Estandarización de un método no letal para caracterizar el estado reproductivo y el desarrollo larvarios de los mejillones de agua dulce (Bivalvia: Unionida)

Resumen

La conservación del mejillón de agua dulce depende del monitoreo de los patrones y procesos reproductivos de las especies. Este estudio estandariza un protocolo no letal para tomar muestras de contenidos de branquias, caracterizar el desarrollo larvario y proporcionar un repositorio digital para los datos recopilados. Este paquete de protocolo-base de datos será una herramienta importante para los investigadores de mejillones en la recuperación de especies en busca.

Resumen

El monitoreo activo del momento, desarrollo y patrones reproductivos de las especies en peligro de extinción es fundamental a la hora de gestionar la recuperación de la población. Los mejillones de agua dulce se encuentran entre los organismos más peligrosos del mundo, pero todavía falta información sobre el desarrollo temprano de larvas (glochidial) y períodos de cría para muchas especies. Estudios anteriores se han centrado en la compleja etapa de la historia de la vida cuando las hembras de mejillones están listas para parasifiquen los peces huésped, pero pocos estudios se han centrado en el período de cría y el momento del desarrollo larvario. El protocolo descrito aquí permite a los investigadores evaluar no letalmente el estado de la gravididad de los mejillones femeninos. Los resultados de este estudio muestran que este método no afecta la capacidad de un mejillón femenino para permanecer gravid o volver a graviar después de que se haya realizado el muestreo. La ventaja de este método puede permitir su uso en especies amenazadas o en peligro de extinción federales u otras poblaciones de alta preocupación por la conservación. Este protocolo se puede adaptar para su uso tanto en individuos conservados como vivos y fue probado en una variedad de especies de mejillones. La base de datos proporcionada es un repositorio para una amplia gama de información sobre el momento de los hábitos reproductivos y facilitará futuros esfuerzos de investigación, conservación y recuperación del mejillón de agua dulce.

Introducción

La persistencia de las poblaciones en los sistemas de agua dulce depende del éxito de la reproducción y el reclutamiento. Para los organismos parásitos, identificar las complejidades del ciclo de vida (por ejemplo, etapas de desarrollo larvaria y estrategias de atracción de huéspedes) puede dar una idea de los hábitos reproductivos de un organismo y los procesos críticos que influyen en el reclutamiento. Esta información se vuelve importante cuando las especies están en proceso de enisuado, y se necesita un reclutamiento exitoso para sostener las poblaciones restantes, o si la recuperación requiere el uso de la propagación cautiva para restablecer las poblaciones extirpadas.

Los mejillones de agua dulce (Bivalvia: Unionida) son considerados uno de los grupos de organismos más peligrosos del mundo y una compilación de hábitos reproductivos específicos de especies podría ayudar en los esfuerzos de investigación^{1,2,3 ,4,5}. Con más de 800 especies actualmente reconocidas distribuidas en todo el mundo, los mejillones de agua dulce tienen puntos críticos de diversidad en América del Norte y del Sur, y el sudeste de Asia, pero la información esencial de la historia de la vida es desconocida para muchas especies^{2, 5,6,7}. Las familias dentro de este orden se caracterizan por tener etapas larvales parasitarias que completan la metamorfosis en juveniles de vida libre durante el apego a un huésped^7,8. Esta etapa única de la historia de la vida contribuye a la biodiversidad en los sistemas de agua dulce, que actualmente están en crisis^9. Los altos niveles de imperición pueden atribuirse a muchas amenazas antropogénicas, incluida la contaminación de las vías fluviales, la alteración y destrucción del hábitat, la reducción de la abundancia y diversidad de peces anfitriones, y la introducción de especies invasoras^{1, 10}. Como alimentadores de filtros bentónicos, los mejillones se entierran en el sustrato y son susceptibles a contaminantes y contaminantes que drenan en la cuenca hidrográfica¹¹. La recuperación de especies de mejillón es pertinente, ya que proporcionan una amplia variedad de servicios ecosistémicos, incluyendo el secuestro de carbono, una fuente de alimento, y la purificación del agua por filtro de alimentación¹¹. Además, se ha encontrado que los mejillones indican la salud de los ecosistemas, promueven la biodiversidad y, a su vez, aumentan la resiliencia de un ecosistema^12.

Muchos estudios de mejillón de agua dulce se han centrado en investigar los requisitos de la historia temprana de la vida para informar mejor las evaluaciones del estado de las especies y las estrategias de manejo. Las familias de mejillones de agua dulce relevantes para este estudio (por ejemplo, Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) tienen una estrategia única de historia de vida donde las hembras crían larvas (glochidia) en sus branquias marsupiales^8. A través de una variedad de estrategias, el mejillón hembra expulsa glochidia madura de las branquias marsupiales para parasifiar a un huésped vertebrado con glochidia^13. La investigación sobre el desarrollo gloquidial dentro de las branquias fue modificada de una técnica que utiliza jeringas hipodérmicas para muestrear líquido gonadal de mejillones vivos y evaluar la producción de gametos^14,15,16. Como los investigadores validaron esta metodología no letal para el muestreo de gónadas, se adaptó para el muestreo de branquias marsupiales para evaluar el desarrollo de la cría^15,16. El desarrollo de la cría se puede utilizar para descifrar las relaciones filogenéticas, ya que algunas especies de mejillones pueden criar gloquidia en sólo las dos branquias externas (ectobranchus), sólo las dos branquias internas (endobranchus), o en las cuatro branquias (tetrabranchus) pero esta característica no es conocido por cada especie¹⁷. Los patrones de cría se han utilizado previamente para clasificar las especies de mejillones por si las hembras de mejillón crían gloquidia durante el invierno (bradítico) o durante un corto período en el verano (taquitico)¹⁸. El invierno de las crías de mejillones se apoyó cuando se estudió el ciclo reproductivo de Anodonta ¹⁹. Sin embargo, la biología reproductiva básica se estudió más a fondo a lo largo de los años y encontró que esta dicotomía era una generalización bruta y los períodos de cría de algunas especies son mucho más complejos de lo que se presumía originalmente^20,21. Por ejemplo, se han observado especies del género Hyridella (familia Hyriidae), Glebula y Elliptio (familia Unionidae) con más de tres crías por temporada de cría^{22,23, 24}. La complejidad de las especies específicas, y a veces incluso específicas de la población²⁰, los hábitos reproductivos ha llevado a una brecha en el conocimiento sobre el momento y la duración de la cría, y el número de crías que una hembra mejillón puede producir.

Aunque las jeringas hipodérmicas se han utilizado para extraer el contenido de las branquias, informar de los resultados es complicado debido a la falta de estandarización para garantizar resultados comparables en todos los estudios. Anteriormente, se han identificado en Unionidae cuatro etapas de desarrollo de gloquidia (es decir, óvulo, embrión, inmaduro, plenamente desarrollado) pero no se han adoptado en el procedimiento estándar^16,25,26. Otros estudios que observan a los miembros de Margaritiferidae han sustituido la clasificación de 'glochidia inmadura' por 'desarrollando glochidia', lo que lleva a una confusión potencial^27,28. La falta de consistencia en la caracterización de las diferentes etapas de desarrollo larvario ha dejado a muchos investigadores describir generalmente a las hembras en afligidos como 'gravid', lo que no abarca las complejidades del desarrollo larvaria. Estudios de historia de la vida que llevan a cabo ensayos de peste-pescado han priorizado la necesidad de hembras gravídicas con glochidia completamente desarrollada, pero esta información está dispersa a lo largo de la literatura publicada e inédita^29,30. Actualmente, faltan datos sobre los hábitos reproductivos de muchas especies de mejillones, incluyendo el momento de la transición entre el huevo, la glochidia inmadura y la glochidia completamente desarrollada lista para la fijación a los huéspedes. Para la mayoría de las especies, no está claro cuánto tiempo las hembras crían gloquidia y cuán rápido se desarrollan completamente los huevos fertilizados. Las brechas de conocimiento son a menudo más amplias para las especies de interés para la conservación, lo que presenta la necesidad de un método estandarizado de extracción de contenido de branquias que ha sido probado para efectos no letales y puede ser promovido a la comunidad científica para complementar metodologías de recopilación de datos convencionales, sin suponer una amenaza para las poblaciones protegidas^24,31,32.

Este estudio tenía tres objetivos: 1) formalizar una técnica de muestreo de branquias y probarla para detectar efectos letales y no letales en los mejillones femeninos in situ, 2) caracterizar diferentes etapas del desarrollo gloquidial y describir un método estandarizado de identificación y identificación informes de varias etapas larvales, y 3) crear un repositorio público para los datos recopilados. Las encuestas sobre el terreno, los proyectos de monitoreo a largo plazo y las colecciones de museos representan oportunidades para que el protocolo descrito aquí se implemente y se recopilen datos adicionales para un cuerpo de interés más amplio. El protocolo formalizado incluye imágenes y descripciones de caracteres para diferenciar cada etapa del desarrollo larvaria. Al estandarizar las categorías, los resultados recogidos se pueden comparar entre todas las ocurrencias y especies. Una vez recopilados los datos, todos pueden ser enviados al Almanaque de Musano De Agua Dulce (FMGA), que es una base de datos para la información de gravididad recopilada utilizando este protocolo. Un producto final para almacenar y compilar toda la información de gravididad recopilada proporcionará una herramienta de investigación para facilitar futuros esfuerzos de investigación, conservación y recuperación. La incorporación de esta metodología en diversos proyectos de mejillón y la presentación de datos a FMGA ampliarían la amplitud de los conocimientos relativos al estado de la gravididad de las especies de mejillón a lo largo del año. Como grupo de organismos altamente incontrolado, este protocolo y la base de datos resultante sobre los hábitos reproductivos de los mejillones de agua dulce es esencial para comprender la dinámica de la población y facilitar la conservación de estas especies.

Protocolo

1. Colección femenina de Gravid

NOTA: Consulte el Protocolo³³ de la Encuesta de Mejillones de Agua Dulce del Servicio de Pesca y Vida Silvestre para obtener orientación sobre cómo estudiar adecuadamente un sitio de muestreo para especies amenazadas o en peligro de extinción. Los permisos federales adecuados deben obtenerse antes de la recolección en el campo de especies protegidas y permisos estatales para todas las especies presentes.

1. Recoger mejillones vivos del campo utilizando métodos táctiles-visuales (paso 1.2) o utilizar especímenes preservados de un museo (paso 1.3).
   NOTA: Es importante mantener los mejillones vivos frescos y húmedos después de la recolección para evitar la desecación y reducir el estrés, y un manejo mínimo de los mejillones gravid es importante para evitar que las hembras liberen prematuramente el contenido de las branquias^34.
2. Evaluar la gravididad femenina ya sea mediante inspección visual durante la recolección (por ejemplo, presencia de señuelo de manto, conglutinados, etc.) o mediante inspección visual después de la recolección (por ejemplo, la presión suave de las válvulas abiertas suficientes para mirar dentro y ver si las branquias están infladas, ver Figura 1).
   NOTA: Las especies varían en la forma en que las gloquidias son meditadas dentro de las branquias marsupiales como a veces sólo las dos branquias externas (ectobranchus), sólo las dos branquias internas (endobranquio), o las cuatro branquias (tetragenous) son marsupiales¹⁷. El protocolo se puede pausar aquí, y las hembras gravídicas pueden ser transportadas de vuelta al laboratorio para el muestreo de branquias.

Figura 1: Inserción suave de individuos abiertos. Para comprobar la gravididad de un mejillón vivo, abra suavemente las válvulas con los pulgares (A) o utilice con precaución un alicate súlico o inverso para abrir las válvulas (B). Revise el paso 2.3 en el protocolo para las precauciones asociadas con este método. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Realice una inspección visual de las muestras conservadas abriendo las válvulas e inspeccionando las branquias para determinar si el individuo es una hembra gravídica(Figura 2).

Figura 2: Cómo identificar una hembra gravídica. Las branquias marsupiales de mejillón hembra aparecen infladas cuando la hembra es gravitado y melancado. Las fotos A y C muestran las branquias desde una perspectiva lateral, mientras que las fotos B y D proporcionan una vista ventral de las branquias. Las cajas rojas delinean las branquias para resaltar las diferencias entre un mejillón gravid (A/B) y no gravid (C/D) femenino Lampsilis straminea. Las longitudes totales de los individuos son 79 mm (A/B) y 88 mm (C/D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Muestreo de contenido de Gill

NOTA: Este protocolo se puede adaptar tanto si el muestreo se realiza en mejillones vivos en el campo y en el laboratorio, como en muestras conservadas.

1. Preparar un tubo de extracción de microcentrífuga de plástico de 1,5 ml con aproximadamente 1 ml de agua estéril si el contenido de las branquias se evaluará dentro de las 24 horas de extracción 35 o etanol (EtOH) si la evaluación de la muestra no puede ocurrir dentro de las 24 horas de la recolección o si la branquia se evaluará dentro de las 24 horas de la extracción³⁵ o el etanol (EtOH) si la evaluación de la muestra no puede ocurrir dentro de las 24 horas de la recolección o si la branquia contenidos provienen de un espécimen de museo conservado en EtOH. Si los gloquidiaestán están destinados a escanear imágenes de microscopio electrónico (SEM), utilice 70% EtOH, y si glochidia se utilizará para pruebas genéticas, utilice un 95% EtOH³⁶no desnaturalizado.
2. Retire el envoltorio de papel para una aguja estéril de punta biselada de 20 G en una jeringa de 10 ml. Desenrosque la tapa para exponer la aguja y prepare un tubo de plástico de 1,5 ml para la recolección de contenido de branquias. Empuje la manija de la jeringa hasta el fondo para que el tapón negro esté en la línea de 0 ml/cc.
   NOTA: Se debe utilizar una jeringa estéril cada vez que se muestree el contenido de las branquias. Una jeringa usada se puede esterilizar en el campo sumergiendo la punta en una solución de lejía del 10%, luego enhebrando la jeringa llenándola con 1 ml de agua estéril y deprimiendo el émbolo de nuevo a 0 ml/cc, y finalmente secando la jeringa con un paño limpio.
3. Recoger la hembra gravídica y abrir suavemente las dos válvulas usando las puntas de los pulgares.
   ADVERTENCIA: Tenga cuidado de no dañar al animal. Abrir las válvulas demasiado anchas o demasiado rápidas puede extender demasiado los músculos aductores y causar mortalidad. Los especímenes de capadelgada (por ejemplo, especies de Anodonta, Leptodea, Utterbackia,etc.) y individuos jóvenes son especialmente vulnerables en este paso. El manejo forzoso de especies de conchas frágiles puede romper las conchas y causar mortalidad. En algunos casos, apretar animales de capa fina desde los márgenes anterior y posterior de la cáscara, mientras mira la superficie ventral, hará que la cáscara se flexione y se desvíe ligeramente, permitiendo que uno observe las branquias o abra las conchas y evite dañar la frágil margen de vaciado.
   NOTA: Las herramientas se pueden utilizar para ayudar con este paso, pero también pueden causar mortalidad si no se utilizan con cuidado y deben evitarse siempre que sea posible. Por ejemplo, se puede utilizar un espéculo o un conjunto modificado de alicates inversos para ayudar a abrir el individuo y se puede utilizar una cuña para ayudar a apuntalar las válvulas abiertas. Estos instrumentos pueden no ser necesarios si otra persona está disponible para ayudar (es decir, una persona mantiene al animal abierto mientras otra maniobra la jeringa para la extracción). Dañar o separar el tejido del manto del periostracum puede causar deformidades de crecimiento y mortalidad^37; por lo tanto, es fundamental evitar cortar la conexión entre el tejido del manto y el margen exterior de la cáscara.
4. Utilice la punta de la aguja de la jeringa para penetrar suavemente un tubo de agua de la branquia marsupial inflada. A continuación, saque suavemente el contenido de la branquia utilizando la punta biselada de la aguja.
   NOTA: El contenido de Gill generalmente tiene una consistencia de color blanco lechoso, que debe ser visible en la punta biselada de la aguja.
   1. Deposite el contenido de la jeringa directamente en una placa Petri si hay un microscopio disponible. De lo contrario, guarde el contenido en un tubo de microcentrífuga de plástico de 1,5 ml con líquido designado (véase el paso 2.1) para su posterior evaluación.
      NOTA: Minimizar la perturbación y el manejo de las muestras de glochidia durante el transporte para evitar daños y una viabilidad reducida^32,35.
5. Registrar información sobre la identificación género-especie, estado de gravididad, longitud de la hembra (mm), información de coleccionista y contacto, estado, condado, drenaje, ubicación específica de larecolección, latitud y longitud, un identificador único para la branquia ejemplo, un identificador único para el sitio de la encuesta y la fecha de recolección si se extrajo el contenido de las branquias (Figura 3). Registre un identificador único en cada buque de recogida para garantizar registros de datos precisos durante el transporte.
   1. Fotografíe la válvula derecha exterior del mejillón para la validación de identidad e incluya el tubo etiquetado con el identificador único legible en la imagen. Opcionalmente, recopile otros parámetros abióticos y bióticos para complementar la información sobre el medio ambiente y la comunidad en la que se encontró el mejillón (consulte la Figura 3 para sugerencias).

Figura 3: Ejemplo de una hoja de datos de gravididad de campo. Es necesario notificar datos precisos si se toma una muestra de branquias para producir información confiable. Este es un ejemplo de una hoja de datos de campo con los campos mínimos y parámetros abióticos adicionales que se recopilarán junto con cada muestra de branquias. Para obtener información más completa, consulte el paso 4.1 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Evaluación de laboratorio del contenido de las branquias

1. Si el contenido de las branquias está en un tubo de 1,5 ml, transfiéralos en una placa Petri y llene la parte inferior del plato con agua. Gire suavemente la placa Petri en un movimiento circular para recoger el contenido en el centro de la placa para una vista más concentrada de la muestra.
   NOTA: Es posible que sea necesario eliminar el tubo de 1,5 ml con una botella de chorro o transferir un pipeta lleno de agua si el contenido de las branquias se pega a las paredes del tubo.
2. Coloque la placa Petri bajo un microscopio de disección para evaluar la muestra. Si es posible, tome una fotografía de la muestra de branquias bajo el microscopio y etiquétela con el identificador único de esa muestra.
   1. Registre los resultados de las etapas de desarrollo presentes en cada muestra de branquias. Utilice la Figura 4 como guía para caracterizar cada etapa del desarrollo. En algunos casos, las hembras pueden estar indemviendo larvas en múltiples etapas de desarrollo; por lo tanto, informe de cada etapa de desarrollo observada en una muestra determinada (por ejemplo, «EGG/DG/IMG/FDG»). Una vez evaluadas las gloquidias conservadas, proceda a la sección 4. Si se identifican gloquidias completamente desarrolladas y EtOH no se utilizó para su conservación, proceda al paso 3.3.
      NOTA: EGG, masas de huevo; DG, desarrollo de gloquidia; IMG, gloquidia inmadura; FDG, gloquidia totalmente desarrollada.

Figura 4: Representaciones para varias etapas del desarrollo de glochidia en las branquias marsupiales. (A) Las masas de huevo (EGG) tienen una membrana que hace que los huevos se agrupen. Dentro de cada membrana de huevo hay una masa esférica opaca de células diferenciadoras. La masa esférica opaca puede dividirse en múltiples masas esféricas durante la división celular temprana, pero todavía debe registrarse como EGG hasta que se observe una forma bivalva distinta. (B) La gloquidia inmadura (IMG) tiene una masa distinta en forma de bivalvo contenida dentro de la membrana del huevo. (C) El desarrollo de gloquidia (DG) tiene una forma bivalva distinta, sin membrana de huevo, y tejido desorganizado en el interior, a menudo difuso en apariencia. El desarrollo de gloquidia (DG) no es reactivo cuando se expone a NaCl y se clasifica como "DG(T)» cuando se registran datos. (D) La gloquidia completamente desarrollada (FDG) tiene la forma bivalva distinta y el tejido muscular aductor obvio que permite que la gloquidia se cierre. La gloquidia completamente desarrollada (FDG) a menudo se observa como dos válvulas abiertas después de la preservación. Dos válvulas abiertas generalmente se cierran, o se abren y cierran, cuando se exponen a NaCl y se clasifican como 'FDG(T)'. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Realizar una prueba de cloruro de sodio (NaCl) para evaluar aún más la viabilidad de cualquier glochidia completamente desarrollado mediante la adición de un cristal de NaCl a una gota de subconjunto de la muestra de branquia³⁵. La gloquidia viable responderá a NaCl cerrando sus válvulas desde una posición abierta. Informar de cualquier glochidia probada en sal con '(T)' al final de la designación cuando se registren datos.
   NOTA: La gloquidia completamente desarrollada también se puede observar astillando activamente abierta y cerrada sin exposición a NaCl.

4. Informe a la base de datos

1. Acceda a la web FMGA (http://arcg.is/089uee), que fue desarrollada utilizando programas de software en línea^38,39,40. La página FMGA proporciona un enlace al formulario de entrada de datos de escritorio y una descarga de aplicaciones para dispositivos móviles. La aplicación móvil permite la entrada de datos en el campo y la georreferenciación automatizada⁴¹.
   NOTA: El calendario de gravididad y otros gráficos asociados con los eventos de la historia de la vida de las especies de mejillones de agua dulce también se pueden encontrar en el panel de FMGA.
   1. Utilice la aplicación móvil o el sitio de escritorio para registrar los resultados en el formulario de entrada de datos mediante el uso de menús desplegables y campos de entrada de texto. Para conjuntos de datos grandes y preexistentes, póngase en contacto con los autores de la hoja de cálculo de plantilla. Introduzca los datos registrados en los encabezados de columna apropiados, teniendo en cuenta que cada registro, o fila en la hoja de cálculo, representa observaciones de una muestra de branquias de un individuo gravid.
   2. Envíe los resultados y se añadirán a la base de datos FMGA después de ser validados por un administrador, que puede ponerse en contacto con el recopilador para solicitar más detalles o fotos.
      NOTA: Una vez que los datos se validan y compilan en la base de datos FMGA, se actualizarán todos los calendarios de gravidad y otros gráficos interactivos que se muestran en el panel de FMGA.

Resultados

Este protocolo se aplicó durante un estudio de captura-marca-recuperación que monitorizó a la comunidad de mejillones de agua dulce dentro de un tramo de 750^m2 de Bruce Creek (Condado de Walton, Florida) de enero de 2015 a diciembre de 2015. El muestreo de campo estaba programado para ocurrir cada cuatro semanas; sin embargo, debido a eventos de alto flujo, el muestreo no se llevó a cabo en abril o septiembre de 2015. Las agencias estatales y federales, incluyendo el Servicio Geológico de los Estados Unidos, el Servicio de Pesca y Vida Silvestre de los Estados Unidos, y la Comisión de Conservación de Pesca y Vida Silvestre de Florida ayudaron en las encuestas de campo y muestreo de branquias. Cada hembra gravídica encontrada durante la encuesta fue sometida a muestreo de contenido de branquias en el campo utilizando el protocolo descrito anteriormente, etiquetado (ver Tabla de Materiales),y colocado de nuevo en el sustrato del río. Las muestras de branquias fueron almacenadas en 95% EtOH y transportadas al laboratorio del Servicio Geológico de los Estados Unidos y del Centro de Investigación Acuática para la evaluación del contenido de las branquias.

Al etiquetar a las hembras y volver a capturarlas a intervalos mensuales durante todo el año, evaluamos los impactos letales y no letales del protocolo de muestreo de branquias en un total de 90 individuos. Las siguientes siete especies fueron recapturadas durante este estudio: Elliptio pullata (n 5), Fusconaia burkei (n.o 1), Hamiota australis (n.o 19), Choctawensis obovaria (n.o 1), Estrofia williamsi (n.o 1), Villosa lienosa (n.o 60) y Villosa vibex (n.o 3). Nuestro muestreo incluyó individuos que van de 24 mm a 80 mm de longitud total y dos especies(F. burkei y H. australis)protegidas por la Ley de Especies Amenazadas de los Estados Unidos. Todos los datos utilizados en este estudio están disponibles públicamente Hemos proporcionado acceso a nuestro conjunto de datos en ScienceBase (https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)⁴².

La supervivencia fue evaluada por cuántos individuos fueron recapturados vivos después de la recolección de muestras de branquias. Observamos una alta supervivencia (97%) durante el estudio con cierta mortalidad, posiblemente atribuible a la depredación, indicada por observaciones in situ. Los resultados mostraron que alrededor del 51% de los individuos (46 de 90) se encontraron para permanecer gravid entre eventos de muestreo consecutivos. Otro 10% de los individuos (9 de 90) fueron encontrados gravidos, recapturados no gravid, y encontrados gravidos de nuevo. Alrededor del 39% de los individuos (35 de 90) en este estudio fueron encontrados gravid, se tomó una muestra de branquias, pero cuando se recapturaron de nuevo durante todo el año, nunca fueron encontrados gravid por segunda vez. Los resultados indican que el protocolo descrito aquí no es letal ni subletal y no perturba sustancialmente el período de cría actual después de la toma de muestras.

Aunque los tamaños de las muestras en este estudio son desiguales entre las especies, los resultados de este estudio destacan las aplicaciones beneficiosas y prácticas de este protocolo. El calendario de gravidad para V. lienosa ilustra a las hembras gravid que mingFDG se encontraron en casi todos los meses del año, excepto en agosto, cuando sólo se encontraron a las hembras que merodean EGG(Figura 5A). Las hembras H. australis no fueron encontradas gravid (NG) en julio, agosto y diciembre. Una mayor proporción de hembras estaban meditando FDG en enero y febrero, pero también se encontraron en octubre y noviembre(Figura 5B). No se encontró a ningún individuo de E. pullata meditando FDG, aunque las hembras estaban meditando EGG de mayo a junio, y una hembra de gravid registrada (GFR) en junio(Figura 5C). La única hembra de F. burkei gravid fue encontrada GFR en junio y reconquistada NG en julio. El mismo individuo de O. choctawensis fue recogido FDG en febrero y recapturado NG en julio. Sólo un S. williamsi fue encontrado y fue recapturado tres veces. Esta hembra fue encontrada FDG en marzo, NG en mayo, GFR en junio, y EGG en agosto(Figura 5C). Las hembras de Gravéd de V. vibex se encontraron entre febrero y junio(Figura 5C).

Figura 5: Resultados del estudio en Bruce Creek, FL mostrados en un formato de calendario de gravidad. (A) Calendario de gravididad para capturas/recapturas de Lienosa de Villosa. (B) Calendario de gravididad para capturas/recapturas de Hamiota australis. (C) Calendarios de gravidad para todas las especies con menos de 10 individuos muestreados. El eje Y incluye abreviaturas para los meses Enero (Ja), Febrero (F), Marzo (Sr.), Mayo (Mi), Junio (Jn), Julio (Jl) Agosto (A), Octubre (O), Noviembre (N) y Diciembre (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Significado

La conservación de las especies en crisis depende del reclutamiento exitoso dentro de las poblaciones existentes. En algunos casos, la propagación artificial puede ser necesaria para aumentar el reclutamiento de estas poblaciones en riesgo. Esto requiere que los investigadores estén informados sobre el momento de la reproducción activa de cada especie y que posiblemente apliquen diferentes metodologías o prácticas de gestión para mitigar el impacto en el reclutamiento. Como grupo de organismos en proceso, es primordial establecer un enfoque estandarizado y no letal para estudiar los hábitos reproductivos, y proporcionar una plataforma sobre la cual recopilar y visualizar datos para informar a la comunidad científica con la más actualizada información disponible. Este estudio proporciona un protocolo paso a paso para garantizar que se tomen precauciones, y el contenido de las branquias se puede muestrear y evaluar adecuadamente a partir de mejillones femeninos. Este protocolo fue probado para efectos letales y no letales, permitiendo a los investigadores y gerentes implementar responsablemente esta metodología. También desarrollamos un conjunto de herramientas y aplicaciones de gestión de bases de datos para facilitar la compilación de información sobre gravidad en un panel de control disponible al público y fácil de usar. Los estudios sobre epidemiología, morfología glochidia, historia de la vida, filogenética, propagación y translocaciones pueden beneficiar y utilizar este repositorio de información sobre gravididad temporal para todas las especies de mejillones de agua dulce.

Este estudio por sí solo apoyó los hallazgos de estudios previos de algunos hábitos reproductivos de especies, pero también reveló información novedosa sobre otras. Aunque V. vibex se recopiló en menos números que V. lienosa,se pueden encontrar similitudes entre los dos en función de los datos de gravididad. Ambas especies de Villosa parecen meditar gloquidia completamente desarrollada durante una gran parte del año, lo que las caracteriza como una cría invernal. Esto es consistente con estudios previos sobre otras especies de Villosa ^43,44,45. Los resultados de este estudio sugieren que H. australis se puede encontrar gravid de octubre y durante el invierno en junio, excepto que no se encontraron capturas gravid en diciembre. Un estudio publicado previamente identificó congéneres H. altilis con un período de gravididad de cuatro meses, de marzo a^{junio 46,47}. Este hallazgo ilustra un período de gravididad más largo de lo que se pensaba anteriormente y generalmente agrupa a H. australis como un brooder invernal. Como especies protegidas federalmente, los diferentes períodos de cría para H. altilis y H. australis podrían afectar las decisiones de gestión para proteger mejor a las poblaciones durante los tiempos de actividad reproductiva. Elliptio pullata sólo fue encontrado gravido con EGG en mayo y junio que corresponde a su caracterización como una especie taquitica con un período de cría muy corto^24,48,^{49, 50}. A medida que se recopilan datos sobre las especies de Elliptio utilizando este protocolo, la información detallada puede hacer que los esfuerzos de campo sean más eficientes cuando se dirigen ciertas etapas de desarrollo gloquidial, ya que las gloquidias sólo se encuentran a pocos meses del año. La inferencia de las otras especies con tamaños de muestra más bajos es limitada, pero a medida que los datos se compilan en la base de datos, los tamaños de muestra más altos darán una idea de los hábitos reproductivos de otras especies de mejillón.

Observaciones procesales

Se sabe que los mejillones de agua dulce y sus gloquidias son susceptibles a los factores de estrés antropogénicos^10,35. Durante la inspección de la gravedad, las válvulas de mejillón pueden no ser fáciles de abrir, y forzar descuidadamente las válvulas abiertas puede causar daños involuntarios y resultar en estrés o mortalidad. Algunas especies de conchas frágiles (por ejemplo, especies de Anodonta, Leptodea, Utterbackia,etc.) y individuos de menor tamaño pueden tener conchas muy frágiles y músculos aductores débiles que pueden romperse y desgarrarse fácilmente. El muestreo de gill podría considerarse un factor de estrés si el manejo no se realiza de manera responsable y con precaución. Un estudio anterior encontró que el manejo y la exposición aérea de los mejillones durante los tiempos reproductivos pueden causar diverso estrés fisiológico, incluyendo la liberación prematura del contenido de las branquias^34. Sin embargo, un estudio que utiliza una metodología similar como se describe aquí, encontró que el manejo de mejillones hembra sormentegravia durante el muestreo de branquias no interrumpió la cría actual ni causó liberación prematura en las especies de cría a corto y largo plazo^16. Además, es necesario utilizar una jeringa estéril durante este protocolo para prevenir cualquier infección no intencionada o contaminación cruzada al punción de las branquias de varios individuos. Además, las gloquidias son frágiles y las crías pueden ser maduradas y estresadas pero no expulsadas. Gloquidia madura en mala salud puede resultar en menos individuos reaccionando a las pruebas de sal³⁵. Al hacer la distinción entre DG(T) y FDG(T) es importante probar la sal con un gran tamaño de muestra, tomar notas sobre las observaciones para identificar cuidadosamente las distinciones entre DG y FDG glochidia utilizando las descripciones proporcionadas en este estudio. Cuando se toma el cuidado adecuado, el estrés mínimo inducido por este procedimiento puede permitir que los mejillones femeninos continúen meditando glochidia de forma natural y reducir los impactos en el reclutamiento en la población.

Se pueden registrar datos adicionales para complementar la base de datos y proporcionar un contexto amplio para los hábitos reproductivos de los mejillones de agua dulce. Algunas especies (por ejemplo, especies de Fusconaia), se han observado que tienen branquias de diferentes colores basadas en la etapa de desarrollo de la glochidia⁵¹. Durante una comprobación inicial de la gravididad de la hembra, se puede incluir una descripción del color de la branquia en los datos reportados para permitir una investigación futura. Además, en este punto del protocolo, los investigadores pueden observar si la hembra reproductora fue encontrada gloquidia en las dos branquias exteriores (ectobranquio), dos branquias internas (endobranquio), o las cuatro branquias (tetragenous)^17. Esta información se puede agregar a FMGA y ayudar a llenar las lagunas de datos con respecto a la cría de cada especie investigada. Las condiciones ambientales, específicamente la temperatura del agua, se pueden recoger y registrar en el campo para una observación más completa del estado de la gravididad y el momento de las especies en diversos rangos latitudinales. Las investigaciones muestran que los parámetros ambientales, como la temperatura, el fotoperiodo, el caudal y la disponibilidad de alimentos, pueden inducir eventos reproductivos en mejillones de agua dulce^{52,53,54,55 ,56}. Se pueden añadir campos adicionales a la base de datos a medida que se presentan para promover futuras investigaciones sobre factores abióticos que influyen en la gravedad. También se puede añadir a este protocolo una modificación de captura-recaptura de captura-recaptura modelada después de nuestro estudio, que permitiría a los investigadores monitorear los hábitos reproductivos de un mejillón específico y revelar información sobre múltiples crías por año.

La precisión de la información en la FMGA depende de la fuente. Por ejemplo, la identificación errónea de mejillones de agua dulce es común debido a muchas especies que tienen características externas similares que dificultan distinguir entre la especie^57. Una muestra de branquias de un individuo mal identificado podría crear confusión e información falsa para el período de cría de una especie. Si se toma una muestra de branquias, se deben tomar fotografías del interior de ambas válvulas (si el individuo no está vivo), fuera de la válvula derecha, y el umbo (hinge donde se conectan dos válvulas) y enviarse con datos de gravididad a través del sitio de escritorio o la aplicación móvil. También damos la bienvenida a fotos del contenido de las branquias. Dentro de los formularios de presentación hay un menú desplegable que permite al coleccionista indicar su nivel de confianza con respecto a la identificación de especies. Antes de que se valide el registro, esta información se tendrá en cuenta al comprobar la identificación del colector contra la distribución plausible, etc. Debido al alto grado de variación morfológica intraespecífica en las especies de Unionidae, se fomenta la presentación de muestras de tejido y puede ser necesaria para facilitar la identificación molecular.

Implicaciones futuras

Como método no letal, este protocolo se puede aplicar tanto a especies comunes como en especies en estado de perido. Los calendarios de gravidad para las especies en peligro pueden ayudar a los gestores de conservación involucrados con la legislación sobre especies en peligro de extinción y la planificación de la recuperación proporcionando información sobre los períodos de tiempo en los que las especies están reproductivamente activas. Las agencias estatales y federales que manejan especies en riesgo pueden aconsejar mejor las asignaciones de permisos para momentos en que la especie no es vulnerable y se reproduce, e incluso limitar la cosecha de peces huésped durante el tiempo los mejillones están meditando glochidia completamente desarrollada. Además, las encuestas de campo pueden dirigirse a las especies durante los períodos no reproductivos para minimizar el impacto en los procesos de reclutamiento. La base de datos de acceso público, FMGA, proporciona una herramienta para que los investigadores y gerentes obtengan información reproductiva importante sobre cualquier especie de mejillón de agua dulce objetivo. La base de datos también pondrá de relieve las lagunas de datos, fomentando la investigación adicional sobre los patrones de cría específicos de especies. Dado que la comprensión de un patrón de reproducción de especies permite implementar decisiones de gestión adecuadas, esperamos que nuestro protocolo y nuestra base de datos faciliten la futura investigación, conservación y recuperación del mejillón de agua dulce.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL snap cap centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510	Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost.
20 G needle on 10 mL disposable syringe	Exelint International	26255	sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2"
Dissecting Microscope	any	any
Marking Pen	Fisher Scientific	13-379-4	This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof.
Molecular grade ethanol	any	any	Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work.
Paper	any	any	Needed to record information on samples collected.
Pen/pencil	any	any	If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine.
Petri dish	DWK Life Sciences (Kimble)	23000-9050	This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used.
Sodium Chloride	any	any	Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this.
Speculum	any	any	Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.
Sterile water	any	any	Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection.
Super glue	Gorilla	Gorilla super glue gel	Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Tags	Hallprint	FPN 8x4	Only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Transfer Pipet	Thermo Scientific Samco	225	This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable.
Tweezers	any	any	Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this.
Waterproof paper	RainWriter	any	Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from.
Wooden pick	any	any	Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.