Standardisierung einer nicht-tödlichen Methode zur Charakterisierung des Fortpflanzungsstatus und der Larval-Entwicklung von Süßwassermuscheln (Bivalvia: Unionida)

Zusammenfassung

Die Erhaltung der Süßwassermuschel hängt von der Überwachung der Fortpflanzungsmuster und -prozesse von Arten ab. Diese Studie standardisiert ein nicht-tödliches Protokoll für die Probenahme von Kiemeninhalten, die Charakterisierung der Larvenentwicklung und die Bereitstellung eines digitalen Repositorys für gesammelte Daten. Dieses Protokoll-Datenbank-Paket wird ein wichtiges Werkzeug für Muschelforscher bei der Wiederherstellung gefährdeter Arten sein.

Zusammenfassung

Die aktive Überwachung des Zeitpunkts, der Entwicklung und der Fortpflanzungsmuster gefährdeter Arten ist bei der Bewirtschaftung der Bevölkerungserholung von entscheidender Bedeutung. Süßwassermuscheln gehören zu den am stärksten gefährdeten Organismen der Welt, aber Informationen über die frühe Larvenentwicklung (Glochidial) und Brutzeiten fehlen noch für viele Arten. Frühere Studien konzentrierten sich auf das komplexe Stadium der Lebensgeschichte, wenn weibliche Muscheln bereit sind, Wirtsfische zu parasitieren, aber nur wenige Studien haben sich auf die Brutzeit und den Zeitpunkt der Larvenentwicklung konzentriert. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es Forschern, den Graviditätszustand weiblicher Muscheln nicht tödlich zu bewerten. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass diese Methode die Fähigkeit einer weiblichen Muschel, nach der Probenahme wieder gravid zu bleiben oder wieder gravid zu werden, nicht beeinflusst. Der Vorteil dieser Methode kann ihre Anwendung bei vom Bund bedrohten oder gefährdeten Arten oder anderen artenbesorgniserregenden Populationen zulassen. Dieses Protokoll kann sowohl für den Einsatz an konservierten als auch an lebenden Individuen angepasst werden und wurde an einer Vielzahl von Muschelarten getestet. Die bereitgestellte Datenbank ist ein Aufbewahrungsarchiv für eine Breite von Informationen über den Zeitpunkt der Fortpflanzungsgewohnheiten und wird zukünftige Bemühungen um Süßwassermuschelforschung, -erhaltung und -wiederherstellung erleichtern.

Einleitung

Die Persistenz der Populationen in den Süßwassersystemen hängt vom Erfolg der Reproduktion und Rekrutierung ab. Bei parasitären Organismen kann die Identifizierung der Feinheiten des Lebenszyklus (z. B. Stadien der Larvenentwicklung und Wirtsanziehungsstrategien) Einblicke in die Fortpflanzungsgewohnheiten und kritischen Prozesse eines Organismus geben, die die Rekrutierung beeinflussen. Solche Informationen werden wichtig, wenn Arten gefährdet sind und eine erfolgreiche Rekrutierung erforderlich ist, um die verbleibenden Populationen aufrechtzuerhalten, oder wenn die Erholung die Verwendung von Vermehrung in Gefangenschaft zur Wiederherstellung von extirpatierten Populationen erfordert.

Süßwassermuscheln (Bivalvia: Unionida) gelten als eine der am stärksten gefährdeten Gruppen von Organismen weltweit und eine Zusammenstellung artspezifischer Fortpflanzungsgewohnheiten könnte bei den^{Forschungsbemühungen}1^,2,3 helfen ^,4,5. Mit über 800 derzeit anerkannten Arten, die auf der ganzen Welt verteilt sind, haben Süßwassermuscheln Hotspots der Vielfalt in Nord- und Südamerika, und Südostasien, aber wesentliche Informationen zur Lebensgeschichte sind für viele Arten unbekannt^{2, 5,6,7}. Familien innerhalb dieser Ordnung zeichnen sich durch parasitäre Larvenstadien aus, die die Metamorphose während der Bindung an einen Wirt^7,8in freilebende Jungtiere vollenden. Diese einzigartige Lebensgeschichte trägt zur Artenvielfalt in Süßwassersystemen bei, die sich derzeit in der Krise^{befinden 9}. Hohe Gefahrenraten sind auf viele anthropogene Bedrohungen zurückzuführen, darunter Verschmutzung der Wasserstraßen, Veränderung und Zerstörung von Lebensräumen, Verringerung des Überflusses und der Vielfalt der Wirtsfische und die Einschleppung invasiver Arten^{1, 10}. Als benthische Filterzubringer graben Muscheln in das Substrat und sind anfällig für Verunreinigungen und Schadstoffe, die in das Einzugsgebiet abfließen¹¹. Die Wiederherstellung von Muschelarten ist relevant, da sie eine Vielzahl von Ökosystemleistungen bieten, einschließlich Kohlenstoffbindung, Nahrungsquelle und Wasserreinigung durch Filterfütterung¹¹. Darüber hinaus wurden Muscheln gefunden, um die Gesundheit des Ökosystems anzuzeigen, die biologische Vielfalt zu fördern und damit die Resilienz eines Ökosystems zu erhöhen¹².

Viele Süßwassermuschelstudien haben sich auf die Untersuchung der Anforderungen an die frühkindliche Geschichte konzentriert, um die Bewertung des Artenstatus und Managementstrategien besser zu informieren. Die für diese Studie relevanten Süßwassermuschelfamilien (z.B. Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) haben eine einzigartige lebensgeschichtliche Strategie, bei der Weibchen Larven (Glochidia) in ihren Beutelkiemen brüten⁸. Durch eine Vielzahl von Strategien vertreibt die weibliche Muschel reife Glochidie von Beutelkiemen, um einen Wirbeltierwirt mit Glochidia¹³zu parasitieren. Die Forschung über die glochidiale Entwicklung innerhalb der Kiemen wurde von einer Technik mit hypodermischen Spritzen modifiziert, um Gonadenflüssigkeit aus lebenden Muscheln zu proben und die Gametenproduktion^14,15,16zu bewerten. Da die Forscher diese nicht-tödliche Methode für die Gonadenprobe validiert haben, wurde sie für die Beutelkiemenprobe angepasst, um die Brutentwicklung^15,16zu bewerten. Die Brutentwicklung kann verwendet werden, um phylogenetische Beziehungen zu entschlüsseln, da einige Muschelarten Glochidia nur in den äußeren zwei Kiemen (Ectobranchus), nur den inneren zwei Kiemen (endobranchus) oder in allen vier Kiemen (Tetrabranchus) brüten können, aber diese Eigenschaft ist nicht bekannt für jede Art¹⁷. Brutmuster wurden bisher verwendet, um Muschelarten nach zu klassifizieren, ob weibliche Muscheln Glochidia über den Winter (bradytictic) oder für einen kurzen Zeitraum im Sommer (tachytictic)¹⁸brüten. Die Überwinterung von Muschelbrutwurden wurde unterstützt, als der Fortpflanzungszyklus von Anodonta untersucht wurde¹⁹. Jedoch, grundlegende Reproduktionsbiologie wurde gründlicher im Laufe der Jahre untersucht und fand diese Dichotomie war eine grobe Verallgemeinerung und Brutperioden von einigen Arten sind viel komplexer als ursprünglich angenommen^20,21. Zum Beispiel wurden Arten der Gattung Hyridella (Familie Hyriidae), Glebula und Elliptio (Familie Unionidae) mit mehr als drei Bruten pro Brutzeit beobachtet^{22,23, 24}. Die Komplexität der artspezifischen und manchmal sogar bevölkerungsspezifischen²⁰Fortpflanzungsgewohnheiten hat zu einer Wissenslücke über den Zeitpunkt und die Dauer der Brut geführt, und die Anzahl der Bruten, die eine weibliche Muschel produzieren kann.

Obwohl hypodermische Spritzen verwendet wurden, um Kiemengehalt zu extrahieren, ist die Berichterstattung über die Ergebnisse aufgrund der fehlenden Standardisierung kompliziert, um vergleichbare Ergebnisse in allen Studien zu gewährleisten. Bisher wurden in Unionidae vier Entwicklungsstadien der Glochidia (d. h. Ei, Embryo, unreif, voll entwickelt) identifiziert, aber nicht in das Standardverfahren^16,25,26übernommen. Andere Studien, die Mitglieder von Margaritiferidae beobachten, haben die Einstufung von "unreife Glochidie" durch "entwickelnde Glochidia" ersetzt, was zu einer potenziellen Verwechslung führte^27,28. Die mangelnde Konsistenz bei der Charakterisierung der verschiedenen Larvenentwicklungsstadien hat viele Forscher dazu gebracht, brütende Weibchen im Allgemeinen als "gravid" zu bezeichnen, was die Feinheiten der Larvenentwicklung nicht umfasst. Lebensgeschichtliche Studien, die Wirts-Fisch-Studien durchführen, haben der Notwendigkeit von gravid Weibchen mit voll entwickelter Glochidia Priorität einräumen, aber diese Informationen sind über veröffentlichte und unveröffentlichte Literatur verstreut^29,30. Derzeit fehlen Daten über die Fortpflanzungsgewohnheiten vieler Muschelarten, einschließlich des Zeitpunkts des Übergangs zwischen Ei, unreifer Glochidie und voll entwickelter Glochidia, die bereit für die Bindung an Wirte sind. Für die meisten Arten ist unklar, wie lange Weibchen Glochidia brüten und wie schnell sich befruchtete Eier vollständig entwickeln. Die Wissenslücken sind oft größer für Arten von Erhaltungsbelange, die die Notwendigkeit für eine standardisierte Methode der Extraktion kiemen Inhalte, die auf nicht-tödliche Effekte getestet wurde und kann an die wissenschaftliche Gemeinschaft gefördert werden, um zu ergänzen Mainstream-Methoden zur Datenerhebung, ohne eine Bedrohung für geschützte Populationen zu stellen^24,31,32.

Diese Studie hatte drei Ziele: 1) formalisieren eine Kiemenprobenahme Technik und testen Sie es auf tödliche und nicht-tödliche Auswirkungen auf weibliche Muscheln in situ, 2) charakterisieren verschiedene Stadien der glochidialen Entwicklung und beschreiben eine standardisierte Methode zur Identifizierung und 3) ein öffentliches Repository für die gesammelten Daten zu erstellen. Felderhebungen, langzeitüberwachte Projekte und Museumssammlungen bieten die Möglichkeit, das hier beschriebene Protokoll umzusetzen und zusätzliche Daten für ein breiteres Interesse zu sammeln. Das formalisierte Protokoll enthält Visuals und Charakterbeschreibungen zur Differenzierung der einzelnen Stufen der Larvenentwicklung. Durch die Standardisierung der Kategorien können die gesammelten Ergebnisse unter allen Vorkommen und Arten verglichen werden. Sobald Daten gesammelt sind, können alle an die Süßwassermuschel Gravidity Almanac (FMGA) übermittelt werden, die eine Datenbank für Gravitationsinformationen ist, die mit diesem Protokoll gesammelt werden. Ein Endprodukt zur Speicherung und Zusammenstellung aller gesammelten Gravitationsinformationen wird ein Forschungsinstrument darstellen, um zukünftige Forschungs-, Konservierungs- und Wiederherstellungsbemühungen zu erleichtern. Die Einbeziehung dieser Methodik in verschiedene Muschelprojekte und die Übermittlung von Daten an FMGA würden die Breite des Wissens über den Gravitationsstatus von Muschelarten im Laufe des Jahres erweitern. Als stark gefährdete Gruppe von Organismen ist dieses Protokoll und die daraus resultierende Datenbank über die Fortpflanzungsgewohnheiten von Süßwassermuscheln von wesentlicher Bedeutung für das Verständnis der Populationsdynamik und die Erleichterung der Erhaltung dieser Arten.

Protokoll

1. Gravid weibliche Sammlung

HINWEIS: Beziehen Sie sich auf das Süßwassermuschelvermessungsprotokoll^{33 des} Fish and Wildlife Service, um Hinweise zu erhalten, wie eine Probenahmestelle für bedrohte oder gefährdete Arten angemessen vermessen werden kann. Vor der Feldsammlung geschützter Arten und den staatlichen Genehmigungen für alle vorhandenen Arten müssen entsprechende Bundesgenehmigungen eingeholt werden.

1. Sammeln Sie lebende Muscheln aus dem Feld mit taktil-visuellen Methoden (Schritt 1.2) oder verwenden Sie konservierte Exemplare aus einem Museum (Schritt 1.3).
   HINWEIS: Es ist wichtig, lebende Muscheln kühl und nass nach der Sammlung zu halten, um Austrocknung zu verhindern und Stress zu reduzieren, und minimale Handhabung von Gravidenmuscheln ist wichtig, um zu vermeiden, dass Weibchen vorzeitig Kiemeninhalt freisetzen³⁴.
2. Beurteilung der weiblichen Gravitation entweder durch Sichtprüfung während der Entnahme (z. B. Vorhandensein von Mantelködern, Conglutinaten usw.) oder durch Visuelle Inspektion nach der Entnahme (z. B. sanft geöffnete Ventile, die so leicht nach innen schauen und sehen, ob Kiemen aufgeblasen sind, siehe Abbildung 1).
   HINWEIS: Die Arten unterscheiden sich in der Art, wie Glochidia innerhalb der Beutelkiemen brütet werden, da manchmal nur die beiden äußeren Kiemen (ectobranchus), nur die beiden inneren Kiemen (endobranchus) oder alle vier Kiemen (tetragenous) beutelhupial sind¹⁷. Das Protokoll kann hier angehalten werden, und Gravid-Weibchen können zurück ins Labor für Kiemenprobe transportiert werden.

Abbildung 1: Sanft neugierige Personen öffnen sich. Um die Gravitation einer lebenden Muschel zu überprüfen, hebeln Sie die Ventile vorsichtig mit Daumen (A) auf oder verwenden Sie vorsichtig eine Spekulum- oder Umkehrzange, um die Ventile zu öffnen (B). Überprüfen Sie Schritt 2.3 im Protokoll auf Warnungen, die mit dieser Methode verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Führen Sie eine Sichtprüfung an konservierten Proben durch, indem Sie die Ventile öffnen und die Kiemen untersuchen, um festzustellen, ob es sich bei dem Individuum um ein Gravidweibchen handelt (Abbildung 2).

Abbildung 2: Wie man ein Gravid-Weibchen identifiziert. Weibliche Muschel Beutelhelfns erscheinen aufgeblasen, wenn das Weibchen gravid und brütend ist. Die Fotos A und C zeigen Kiemen aus einer seitlichen Perspektive, während die Fotos B und D einen ventralen Blick auf die Kiemen bieten. Rote Kästen umreißen die Kiemen, um die Unterschiede zwischen einer Gravid (A/B) und nicht gravid (C/D) hündinnen Lampsilis straminea Muschel hervorzuheben. Die Gesamtlängen der Individuen betragen 79 mm (A/B) und 88 mm (C/D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Gill-Inhalts-Sampling

HINWEIS: Dieses Protokoll kann angepasst werden, unabhängig davon, ob die Probenahme an lebenden Muscheln im Feld und im Labor oder an konservierten Proben erfolgt.

1. Bereiten Sie ein 1,5 ml Kunststoff-Mikrozentrifugen-Sammelrohr mit ca. 1 ml entweder sterilem Wasser vor, wenn der Kiemengehalt innerhalb von 24 h nach Extraktion³⁵ oder Ethanol (EtOH) bewertet wird, wenn die Probenauswertung nicht innerhalb von 24 h nach der Entnahme erfolgen kann oder wenn Kiemengehalt innerhalb von 24 h der Entnahme Der Inhalt stammt von einem museumsierten Exemplar, das in EtOH aufbewahrt wurde. Wenn Glochidie für Rasterelektronenmikroskop (SEM) Bildgebung bestimmt sind, verwenden Sie 70% EtOH, und wenn Glochidie für genetische Tests verwendet wird, verwenden Sie nicht-denaturierte 95% EtOH³⁶.
2. Entfernen Sie die Papierverpackung für eine sterile 20 G Schrägnadel auf einer 10 ml Spritze. Lösen Sie die Kappe, um die Nadel freizulegen, und bereiten Sie ein 1,5 ml Kunststoffrohr für die Sammlung des Kiemeninhalts vor. Drücken Sie den Griff der Spritze ganz nach unten, so dass sich der schwarze Stopfen an der Linie 0 mL/cc befindet.
   HINWEIS: Bei jeder Probenahme sollte eine sterile Spritze verwendet werden. Eine gebrauchte Spritze kann im Feld sterilisiert werden, indem die Spitze in eine 10%ige Bleichlösung eintaucht, dann die Spritze abspült, indem sie mit 1 ml sterilem Wasser gefüllt und den Kolben wieder auf 0 ml/cc gedrückt und schließlich die Spritze mit einem sauberen Tuch getrocknet wird.
3. Nehmen Sie das gravid Weibchen auf und hebeln Sie die beiden Ventile vorsichtig mit den Daumenspitzen auf.
   VORSICHT: Achten Sie darauf, dem Tier nicht zu schaden. Das Zuöffnen der Ventile zu breit oder zu schnell kann die Adduktorenmuskulatur überdehnen und sterblichkeit verursachen. Dünnschalige Exemplare (z.B. Arten von Anodonta, Leptodea, Utterbackia, etc.) und junge Individuen sind in diesem Schritt besonders gefährdet. Ein kraftvoller Umgang mit zerbrechlichen Arten kann die Schalen knacken und die Sterblichkeit verursachen. In einigen Fällen führt das Drücken dünnschaliger Tiere von den vorderen und hinteren Schalenrändern, während sie auf die ventrale Oberfläche schauen, dazu, dass sich die Schale leicht biegt und klaffen lässt, so dass man die Kiemen beobachten oder die Schalen öffnen und vermeiden kann, die zerbrechliche Shell-Rand.
   HINWEIS: Werkzeuge können verwendet werden, um diesen Schritt zu unterstützen, können aber auch Sterblichkeit verursachen, wenn sie nicht mit Vorsicht verwendet werden und sollten nach Möglichkeit vermieden werden. Zum Beispiel kann ein Spekulum oder modifizierte Satz von Reverse-Zangen verwendet werden, um zu helfen, die einzelne zu öffnen und ein Keil kann verwendet werden, um die Ventile zu öffnen zu stützen. Diese Instrumente sind möglicherweise nicht erforderlich, wenn eine andere Person zur Unterstützung zur Verfügung steht (d. h., eine Person hält das Tier offen, während eine andere die Spritze zur Extraktion manövriert). Das Schädigen oder Trennen des Mantelgewebes vom Periostracum kann Zuseinhaben und Sterblichkeit verursachen³⁷; Daher ist es wichtig, zu vermeiden, dass die Verbindung zwischen dem Mantelgewebe und dem äußeren Rand der Schale getrennt wird.
4. Verwenden Sie die Nadelspitze der Spritze, um sanft ein einzelnes Wasserrohr der aufgeblasenen Beutelkiebe zu durchdringen. Als nächstes schaufeln Sie den Kiemeninhalt vorsichtig aus, indem Sie die abgeschrägte Spitze der Nadel verwenden.
   HINWEIS: Gill-Gehalt hat in der Regel eine milchig-weiße Konsistenz, die auf der abgeschrägten Spitze der Nadel sichtbar sein sollte.
   1. Legen Sie den Inhalt der Spritze direkt in eine Petrischale, wenn ein Mikroskop leicht verfügbar ist. Andernfalls den Inhalt in einem 1,5 ml Kunststoff-Mikrozentrifugenrohr mit vorgesehener Flüssigkeit (siehe Schritt 2.1) zur späteren Auswertung aufbewahren.
      HINWEIS: Minimieren Sie Störungen und Handhabung von Glochidia Proben während des Transports, um Schäden zu vermeiden und reduzierte Lebensfähigkeit^32,35.
5. Aufzeichnung von Informationen über die Gattung-Arten-Identifikation, Gravitationsstatus, Länge des Weibchens (mm), Sammler- und Kontaktinformationen, Bundesland, Grafschaft, Drainage, spezifischerSammelort, Breiten- und Längengrad, eine eindeutige Kennung für die Kiemen Beispiel, eine eindeutige Kennung für die Vermessungswebsite und das Datum der Sammlung, wenn Kiemeninhalt extrahiert wurde (Abbildung 3). Zeichnen Sie einen eindeutigen Bezeichner auf jedem Sammelschiff auf, um genaue Datensätze während des Transports sicherzustellen.
   1. Fotografieren Sie das äußere rechte Ventil der Muschel zur Identitätsprüfung und fügen Sie das Rohr mit der eindeutigen Kennung ein, die im Bild lesbar ist. Optional können Sie andere abiotische und biotische Parameter sammeln, um die Informationen über die Umwelt und die Gemeinschaft zu ergänzen, in der sich die Muschel befand (siehe Abbildung 3 für Vorschläge).

Abbildung 3: Beispiel für ein Feldgravitationsdatenblatt. Genaue Datenberichte sind erforderlich, wenn eine Kiemenprobe entnommen wird, um zuverlässige Informationen zu erhalten. Dies ist ein Beispiel für ein Felddatenblatt mit den minimalen Feldern und zusätzlichen abiotischen Parametern, die zusammen mit jeder Kiemenprobe gesammelt werden sollen. Ausführlichere Informationen finden Sie in Schritt 4.1 im Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Laborbewertung des Kiemengehalts

1. Wenn sich der Kiemeninhalt in einem 1,5 ml-Rohr befindet, in eine Petrischale geben und den Boden der Schale mit Wasser füllen. Wirbeln Sie die Petrischale vorsichtig in einer kreisförmigen Bewegung, um Inhalte in der Mitte der Schale für eine konzentriertere Ansicht der Probe zu sammeln.
   HINWEIS: Das 1,5 ml Rohr muss möglicherweise mit einer Spritzflasche ausgespült oder mit Wasser gefüllte Übertragungspipette übertragen, wenn der Kiemeninhalt an rohrwänden klebt.
2. Legen Sie die Petrischale unter ein Sezierendes Mikroskop, um die Probe zu bewerten. Nehmen Sie nach Möglichkeit ein Foto der Kiemenprobe unter dem Mikroskop auf und beschriften Sie sie mit der eindeutigen Kennung für diese Probe.
   1. Aufzeichnungsergebnisse, deren Entwicklungsstadien in jeder Kiemenprobe vorhanden sind. Verwenden Sie Abbildung 4 als Leitfaden, um jede Entwicklungsphase zu charakterisieren. In einigen Fällen können Weibchen Larven in mehreren Entwicklungsstadien brüten; melden Sie daher jede Entwicklungsphase, die in einer bestimmten Stichprobe beobachtet wurde (z. B. "EGG/DG/IMG/FDG"). Sobald die erhaltenen Glochidie ausgewertet sind, fahren Sie mit Abschnitt 4 fort. Wenn voll entwickelte Glochidie identifiziert werden und EtOH nicht zur Konservierung verwendet wurde, fahren Sie mit Schritt 3.3 fort.
      ANMERKUNG: EGG, Eiermassen; GD, Entwicklung von Glochidia; IMG, unreife Glochidia; FDG, voll entwickelte Glochidia.

Abbildung 4: Darstellungen für verschiedene Stadien der Glochidia-Entwicklung in den Beutelhgills. (A) Eiermassen (EGG) haben eine Membran, die Eier verklumpen lässt. Innerhalb jeder Eimembran befindet sich eine undurchsichtige kugelförmige Masse von Differenzierungszellen. Die undurchsichtige kugelförmige Masse kann sich während der frühen Zellteilung in mehrere kugelförmige Massen aufspalten, sollte aber dennoch als EGG aufgezeichnet werden, bis eine deutliche Muschelform beobachtet wird. (B) Unreife Glochidie (IMG) haben eine ausgeprägte muschelförmige Masse in der Eimembran enthalten. (C) Die sich entwickelnde Glochidie (DG) hat eine ausgeprägte Muschelform, keine Eimembran und unorganisiertes Gewebe im Inneren, oft unscharf im Aussehen. Die Entwicklung von Glochidie (DG) ist nicht reaktiv, wenn sie NaCl ausgesetzt ist, und wird bei der Erfassung von Daten als "DG(T)" klassifiziert. (D) Voll entwickelte Glochidie (FDG) haben die ausgeprägte Muschelform und offensichtliches Adduktorenmuskelgewebe, so dass Glochidia schließen kann. Voll entwickelte Glochidie (FDG) werden oft als zwei offene Ventile nach der Konservierung beobachtet. Zwei offene Ventile werden normalerweise geschlossen oder geöffnet und geschlossen einrasten, wenn sie NaCl ausgesetzt sind, und werden als "FDG(T)" klassifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Führen Sie einen Natriumchloridtest (NaCl) durch, um die Lebensfähigkeit einer voll entwickelten Glochidie weiter zu bewerten, indem Sie einem Teiltropfen der Kiemenprobe³⁵einen Kristall von NaCl hinzufügen. Viable Glochidia reagiert auf NaCl, indem sie ihre Ventile aus einer offenen Position schließen. Melden Sie alle salzgeprüften Glochidie mit '(T)' am Ende der Bezeichnung, wenn Daten aufgezeichnet werden.
   HINWEIS: Voll entwickelte Glochidie kann auch beobachtet werden, aktiv schnappen offen und geschlossen ohne Exposition gegenüber NaCl.

4. Bericht an Datenbank

1. Greifen Sie auf das FMGA-Web (http://arcg.is/089uee) zu, das mit Online-Softwareprogrammen^38,39,40entwickelt wurde. Die FMGA-Seite bietet einen Link zum Desktop-Dateneingabeformular und einen Anwendungsdownload für mobile Geräte. Die mobile App ermöglicht die Dateneingabe im Feld und die automatisierte Georeferenzierung⁴¹.
   HINWEIS: Der Gravitationskalender und andere Grafiken, die mit Lebensgeschichten der Süßwassermuschelart in Verbindung stehen, finden Sie auch im FMGA-Dashboard.
   1. Verwenden Sie die mobile App oder die Desktop-Site, um Ergebnisse im Dateneingabeformular aufzuzeichnen, indem Sie Dropdownmenüs und Texteingabefelder verwenden. Wenden Sie sich für große, bereits vorhandene Datasets an die Autoren für die Vorlagentabelle. Geben Sie aufgezeichnete Daten unter den entsprechenden Spaltenüberschriften ein, wobei zu berücksichtigen ist, dass jeder Datensatz oder jede Zeile in der Kalkulationstabelle Beobachtungen einer Kiemenprobe von einer Gravid-Person darstellt.
   2. Senden Sie die Ergebnisse und sie werden der FMGA-Datenbank hinzugefügt, nachdem sie von einem Administrator validiert wurden, der sich an den Sammler wenden kann, um weitere Details oder Fotos anzufordern.
      HINWEIS: Sobald die Daten in der FMGA-Datenbank validiert und kompiliert wurden, werden alle Gravitationskalender und andere interaktive Grafiken, die auf dem FMGA-Dashboard angezeigt werden, aktualisiert.

Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde während einer Capture-Mark-Recapture-Studie angewendet, die die Süßwassermuschelgemeinschaft in einem 750 m² Abschnitt von Bruce Creek (Walton County, Florida) von Januar 2015 bis Dezember 2015 überwachte. Die Feldprobenahme sollte alle vier Wochen erfolgen; Aufgrund von Hochwasserereignissen wurden die Stichproben jedoch weder im April noch im September 2015 durchgeführt. Staatliche und föderale Behörden, darunter U.S. Geological Survey, U.S. Fish and Wildlife Service und Florida Fish and Wildlife Conservation Commission halfen bei Felduntersuchungen und Kiemenproben. Jedes gravid weibliche Weibchen, das während der Erhebung angetroffen wurde, wurde einer In-Field-Kiemeninhaltsprobe unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls unterzogen, markiert (siehe Tabelle der Materialien),und wieder in das Flusssubstrat gelegt. Die Kiemenproben wurden in 95% EtOH gelagert und zur Bewertung des Kiemengehalts in das Labor des U.S. Geological Survey Wetland and Aquatic Research Center transportiert.

Indem wir Weibchen markieren und sie im Laufe des Jahres monatlich zurückerobern, haben wir sowohl tödliche als auch nicht-tödliche Auswirkungen des Kiemen-Probenahmeprotokolls auf insgesamt 90 Personen ausgewertet. Die folgenden sieben Arten wurden während dieser Studie zurückerobert: Elliptio pullata (n = 5), Fusconaia burkei (n = 1), Hamiota australis (n = 19), Obovaria choctawensis (n = 1), Strophitus williamsi (n = 1), Villosa lienosa (n = 60) und Villosa vibex (n = 3). Unsere Probenahme umfasste Individuen von 24 mm bis 80 mm Gesamtlänge und zwei Arten (F. burkei und H. australis), die durch den U.S. Endangered Species Act geschützt sind. Alle in dieser Studie verwendeten Daten sind öffentlich zugänglich Wir haben Zugriff auf unseren Datensatz auf ScienceBase (https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)⁴²gewährt.

Die Überlebensaufnahme wurde anhand der Zahl der Personen beurteilt, die nach der Sammlung von Kiemenproben lebend zurückerobert wurden. Wir beobachteten eine hohe Überlebenstätigkeit (97%) während der Studie mit einer gewissen Sterblichkeit, die möglicherweise auf Raubübereignungen zurückzuführen ist, die durch Beobachtungen vor Ort angegeben wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass etwa 51 % der Personen (46 von 90) zwischen aufeinanderfolgenden Stichprobenereignissen weiterhin graviiert blieben. Weitere 10% der Individuen (9 von 90) wurden gravid gefunden, nicht gravid zurückerobert und gravid wieder gefunden. Etwa 39% der Personen (35 von 90) in dieser Studie wurden gravid gefunden, eine Kiemenprobe wurde genommen, aber wenn sie im Laufe des Jahres wieder gefangen, wurden sie nie ein zweites Mal gravid gefunden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das hier beschriebene Protokoll weder tödlich noch subtödlich ist und die aktuelle Brutzeit nach der Beprobung der Kiemen nicht wesentlich stört.

Obwohl die Stichprobengrößen in dieser Studie artenübergreifend ungleich sind, unterstreichen die Ergebnisse dieser Studie die nützlichen und praktischen Anwendungen dieses Protokolls. Der Gravitationskalender für V. lienosa zeigt, dass gravid weibchen, die FDG brüten, in fast jedem Monat des Jahres gefunden wurden, außer im August, als nur Weibchen gefunden wurden, die EGG brüten(Abbildung 5A). Das Weibchen H. australis wurde im Juli, August und Dezember nicht gravid (NG) gefunden. Ein größerer Anteil der Frauen brutierte FDG im Januar und Februar, wurde aber auch im Oktober und November gefunden(Abbildung 5B). Es wurden keine Personen von E. pullata gefunden, die FDG brüten, obwohl Weibchen von Mai bis Juni EGG brüten, und ein gravid weibliches Mitglied (GFR) im Juni(Abbildung 5C) aufgezeichnet wurde . Das einzige gravid F. burkei Weibchen wurde im Juni gefunden GFR und wieder gefangen NG im Juli. Die gleiche O. choctawensis Person wurde FDG im Februar gesammelt und wieder gefangen NG im Juli. Nur ein S. williamsi wurde gefunden und dreimal zurückerobert. Diese Hündin wurde FDG im März, NG im Mai, GFR im Juni und EGG im August gefunden (Abbildung 5C). Zwischen Februar und Juni wurden Gravid-Weibchen von V. vibex-BrutfDG gefunden(Abbildung 5C).

Abbildung 5: Ergebnisse der Studie in Bruce Creek, FL, die in einem Gravidity-Kalenderformat angezeigt wird. (A) Gravidity-Kalender für Villosa lienosa-Aufnahmen/Rückeroberungen. (B) Gravidity-Kalender für Hamiota australis fängt/recaptures. (C) Gravidity-Kalender für alle Arten mit weniger als 10 Personen. Die y-Achse enthält Abkürzungen für die Monate Januar (Ja), Februar (F), März (Herr), Mai (My), Juni (Jn), Juli (Jl) August (A), Oktober (O), November (N) und Dezember (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

bedeutung

Die Erhaltung gefährdeter Arten hängt von einer erfolgreichen Rekrutierung innerhalb der vorhandenen Populationen ab. In einigen Fällen kann eine künstliche Vermehrung erforderlich sein, um die Rekrutierung dieser gefährdeten Populationen zu erhöhen. Dies erfordert, dass die Forscher über den Zeitpunkt der aktiven Fortpflanzung für jede Art informiert werden und möglicherweise unterschiedliche Methoden oder Managementpraktiken anwenden, um die Auswirkungen auf die Rekrutierung zu mildern. Als gefährdete Gruppe von Organismen ist es von größter Bedeutung, einen standardisierten und nicht-tödlichen Ansatz für die Untersuchung von Fortpflanzungsgewohnheiten zu etablieren und eine Plattform zu schaffen, auf der Daten zusammengestellt und visualisiert werden können, um die wissenschaftliche Gemeinschaft mit den aktuellsten Informationen zur Verfügung. Diese Studie bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um sicherzustellen, dass Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, und Kiemengehalt kann angemessen von weiblichen Muscheln beprobt und bewertet werden. Dieses Protokoll wurde auf tödliche und nicht-tödliche Auswirkungen getestet, so dass Forscher und Manager diese Methode verantwortungsvoll umsetzen können. Wir haben auch eine Reihe von Datenbankverwaltungstools und -anwendungen entwickelt, um die Zusammenstellung von Gravitationsinformationen auf einem öffentlich zugänglichen, benutzerfreundlichen Dashboard zu erleichtern. Studien über Epidemiologie, Glochidia-Morphologie, Lebensgeschichte, Phylogenetik, Vermehrung und Translokationen können alle davon profitieren und dieses Repository zeitlicher Gravitationsinformationen für alle Arten von Süßwassermuscheln nutzen.

Allein diese Studie stützte frühere Studien über die Ergebnisse einiger Arten, zeigte aber auch neue Informationen über andere. Obwohl V. vibex in weniger Zahlen als V. lienosagesammelt wurde, können Ähnlichkeiten zwischen den beiden auf der Grundlage der Gravitationsdaten gefunden werden. Beide Arten von Villosa scheinen während eines großen Teils des Jahres voll entwickelte Glochidie zu brüten, was sie als überwinternden Brooder charakterisiert. Dies steht im Einklang mit früheren Studien zu anderen Villosa-Arten ^43,44,45. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass H. australis ab Oktober und überwinternd bis Juni gefunden werden kann, außer dass im Dezember keine Aufnahmen gefunden wurden. Eine zuvor veröffentlichte Studie identifizierte Congener H. altilis mit einer Gravitationsperiode von vier Monaten, März bis Juni^46,47. Dieser Befund veranschaulicht eine längere Gravitationszeit als bisher angenommen und gruppiert H. australis im Allgemeinen als überwinternden Brooder. Als bundesweit geschützte Arten könnten unterschiedliche Brutzeiten für H. altilis und H. australis Managemententscheidungen beeinflussen, um Populationen während reproduktiv aktiver Zeiten besser zu schützen. Elliptio pullata wurden erst im Mai und Juni mit EGG gefunden, was ihrer Charakterisierung als tachytische Art mit einer sehr kurzen Brutzeit^{24,48,49entspricht. 50}. Da Daten über Elliptio-Arten unter Verwendung dieses Protokolls zusammengestellt werden, können detaillierte Informationen feldische Bemühungen effizienter machen, wenn bestimmte glochidiale Entwicklungsstadien ins Visier genommen werden, da Glochidia erst wenige Monate im Jahr gefunden werden. Die Schlussfolgerungen der anderen Arten mit niedrigeren Stichprobengrößen sind begrenzt, aber da die Daten in die Datenbank zusammengestellt werden, geben höhere Stichprobengrößen Einen Einblick in die Fortpflanzungsgewohnheiten zusätzlicher Muschelarten.

Verfahrenskommentare

Süßwassermuscheln und ihre Glochidie sind dafür bekannt, anfällig für anthropogene Stressoren zu sein^10,35. Bei der Gravitationsprüfung sind die Muschelventile möglicherweise nicht leicht zu öffnen, und das achtlose Öffnen der Ventile kann unbeabsichtigten Schaden anrichten und zu Stress oder Sterblichkeit führen. Einige zerbrechliche Arten (z.B. Arten von Anodonta, Leptodea, Utterbackia, etc.) und kleinere Individuen können sehr zerbrechliche Schalen und schwache Adduktorenmuskeln haben, die leicht brechen und reißen können. Gill Probenahme könnte als Stressor betrachtet werden, wenn der Umgang nicht verantwortungsvoll und mit Vorsicht durchgeführt wird. Eine frühere Studie ergab, dass handhabung und Luftexposition von Muscheln während reproduktiv aktiver Zeiten verschiedene physiologische Belastungen verursachen können, einschließlich der vorzeitigen Freisetzung von Kiemeninhalten³⁴. Eine Studie, die eine ähnliche Methode wie hier beschrieben verwendete, fand jedoch heraus, dass der Umgang mit gravid weiblichen Muscheln bei der Kiemenprobe die gegenwärtige Brut nicht unterbrach oder eine vorzeitige Freisetzung sowohl bei kurz- als auch bei langzeitbrüstigen Arten verursachte¹⁶. Darüber hinaus muss während dieses Protokolls eine sterile Spritze verwendet werden, um unbeabsichtigte Infektionen oder Kreuzkontaminationen zu verhindern, wenn Kiemen von mehreren Personen durchkreuzen. Darüber hinaus sind Glochidia zerbrechlich und Bruten können gereift und gestresst, aber nicht vertrieben werden. Reife Glochidie in schlechter Gesundheit kann dazu führen, dass weniger Personen auf Salztests reagieren³⁵. Bei der Unterscheidung zwischen DG(T) und FDG(T) ist es wichtig, Salztests mit einem großen Stichprobenumfang zu salzen, Notizen zu beobachtungen zu machen, um die Unterscheidungen zwischen DG und FDG glochidia anhand der in dieser Studie enthaltenen Beschreibungen sorgfältig zu ermitteln. Wenn die richtige Pflege getroffen wird, kann der minimale Stress, der durch dieses Verfahren induziert wird, es weiblichen Muscheln ermöglichen, weiterhin Glochidie auf natürliche Weise zu brüten und die Auswirkungen auf die Rekrutierung in der Bevölkerung zu reduzieren.

Zusätzliche Daten können aufgezeichnet werden, um die Datenbank zu ergänzen und einen breiten Kontext für die Fortpflanzungsgewohnheiten von Süßwassermuscheln zu bieten. Einige Arten (z.B. Arten von Fusconaia), wurden beobachtet, um Kiemen in verschiedenen Farben basierend auf der Entwicklungsstufe der Glochidia⁵¹haben . Bei einer ersten Gravitationsprüfung des Weibchens kann eine Beschreibung der Kiemenfarbe in die gemeldeten Daten aufgenommen werden, um eine zukünftige Untersuchung zu ermöglichen. Auch an dieser Stelle im Protokoll können die Forscher feststellen, ob das brütende Weibchen in den beiden äußeren Kiemen (Ectobranchus), zwei inneren Kiemen (endobranchus) oder allen vier Kiemen (tetragenous) gefunden wurde¹⁷. Diese Informationen können fmGA hinzugefügt werden und helfen, Datenlücken in Bezug auf die Brut für jede untersuchte Art zu füllen. Umweltbedingungen, insbesondere die Wassertemperatur, können im Feld gesammelt und aufgezeichnet werden, um den Gravitationsstatus und den Zeitpunkt von Arten in verschiedenen Latitudinalbereichen genauer zu beobachten. Untersuchungen zeigen, dass Umweltparameter wie Temperatur, Photoperiode, Durchflussrate und Verfügbarkeit von Lebensmitteln Fortpflanzungsereignisse in Süßwassermuscheln^{52,53,54,55 induzieren können. ,56}. Weitere Felder können der Datenbank hinzugefügt werden, da sie eingereicht werden, um zukünftige Forschungsarbeiten über abiotische Faktoren, die die Gravitation beeinflussen, zu fördern. Eine nach unserer Studie modellierte Änderung der Erfassungsmarkierung kann ebenfalls zu diesem Protokoll hinzugefügt werden, was es Forschern ermöglichen würde, die Fortpflanzungsgewohnheiten einer bestimmten Muschel zu überwachen und Informationen über mehrere Bruten pro Jahr zu offenbaren.

Die Genauigkeit der Informationen in der FMGA hängt von der Quelle ab. Zum Beispiel ist die falsche Identifizierung von Süßwassermuscheln häufig, da viele Arten ähnliche äußere Eigenschaften aufweisen, die es schwierig machen, zwischen Arten⁵⁷zu unterscheiden. Eine Kiemenprobe einer falsch identifizierten Person könnte Verwirrung und falsche Informationen für die Brutzeit einer Art verursachen. Wenn eine Kiemenprobe gemacht wird, sollten Fotos von beiden Ventilen (wenn eine Person nicht am Leben ist), außerhalb des rechten Ventils und des Umbo (Scharnier, wo zwei Ventile verbunden sind) gemacht und mit Gravitationsdaten über die Desktop-Website oder mobile Anwendung übermittelt werden. Wir freuen uns auch über Fotos der Kiemeninhalte. Innerhalb der Einreichungsformulare gibt es ein Dropdown-Menü, das es dem Sammler ermöglicht, ihr Vertrauen in die Artenidentifikation anzugeben. Bevor das Protokoll validiert wird, werden diese Informationen bei der Überprüfung der Sammleridentifikation gegen plausible Verteilung usw. berücksichtigt. Aufgrund des hohen Grades der intraspezifischen morphologischen Variation bei Denkoidae-Arten wird die Abgabe von Gewebeproben gefördert und kann zur Erleichterung der molekularen Identifizierung erforderlich sein.

Zukünftige Auswirkungen

Als nicht-tödliche Methode kann dieses Protokoll sowohl auf häufige als auch auf gefährdete Arten angewendet werden. Die Gravitationskalender für gefährdete Arten können Naturschutzmanagern, die mit der Gesetzgebung zu gefährdeten Arten und der Wiederherstellungsplanung zu kämpfen haben, helfen, indem sie Informationen über Zeiträume bereitstellen, in denen Arten reproduktiv aktiv sind. Die staatlichen und föderalen Behörden, die gefährdete Arten verwalten, können die Genehmigungszuweisungen für Zeiten besser beraten, in denen die Art nicht gefährdet und reproduziert wird, und sogar die Ernte von Wirtsfischen in Zeiten begrenzen, in denen Muscheln voll entwickelte Glochidie brüten. Darüber hinaus können Feldbefragungen Arten während nicht reproduktiver Perioden ansprechen, um die Auswirkungen auf Rekrutierungsprozesse zu minimieren. Die öffentlich zugängliche Datenbank FMGA bietet Forschern und Managern ein Werkzeug, um wichtige reproduktive Informationen über alle Zielsüßwassermuschelarten zu erhalten. Die Datenbank wird auch Datenlücken aufzeigen und weitere Forschungen zu artspezifischen Brutmustern fördern. Da das Verständnis eines Artenreproduktionsmusters die Umsetzung angemessener Managemententscheidungen ermöglicht, hoffen wir, dass unser Protokoll und unsere Datenbank die zukünftige Forschung, Erhaltung und Wiederherstellung von Süßwassermuscheln erleichtern.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL snap cap centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510	Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost.
20 G needle on 10 mL disposable syringe	Exelint International	26255	sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2"
Dissecting Microscope	any	any
Marking Pen	Fisher Scientific	13-379-4	This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof.
Molecular grade ethanol	any	any	Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work.
Paper	any	any	Needed to record information on samples collected.
Pen/pencil	any	any	If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine.
Petri dish	DWK Life Sciences (Kimble)	23000-9050	This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used.
Sodium Chloride	any	any	Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this.
Speculum	any	any	Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.
Sterile water	any	any	Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection.
Super glue	Gorilla	Gorilla super glue gel	Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Tags	Hallprint	FPN 8x4	Only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Transfer Pipet	Thermo Scientific Samco	225	This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable.
Tweezers	any	any	Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this.
Waterproof paper	RainWriter	any	Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from.
Wooden pick	any	any	Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.