增强的绿色荧光蛋白测定，用于研究原神经元的神经质生长

摘要

在本报告中，我们描述了一个简单的方案，通过与EGFP和感兴趣的蛋白质共同转染，研究胚胎大鼠皮质神经元中的神经质外生。

摘要

神经细胞生长是神经系统发育过程中神经回路形成的基本事件。严重的神经质损伤和突触功能障碍发生在各种神经退行性疾病和与年龄相关的退化。研究调节神经酸盐生长的机制，不仅会为大脑发育过程提供有价值的光，而且还可以揭示这些神经紊乱。由于转染效率低，目前研究特定蛋白质对原生哺乳动物神经元中神经质生长的影响具有挑战性。在这里，我们描述了一种通过与EGFP和感兴趣的蛋白质（POI）共同转染原发性大鼠皮质神经元来研究神经质外生的简单方法。该方法允许通过EGFP信号识别POI转染神经元，从而可以精确确定POI对神经质生长的影响。这种基于EGFP的测定为研究调节神经细胞生长的途径提供了一种方便的方法。

引言

神经酸盐，包括斧子和树突，是参与建立神经网络的神经元的投影。神经酸盐的动态生长对神经发育至关重要。然而，下面的基本监管机制仍不清楚。特别是，神经质损伤经常在各种神经退行性疾病和脑损伤后^{观察到1。}因此，研究假定分子在各种神经酸盐生长调节途径中的作用，将增进我们对该过程的理解。此外，它可能揭示各种神经疾病的新治疗目标。神经元细胞系是研究神经元过程的宝贵模型，包括神经质生长，因为它们易于操作和转^染2，3。然而，据报道，遗传漂移发生在一些常用的细胞系中，这可能导致其生理反应^{的变化4。}此外，在神经元细胞系和主神经元之间也显示了差异蛋白表达。例如，PC12，一种来自大鼠肾上腺的神经元细胞系，广泛用于研究神经质外^{生长2，3，}不表达NMDA^受体5。此外，据提出，与原发神经元相比，小鼠神经母细胞瘤线神经-2a对神经毒素的响应能力降低是由于某些膜受体和电^通道6缺乏表达。因此，原神经元是神经质生长研究更可取和更具代表性的模型。然而，主神经元的使用受到其低转染^效率7的阻碍。

在这里，我们描述了一种涉及感兴趣蛋白（POI）和EGFP与原发性大鼠皮质神经元共转染的方法。EGFP作为形态标记，用于识别成功转染的神经元，并允许测量神经酸盐。我们使用已报告的化合物/分子来调节神经酸盐生长，验证了这种方法。此外，FE65，一种神经元适配器蛋白，已被证明能刺激神经质生长，用于说明^{这种方法8，9。}该协议涉及 （1） 从胚胎第18天（E18）大鼠胚胎分离原发性皮质神经元，（2）与EGFP和POI（本研究中的FE65）共同转染神经元，以及（3）使用图像处理对神经元的成像和分析软件图像J与NeuronJ^{插件10，11。}

研究方案

所遵循的所有程序均符合香港中文大学动物实验伦理委员会的道德标准。

1. 准备盖玻片

1. 将无菌的 18 mm 圆形盖玻片放入 12 孔组织培养板的每个孔中。
2. 在加湿的 37°C 培养箱中用 5 μg/mL 多 D-莱金溶液涂抹盖玻片，至少 1 小时。
3. 从组织培养板中吸出多D-莱辛溶液，用无菌水冲洗一次涂层盖玻片。

2. 大鼠胚胎神经元解剖

1. 在妊娠年龄为18天（E18）时，通过宫颈脱位_或CO2窒息牺牲一只怀孕的斯普拉格-道利大鼠。
   注:请查看当地法规，了解怀孕大鼠的牺牲情况。
2. 用解剖剪刀打开怀孕大鼠的腹腔，将子宫转移到10厘米的培养皿中。
3. 用小解剖剪刀仔细打开子宫和羊水囊，用小解剖剪刀从大鼠胚胎中取出胎盘。使用一对小钳子将整个胚胎转移到10厘米培养皿中，并加用预先冷冻的磷酸盐缓冲盐水补充葡萄糖（PBS-葡萄糖，10mM磷酸钠，2.68m氯化钾，140 mM氯化钠和3克/升葡萄糖）。
4. 沿着头骨的下垂缝合线切开，用一把小解剖剪刀小心地打开它。用一个小平的铲子将胚胎大脑转移到一个10厘米的培养皿，带有冰冷的PBS-葡萄糖。
5. 在解剖显微镜下使用两个#5钳将两个大脑半球从小脑和脑干中分离出来。
   注:有关大鼠大脑的结构，请参阅参考^12。
6. 使用#5钳子去除脑膜炎。
7. 用两个直#5钳子将皮层与大脑半球分离。
8. 在15 mL离心管中将分离的皮层转移到冰冷的PBS-葡萄糖中。

3. 初级皮质神经元培养

注:步骤 3 和步骤 4 中的所有程序都在 II 类生物安全柜内执行。

1. 通过重力在4°C下稳定出分离的皮层5分钟，并吸出PBS-葡萄糖。
2. 将1 mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA加入分离的皮层，通过在37°C水浴中轻敲并孵育组织10分钟，从而进行酶消化，轻轻混合。轻轻敲击管子，每 2 分钟混合一次。
3. 在组织/胰蛋白酶混合物中加入4 mL的维持介质（例如，神经巴生介质）。
   注:该协议中使用的所有维护介质均辅以青霉素-链霉素和B-27^{补充剂13。}
4. 使用 1 mL 移液器通过三聚体轻轻地分离组织。
5. 在200 x g下离心5分钟，将分离的细胞压灭5分钟。
6. 重复步骤 3.5 到 3.7 两次。
7. 将细胞颗粒重新悬浮在1 mL的维护培养基中。
8. 将10μL的0.4%试青溶液加入10μL的细胞悬浮液中，通过血细胞计计算活细胞。
9. 在12孔板中，以65，000/cm^2（活细胞）的密度，每孔维持介质1mL的密度将神经元板。

4. 细胞转染和固定

1. 在2天体外（DIV2），通过1μL转染试剂（例如利泊胺2000），将EGFP结构（pEGFP-C1）转染为神经元，无论是否超过0.5μg的POI。使用制造商的说明。
   注:哺乳动物表达结构是使用无内毒素质粒制备试剂盒制备的。使用化学物/分子（本手稿中细胞沙沙沙辛 D （细胞D） 和神经生长因子 （NGF） 的治疗可在转染后 6 小时进行。
2. 转染后24小时吸出培养基，用37°C PBS（10mM磷酸钠、2.68mM氯化钾、140 mM氯化钠）洗涤转染细胞一次。
3. 在室温下，在PBS中用4%的甲醛将细胞固定10分钟。
4. 用PBS清洗固定细胞三次。
5. 在显微镜玻璃玻片上添加少量荧光安装介质。将盖玻片从 12 孔板小心地转移到安装介质上，样品面向玻璃滑块。
   注:如果使用水性安装介质，则用指甲油密封盖玻片的边缘。

5. 神经细胞生长的测量

1. 使用 40x 物镜使用外显荧光显微镜拍摄图像。
2. 每次转染时，使用 EGFP 信号从至少 40 个完整神经元捕获图像。
3. 使用 NeuronJ 插件¹¹在 ImageJ 软件中打开捕获的图像，以测量每个图像神经元从细胞体到生长锥尖的最长神经质的长度。
4. 分析使用软件获得的数据，以确定靶向蛋白在神经细胞生长中的影响。

结果

为了测试这种方法，我们使用细胞D和神经生长因子NGF，这已被证明分别抑制和刺激神经质生长14，15，16。使用EGFP转染的神经元的中性粒体长度在使用Cyto D或NGF治疗后被测量。EGFP对神经元的转染效率为2.7%（计算1，068个神经元）。如图1A所示，细胞D以剂量依赖性的方?...

讨论

如前所述，PC12及其子克隆被广泛用于研究神经酸盐延伸，因为它们具有优异的转染^{效率2，3。}相比之下，原发神经元的转染率较低，这是通过转^染7研究神经质生长调节器的主要障碍。在这里，我们描述了一个方便的协议，用于量化原始神经元中的神经质外生。尽管整体转染效率较低，但超过80%的转染神经元成功地与两种蛋白质共同转?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061