейрональной линии клеток, полученных из крыс надпочечников, которая широко используется для изучения неврит овых^2,3, не выражает NMDA рецепторов⁵. Кроме того, было предложено, что снижение отзывчивости линии нейробластомы мыши нейробластомы нейро-2а к нейротоксинам по сравнению с первичными нейронами связано с отсутствием экспрессии определенных мембранных рецепторов и ионных каналов^6. Таким образом, первичные нейроны являются более желательной и репрезентативной моделью для исследования невритовых наростов. Тем не менее, использование первичных нейронов препятствует их низкой эффективностью трансфекции^7.

Здесь мы описываем метод, который включает в себя совместное трансфекцию белка, представляющих интерес (POI) и EGFP для первичных крыс корковых нейронов. EGFP действует как морфологический маркер для идентификации успешно трансинфицированных нейронов и позволяет измерять невриты. Мы подтвердили этот метод с помощью соединений / молекул, которые, как сообщается, модулировать неврит нарастания. Кроме того, FE65, нейрональный адаптер белка, который, как было показано, стимулировать неврит нарост, был использован, чтобы проиллюстрировать этот подход^8,9. Этот протокол включает в себя (1) изоляцию первичных корковых нейронов от эмбриональных эмбрионов 18 (E18) крысиных эмбрионов, (2) совместное трансфекцию нейронов с EGFP и POI (FE65 в данном исследовании) и (3) визуализацию и анализ нейронов с помощью обработки изображений программное обеспечение ImageJ с плагином NeuronJ^10,11.

протокол

Все последующие процедуры соответствовали этическим стандартам комитета по этике экспериментов на животных Китайского университета Гонконга.

1. Подготовка заедок

1. Поместите стерильный 18-мм круговой покрывало в каждый колодец 12-хорошей пластины культуры тканей.
2. Пальто coverslip с 5 мг /мл поли-D-лизин раствор в увлажненный 37 C инкубатор, по крайней мере 1 ч.
3. Аспирировать поли-D-лизина раствор из ткани культуры пластины и промыть покрытием охватывает один раз со стерильной водой.

2. Крыса эмбрионального нейронов Рассечение

1. Пожертвуйте приурочен-беременной крысы Sprague-Dawley в гестационном возрасте 18 дней (E18) либо вывихшей шейки матки или CO₂ удушья.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, проверьте местные правила для жертвоприношения беременных крыс.
2. Откройте брюшную полость беременной крысы рассекающими ножницами и перенесите матку на 10 см чашку Петри.
3. Откройте матку и амниотический мешок тщательно с небольшими вскрытия ножницами и удалить плаценту из эмбриона крысы с помощью небольших вскрытия ножницами. Перенесите весь эмбрион в 10-сантиметровую чашку Петри с предварительно охлажденным фосфатным солевым раствором, дополненным глюкозой (PBS-глюкоза, 10 мМ фосфатов натрия, 2,68 мм хлорид калия, 140 мМ хлорид натрия и 3 г/л глюкозы) с помощью пары небольших щипц.
4. Вырежьте вдоль сагитального шва черепа и тщательно откройте его парой маленьких рассекающих ножниц. Перенесите эмбриональный мозг с помощью небольшого плоского шпателя в 10-сантиметровую чашку Петри с ледяной PBS-глюкозой.
5. Отделите два полушария головного мозга от мозжечка и ствола мозга, используя два #5 пинцета под микроскопом вскрытия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите ссылку¹² для структуры мозга крысы.
6. Удалите оленя с помощью #5 пинцетом.
7. Изолировать кору из полушарий головного мозга двумя прямыми #5 пинцетом.
8. Перенос изолированной коры на ледяную PBS-глюкозу в центрифуге мощностью 15 мл.

3. Первичная кортикальная культура нейронов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в шагах 3 и 4 выполняются в шкафу биобезопасности класса II.

1. Поселите изолированную кору под действием силы тяжести при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут и аспирируй PBS-глюкозу.
2. Добавьте 1 мл 0,05% трипсин-ЭДТА в изолированную кору и аккуратно перемешайте, нажав и инкубировать ткани в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы обеспечить ферментативное пищеварение. Нажмите трубку осторожно, чтобы смешивания каждые 2 мин.
3. Добавьте 4 мл среднего обслуживания (например, Нейробазальная среда) в ткань/трипсинную смесь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вся среда обслуживания, используемая в этом протоколе, дополняется пенициллином-стрептомицином и B-27^{дополнением 13.}
4. Мягко отмежевать ткань путем тритурации с помощью 1 мл пипетки.
5. Пеллети разрозненные клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант.
6. Повторите шаги от 3,5 до 3,7 дважды.
7. Отрежь пеллетку клетки в 1 мл среды обслуживания.
8. Добавьте 10 qL 0.4% Трипан Синий раствор 10 зл и суспензии клеток для подсчета жизнеспособных клеток гемоситометром.
9. Плита нейронов при плотности 65000/cm² (жизнеспособные клетки) в 1 мл поддержания среднего в хорошо в 12-хорошо пластины.

4. Трансфекция и фиксация клеток

1. В течение 2 дней in vitro (DIV2) трансфект 0,5 мкг конструкции EGFP (pEGFP-C1) к нейронам вместе либо с 0,5 мкг POI с помощью 1 зЛ реагента трансфекционного реагента (например, Липофектамин 2000). Используйте инструкции производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Mammalian выражении конструкции были подготовлены с помощью эндотоксина свободной плазмид подготовки комплекта. Лечение химическими веществами/молекулами (в этой рукописи использовались цитошалазин D (Cyto D) и фактор роста нервов (NGF) можно сделать на 6 ч после трансфекции.
2. Призадыхать культуры среды 24 ч после трансфекции и мыть транс-инфицированных клеток один раз с 37 КС PBS (10 мМ фосфатов натрия, 2,68 мм хлорид калия, 140 мм хлорид натрия).
3. Исправить клетки с 4% параформальдегида в PBS в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре.
4. Вымойте фиксированные клетки три раза с ПОМОЩЬю PBS.
5. Добавьте минимальное количество флуоресценции монтажсреды на микроскоп стеклянной слайд. Аккуратно перенесите крышку из 12-колодца на монтажную среду с образцом, обращенным к стеклянной горке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Печать края крышки с лаком для ногтей, если aqueous монтаж среды используется.

5. Измерение нейрита

1. Используйте 40-кратный объектив для захвата изображений с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
2. Захват изображений, по крайней мере 40 нетронутых нейронов с сигналом EGFP на трансфекцию.
3. Откройте захваченное изображение в программном обеспечении ImageJ с плагином NeuronJ¹¹ для измерения длины самого длинного нейрита, от клеточного тела до кончика конуса роста, каждого изображенного нейрона.
4. Проанализируйте данные, полученные с помощью программного обеспечения, чтобы определить влияние целевых белков в невритовых нарастаниях.

Результаты

Чтобы проверить эту методологию, мы использовали Cyto D и фактор роста нерва NGF, которые, как было показано, ингибируют и стимулируют невритный рост соответственно^14,15,16. Длина неврита нейронов, трансфицированных EGFP, измер...

Обсуждение

Как указывалось ранее, PC12 и его подклоны широко используются для изучения расширения неврита, потому что они имеют отличную эффективность трансфекции^2,3. В отличие от этого, первичные нейроны имеют низкий уровень трансфекции, который является основным пр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061