Um ensaio com base em proteínas de fluorescência verde reforçada para estudar o crescimento do neurite em neurônios primários

Resumo

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo simples para estudar o conseqüência do neurite em neurônios corticais do rato embrionário cotransfecting com EGFP e a proteína do interesse.

Resumo

O conseqüência do neurite é um evento fundamental na formação dos circuitos neural durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Dano de neurite severo e disfunção sináptica ocorrem em várias doenças neurodegenerativas e degeneração relacionada à idade. A investigação dos mecanismos que regulam o conseqüência do neurite não somente derramaria a luz valiosa em processos desenvolventes do cérebro mas igualmente em tais desordens neurológicas. Devido à baixa eficiência do transfection, é atualmente desafiante estudar o efeito de uma proteína específica no conseqüência do neurite em neurônios mamíferos preliminares. Aqui, nós descrevemos um método simples para a investigação do conseqüência do neurite pelo co-transfection de neurônios corticais do rato preliminar com EGFP e uma proteína do interesse (POI). Este método permite a identificação de neurônios transfected do POI através do sinal de EGFP, e assim o efeito do POI no conseqüência do neurite pode ser determinado precisamente. Este ensaio baseado em EGFP fornece uma aproximação conveniente para a investigação dos caminhos que regulam o outgrowth do neurite.

Introdução

Neurites, incluindo os axônios e dendritos, são as projeções de neurônios envolvidos no estabelecimento das redes neurais. O crescimento dinâmico dos neuritos é essencial para o neurodesenvolvimento. No entanto, os mecanismos regulamentares subjacentes permanecem pouco claros. Em particular, o dano de neurite é freqüentemente observado em várias doenças neurodegenerativas e após lesões cerebrais¹. Portanto, a investigação dos papéis de moléculas putativas em várias vias regulatórias de crescimento de neurite melhoraria nossa compreensão do processo. Além disso, pode revelar alvos terapêuticos novos para várias desordens neurológicas. As linhas celulares neuronais são modelos valiosos para estudar processos neuronais, incluindo o crescimento de neurite, pois são fáceis de manipular e transfecção^2,3. No entanto, a deriva genética tem sido relatada a ocorrer em algumas linhas celulares comumente usadas, o que pode levar a variações em suas respostas fisiológicas⁴. Além disso, a expressão diferencial da proteína foi mostrada entre linhas de pilha neuronal e neurônios preliminares. Por exemplo,^{PC12, uma}linha celular neuronal derivada da glândula adrenal do rato que é amplamente utilizada para estudar o conseqüência do neurite^{2,3, não}expressa receptores NMDA⁵. Além disso, tem sido proposto que a responsividade reduzida da linha neuro-2a neuroblastoma mouse para neurotoxinas em comparação com os neurônios primários é devido à falta de expressão de certos receptores de membrana e canais iônicos⁶. Conseqüentemente, os neurônios preliminares são um modelo mais desejável e representativo para a investigação do outgrowth do neurite. No entanto, o uso de neurônios primários é dificultado pela sua baixa eficiência de transfecção⁷.

Aqui, nós descrevemos um método que envolva o co-Transfection da proteína do interesse (POI) e do EGFP aos neurônios corticais principais do rato. O EGFP atua como um marcador morfológico para a identificação de neurônios transfectados com sucesso e permite a mensuração de neuritos. Nós validamos este método usando compostos/moléculas que foram relatadas para modular o outgrowth do neurite. Além disso, FE65, uma proteína do adaptador neuronal que seja mostrada para estimular o outgrowth do neurite, foi usada para ilustrar esta aproximação^8,9. Este protocolo envolve (1) o isolamento de neurônios corticais primários de embriões de ratos do dia embrionário 18 (E18), (2) a cotransfecção de neurônios com EGFP e o POI (FE65 neste estudo) e (3) a imagem e análise dos neurônios usando o processamento de imagens software ImageJ com o plugin NeuronJ^10,11.

Protocolo

Todos os procedimentos seguidos estavam de acordo com os padrões éticos do Comitê de ética em experimentação animal da universidade chinesa de Hong Kong.

1. preparação de COVERSLIP

1. Coloque uma lamínula circular estéril de 18 mm em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços.
2. Cubra a lamínula com 5 μg/mL de solução de poli-D-lisina em uma incubadora humidificada de 37 ° c por pelo menos 1 h.
3. Aspirar a solução de poli-D-lisina da placa de cultura do tecido e enxaguar as coberturas revestidas uma vez com água estéril.

2. dissecção do Neuron embrionário do rato

1. Sacrifique um rato de Sprague-Dawley cronometrado-grávido em uma idade gestational de 18 dias (E18) pela deslocação cervical ou pelo Asphyxiation do CO₂ .
   Nota: Por favor, verifique os regulamentos locais para o sacrifício de ratos grávidas.
2. Abra a cavidade abdominal do rato grávido com tesouras de dissecação e transfira o útero a um prato de Petri de 10 cm.
3. Abra o útero e o saco amniótico com cuidado com as tesouras de dissecação pequenas e remova a placenta do embrião do rato usando tesouras de dissecação pequenas. Transfira todo o embrião para uma placa de Petri de 10 cm com soro pré-resfriado com tampão de fosfato suplementado com glicose (PBS-glicose, 10 mM fosfatos de sódio, cloreto de potássio 2,68 mM, cloreto de sódio de 140 mM e 3 g/L de glicose) usando um par de fórceps pequeno.
4. Corte ao longo da sutura sagital do crânio e abra-o com cuidado com um par de tesouras de dissecação pequenas. Transfira o cérebro embrionário com uma pequena espátula plana para um prato de Petri de 10 cm com PBS-glicose gelada.
5. Separe os dois hemisférios cerebrais do cerebelo e do tronco cerebral usando duas pinças #5 um microscópio de dissecção.
   Nota: Por favor, veja referência¹² para a estrutura do cérebro de rato.
6. Retire as meninges usando a pinça #5.
7. Isole o córtex dos hemisférios cerebrais com duas pinças #5 retas.
8. Transfira o córtex isolado para a PBS-glicose gelada em um tubo de centrífuga de 15 mL.

3. cultura primária do Neuron cortical

Nota: Todos os procedimentos nas etapas 3 e 4 são realizados dentro de um gabinete de biossegurança classe II.

1. Liquidar o córtex isolado por gravidade a 4 ° c por 5 min e aspirar a PBS-glicose.
2. Adicione 1 mL de 0, 5% de Trypsin-EDTA ao córtex isolado e misture suavemente tocando e incubar o tecido em um banho de água de 37 ° c por 10 min para permitir a digestão enzimática. Bata suavemente no tubo para misturar a cada 2 min.
3. Adicionar 4 mL de meio de manutenção (por exemplo, meio Neurobasal) à mistura tecido/tripsina.
   Nota: Todo o meio de manutenção utilizado neste protocolo é complementado com penicilina-estreptomicina e B-27 suplemento¹³.
4. Dissociar o tecido suavemente por trituração usando uma pipeta de 1 mL.
5. Pellet as células dissociadas por centrifugação em 200 x g por 5 min. aspirar o sobrenadante.
6. Repita as etapas 3,5 a 3,7 duas vezes.
7. Ressuscitem o pellet celular em 1 mL de meio de manutenção.
8. Adicionar 10 μL de 0,4% de solução de trypan Blue a 10 μL de suspensão celular para contagem de células viáveis por um hemociômetro.
9. Placa os neurônios em uma densidade de 65.000/cm² (células viáveis) em 1 ml de meio de manutenção por poço em uma placa de 12 poços.

4. transfection e fixação da pilha

1. Aos 2 dias in vitro (DIV2), transfecção 0,5 μg do construto de EGFP (pegfp-C1) aos neurônios junto com ou sem de 0,5 μg de POI usando 1 μl do reagente do transfection (por exemplo, Lipofectamine 2000). Use as instruções do fabricante.
   Nota: Construções de expressão de mamíferos foram preparadas usando um kit de preparação de plasmídeo livre de endotoxina. O tratamento com produtos químicos/moléculas (Neste manuscrito citocalasina d (cyto d) e fator de crescimento do nervo (NGF) foi usado) pode ser feito em 6 h após o transfection.
2. Aspirar o meio de cultura 24 h pós-transfecção e lavar as células transfectadas uma vez com 37 ° c PBS (10 mM fosfatos de sódio, cloreto de potássio 2,68 mM, cloreto de sódio 140 mM).
3. Fixe as pilhas com o paraformaldeído de 4% em PBS por 10 minutos no escuro na temperatura ambiente.
4. Lave as células fixas três vezes com PBS.
5. Adicione uma quantidade mínima de meio de montagem de fluorescência em uma corrediça de vidro do microscópio. Transfira cuidadosamente a lamínula da placa de 12 poços para o meio de montagem com a amostra virada para a corrediça de vidro.
   Nota: Sele a borda do lamela com lustrador de prego se um meio de montagem aquoso é usado.

5. medição de neurite outgrowth

1. Use um objetivo de 40x para capturar imagens usando um microscópio EPI-fluorescente.
2. Capture imagens de pelo menos 40 neurônios intactos com sinal de EGFP por transfecção.
3. Abra a imagem capturada no software ImageJ com o plugin NeuronJ¹¹ para medir o comprimento do neurite mais longo, do corpo da célula até a ponta do cone de crescimento, de cada Neuron imaged.
4. Analise os dados obtidos com o software para determinar o efeito das proteínas alvejadas no crescimento do neurite.

Resultados

Para testar essa metodologia, utilizou-se o fator NGF de crescimento do cito D e do nervo, que demonstrou inibir e estimular o crescimento doneurite, respectivamente,^14,15,16. O comprimento do neurite dos neurônios transfected com EGFP foi medido após o tratamento com cyto D ou NGF. A eficiência do transfection de EGFP aos neurônios era 2,7% (1.068 neurônios contados). Como mostrado na

Discussão

Como afirmado antes, PC12 e seus subclones são amplamente empregados para estudar a extensão do neurite, pois têm excelente eficiência^detransfecção 2,3. Em contrapartida, os neurônios primários têm uma baixa taxa de transfecção, que é um grande obstáculo para o estudo dos reguladores de crescimento do neurite por transfecção⁷. Aqui, nós descrevemos um protocolo conveniente para quantificar o conseqüência do neurite em neu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061