סטנדרטיזציה של שיטה שאינה קטלנית לאפיון מעמד הרבייה והתפתחות הזחל של מולים מים מתוקים (ביובלויה: Unionida)

Summary

שימור מוסמי מים תלוי בניטור דפוסי הרבייה ותהליכי המינים. מחקר זה מתקן פרוטוקול שאינו קטלני לדגימת תוכן הגיל, אפיון פיתוח זחל ואספקת מאגר דיגיטלי למידע שנאסף. זה פרוטוקול-חבילת מסד הנתונים יהיה כלי חשוב עבור חוקרי מולים בהתאוששות מינים מחויילים.

Abstract

באופן פעיל ניטור העיתוי, פיתוח, דפוסי הרבייה של מינים בסכנת הכחדה הוא קריטי בעת ניהול התאוששות האוכלוסייה. מולים של מים מתוקים הם בין האורגניזמים התאיים ביותר בעולם, אך מידע על התפתחות מוקדמת של זחל (glochidial) ותקופות מהורהר עדיין חסר מינים רבים. מחקרים קודמים התמקדו בשלב המורכב בהיסטוריה של החיים כאשר מולים לנשים מוכנים לפרזיי דגים מארחים, אך מספר מחקרים התמקדו בתקופה המהורהרת ובעיתוי של התפתחות הזחל. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחוקרים בלתי-מאפשרים להעריך את מצב הגראקות לצדפות נשיות. התוצאות של מחקר זה מראים כי שיטה זו אינה משפיעה על יכולתה של מוסזל נקבה להישאר gravid או להפוך שוב gravid לאחר הדגימה כבר בוצעה. היתרון של שיטה זו עשוי להתיר את השימוש במינים מאוימים או בסכנת הכחדה, או באוכלוסיות אחרות של דאגה שימורית גבוהה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש על אנשים שהשתמרו או חי ונבדק על מגוון של מינים של מוסולים. מסד הנתונים המסופק הוא מאגר לרוחב של מידע על עיתוי הרגלי הרבייה ויקל על מחקר מים מתוקים עתידיים, שימור, שחזור ומאמצים.

Introduction

ההתמדה של אוכלוסיות במערכות מים מתוקים תלויה בהצלחת הרבייה והגיוס. עבור אורגניזמים טפיליים, זיהוי המורכבויות של מחזור החיים (למשל, שלבים של פיתוח הזחל ואסטרטגיות האטרקציה המארחת) יכולים לספק תובנות על הרגלי הרבייה של האורגניזם ועל תהליכים קריטיים המשפיעים על הגיוס. מידע כזה הופך להיות חשוב כאשר המינים מוחלשות, והגיוס מוצלח נדרש כדי לקיים את האוכלוסיות הנותרות, או אם ההתאוששות מחייבת את השימוש של התפשטות בשבי להקמת אוכלוסיות extirpated.

מולים מתוקים (bivalvia: unionida) נחשבים לאחת הקבוצות האימפרטיות ביותר של אורגניזמים ברחבי העולם ואוסף של הרגלי הרבייה ספציפיים מינים יכול לסייע במאמצי מחקר^{1,2,3 ,4,5}. עם מעל 800 מינים המוכרים כיום ברחבי העולם, מולים מים מתוקים יש נקודות חמות של גיוון בצפון ובדרום אמריקה, ובדרום מזרח אסיה אבל מידע חיוני להיסטוריה של החיים אינו ידוע עבור זנים רבים^{2, 5,6,7}. משפחות בסדר זה מתאפיינות בכך שיש להן שלבי זחל טפיליים המשלימים את מטמורפוזה לקטינים חיים חופשיים במהלך ההחזקה למארח^7,8. השלב הייחודי של היסטוריית החיים תורם למגוון הביולוגי במערכות מים מתוקים, הנמצאות כרגע במשבר⁹. רמות גבוהות של הפרעה ניתן לייחס איומים אנתרופוגניים רבים כולל זיהום של נתיבי מים, שינוי הגידול והרס, הנחות בשפע וגיוון של דגים מארחים, והקדמה של מין פולשני^1, . בסדר, ^עשר כמו מזינים מסנן benthic מולים לתוך המצע ורגישים מזהמים ומזהמים לנקז לתוך פרשת הזמן¹¹. השחזור של מיני מוססל הוא רלוונטי כפי שהם מספקים מגוון רחב של שירותי המערכת האקולוגית, כולל קיבוע על פחמן, מקור מזון, טיהור מים על ידי מסנן האכלה¹¹. בנוסף, נמצאו מולים לציון בריאות המערכת האקולוגית, לקדם את המגוון הביולוגי ובתורו, להגביר את הגמישות של מערכת אקולוגית¹².

מחקרים רבים של מים מתוקים התמקדו בחקירת דרישות ההיסטוריה המוקדמת של החיים כדי ליידע טוב יותר הערכות סטטוס המינים אסטרטגיות ניהול. משפחות המים המתוקים הרלוונטיים למחקר זה (למשל, היריזיים, מריגריבזיים, יוניאוניתיים) יש אסטרטגיה ייחודית להיסטוריה של החיים שבה הנקבות הזחלים הרימות (גלוצ'ידיה) בזימים של חיות הכיס שלהם⁸. באמצעות מגוון רחב של אסטרטגיות, המורק הנשי מגרש את הגושים הבוגרים מזימים של חיות-כיס כדי לפרזיו מארח בעל חוליות עם גלוצ'ידיה¹³. מחקר על התפתחות glochidial בתוך הזימים שונה מן הטכניקה ניצול מזרקים תת-עורית כדי לדגום נוזל gonadal מתוך מולים לחיות ולהעריך ייצור מגיים^14,15,16. כפי שחוקרים מאומתים מתודולוגיה זו שאינה קטלנית עבור הדגימה לוטה, הוא הותאם עבור הדגימה הגיל של חיות כיס כדי להעריך את התפתחות הרבייה^15,16. התפתחות הרבייה ניתן להשתמש כדי לפענח קשרים פילוגנטי כמו כמה מינים מולים יכול להיות glochidia רק את שני הזימים החיצוניים (ectoברפון), רק את שני הזימים הפנימיים (אנדוצילומטר), או בכל ארבעת הזימים (teטרבלסי) אבל מאפיין זה אינו ידוע על כל מין¹⁷. דפוסים מהורהר בעבר שימשו כדי לסווג מינים מולים על ידי הנקבה שבלולים glochidia במהלך החורף (הדופק האיטי) או לתקופה קצרה בקיץ (טכיון-tic)¹⁸. במהלך החורף, הייתה תמיכה במהלך מחזור הפוריות של מוססל, כאשר מעגל הרבייה של אנדונטה למד¹⁹. עם זאת, ביולוגיה הרבייה הבסיסית נחקרה באופן יסודי יותר במהלך השנים ומצא כי הדיכוטומיה היתה הכללה בוטה ותקופות מהורהר של מינים מסוימים הרבה יותר מורכבים מאשר במקור המשוער^20,21. למשל, מינים של הסוג hyridella (משפחה היאלווניים), גלבולה, ואליטיו (משפחה unionidae) נצפו עם למעלה משלוש ברושים לעונה^22,23, . ^{עשרים וארבע} המורכבות של מינים ספציפיים, ולפעמים אפילו האוכלוסיה מסוימים²⁰, הרגלי הרבייה הובילו פער בידע על העיתוי והמשך של מהורהר, ומספר של ברושים נקבה מוסזל עשוי לייצר.

למרות מזרקים תת-עורית שימשו כדי לחלץ תוכן הגיל, דיווח על התוצאות מסובך בשל חוסר סטנדרטיזציה כדי להבטיח תוצאות דומות בכל המחקרים. בעבר, ארבעה שלבים התפתחותיים של glochidia (כלומר, ביצה, העובר, בוגר, מפותח לגמרי) זוהו ביוניאוניניים אבל לא אומצו לתוך הליך סטנדרטי^16,25,26. מחקרים אחרים הצופים בחברי מרגריבוניים החליף את הסיווג של "גלוצ'ידיה" בלתי-בוגר "עם" פיתוח glochidia, המוביל לבלבול פוטנציאלי^27,28. חוסר עקביות באפיון שלבי התפתחות הזחל השונים הותירו חוקרים רבים כדי לתאר בדרך כלל נקבות מהורהר כ' gravid ', אשר אינו מקיף את המורכבות של התפתחות הזחל. לימודי היסטוריית החיים בביצוע ניסויים בדגי מארח מארחים את הצורך בנקבות gravid עם גלוצ'ידיה מפותחת, אך מידע זה מפוזר לאורך כל הספרות המפורסמת והספרותית שפורסמה^{בשנת 29,30}. כיום, הנתונים חסרים הרגלי הרבייה של מינים רבים של מולים, כולל תזמון של המעבר בין ביצה, glochidia בוגר, ו glochidia מפותח לחלוטין מוכן להחזקה למארחים. לרוב המינים, לא ברור כמה זמן הנקבות מתפתחות באופן מלא ובמהירות מופרית ביצים מופרות. פערי הידע הם לעתים קרובות רחב יותר עבור מינים של דאגה שימורית, אשר מציג את הצורך בשיטה סטנדרטית של חילוץ תוכן הגיל שנבדק להשפעות שאינן קטלניות וניתן לקדם את הקהילה המדעית להשלים מתודולוגיות איסוף נתונים מהזרם המרכזי, מבלי להציג איום על אוכלוסיות מוגנות^24,31,32.

מחקר זה היו שלוש מטרות: 1) פורמליזציה טכניקת דגימה הגיל ולבדוק את זה עבור השפעות קטלניות ושאינן קטלניות על מולים נקבה באתרו, 2) לאפיין שלבים שונים של פיתוח glochidial ולתאר שיטה סטנדרטית של זיהוי ו דיווח על שלבי זחל שונים ו -3) יוצרים מאגר ציבורי עבור הנתונים שנאספו. סקרי שטח, פרוייקטי ניטור ארוכי טווח ואוספי מוזיאונים, כולם מייצגים הזדמנויות עבור הפרוטוקול המתואר כאן כדי להיות מיושם ונתונים נוספים שייאספו עבור גוף מעניין רחב יותר. הפרוטוקול הרשמי כולל מרכיבים חזותיים ותיאורי תווים המבדילים כל שלב בהתפתחות הזחל. על-ידי סטנדרטיזציה של הקטגוריות, התוצאות שנאספו ניתן להשוות בין כל המופעים והמינים. לאחר איסוף הנתונים, ניתן להגיש את כל המידע הכולל למים המתוקים הללו, שהינו מסד נתונים לקבלת מידע מגוון שנאסף באמצעות פרוטוקול זה. המוצר הסופי כדי לאחסן ולקמפל את כל מידע gravidity שנאסף יספק כלי מחקר כדי להקל על מחקר עתידי, שימור, ושחזור מאמצים. השילוב של מתודולוגיה זו לפרויקטים שונים של מולים והגשת הנתונים ל-fmga תרחיב על רוחב הידע הנוגע למצב של מינים של מוסולים במהלך השנה. כקבוצה מאוד מהותית של אורגניזמים, הפרוטוקול הזה ומסד הנתונים המתקבל על הרגלי הרבייה של מולים מים מתוקים הוא חיוני להבנת הדינמיקה של האוכלוסייה ולהקלה על שימור מינים אלה.

Protocol

1. האוסף הנשי של gravid

הערה: הפניה לשירות המים המתוקים של שירות הדגים וחיות הבר מוסזל³³ לקבלת הדרכה כיצד לסקור באופן מכוון את אתר הדגימה עבור מינים מאוימים או בסכנת הכחדה. יש להשיג היתרים פדרליים נאותים לפני איסוף השטח של מינים מוגנים והיתרי מדינה לכל המינים הקיימים.

1. לאסוף מולים חיים מהשדה באמצעות שיטות מישוש-חזותי (צעד 1.2) או להשתמש בדגימות שנשמרו מהמוזיאון (שלב 1.3).
   הערה: חשוב לשמור על מולים מגניבים ורטובים לאחר האיסוף כדי למנוע התייבשות ולהפחית את הלחץ, וטיפול מינימלי של מולים gravid חשוב כדי למנוע הנקבות בטרם עת שחרור תוכן הגיל³⁴.
2. הערכת הבדיקה הנשית על ידי בדיקה חזותית במהלך האיסוף (למשל, נוכחות של המעטפת לפתות, השרירים, וכו ') או על ידי בדיקה חזותית לאחר איסוף (למשל, בעדינות לפתוח שסתומים מספיק כדי להסתכל פנימה ולראות אם הזימים מנופחים, לראות איור 1).
   הערה: המינים משתנים בהתאם לאופן הכדורית בתוך הזימים של חיית הכיס, כאשר לעיתים רק שני הזימים החיצוניים (הטטובראנץ '), רק שני הזימים הפנימיים, או כל ארבעת הזימים (טטרגניים) הם חיות כיס¹⁷. ניתן להשהות כאן את הפרוטוקול, וניתן להעביר נקבות בחזרה למעבדה לדגימת זימים.

איור 1: אנשים בעדינות לחטט לפתוח. כדי לבדוק את הגראקות של מוסזל חי, בעדינות לפתוח את השסתומים עם אגודלים (א) או בזהירות להשתמש בצבת או להפוך פלייר לפתוח את השסתומים (ב). סקור את השלב 2.3 בפרוטוקול לאזהרות המשויכות לשיטה זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. לבצע בדיקה חזותית על דגימות שנשמרו על ידי פתיחת השסתומים ובדיקת הזימים כדי לקבוע אם הפרט הוא נקבה gravid (איור 2).

איור 2: כיצד לזהות נקבה gravid. מתנפח כאשר הנקבה. מהורהרת ומהורהר תמונות A ו-C להראות זימים מנקודת מבט לרוחב בעוד תמונות B ו-D לספק תצוגה הגגתית של הזימים. תיבות אדומות מתווה את הזימים כדי להדגיש את ההבדלים בין gravid (A/B) ולא gravid (C/D) נקבה lampsilis mussel. האורכים הכולל של האנשים הם 79 מ"מ (A/B) ו 88 mm (C/D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. גיל דגימת תוכן

הערה: ניתן להתאים פרוטוקול זה אם הדגימה מתרחשת על מולים חיים בשדה ובמעבדה, או על דגימות שנשמרו.

1. הכנת שפופרת מיקרוצנטריפוגה פלסטיק 1.5 mL עם כ 1 mL של מים סטרילי אם תוכן הגיל יהיה מוערך בתוך 24 h של חילוץ³⁵ או אתנול (אטוח) אם הערכת המדגם לא יכול להתרחש בתוך 24 h של אוסף או אם גיל תכולת המוזיאון. שנשמרה באטוה אם glochidia נועדו לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) הדמיה, השתמש 70% Ath, ואם glochidia ישמש בדיקות גנטיות, להשתמש ללא מדון 95% אטוח³⁶.
2. הסר את עטיפת הנייר עבור אחד סטרילי 20 G משופע מחט עצה על מזרק 10 mL. להתיר את הכובע כדי לחשוף את המחט ולהכין צינור פלסטיק 1.5 mL עבור אוסף תוכן הגיל. דחף את ידית המזרק כל הדרך למטה כך שהפקק השחור נמצא בשורה 0 mL/cc.
   הערה: יש להשתמש במזרק סטרילי בכל פעם שניתן לדגום את תוכן הגיל. מזרק משומש יכול להיות מעוקר בשדה על ידי לטבול את הקצה בתמיסה 10% אקונומיקה, ולאחר מכן שטיפה את המזרק על ידי מילוי אותו עם 1 מ ל של מים סטרילי מדכא את הבוכנה חזרה 0 מ ל/cc, ולבסוף לייבש את המזרק במטלית נקייה.
3. תרימי את gravid נקבה בעדינות לפתוח את שני שסתומים באמצעות קצות האגודלים.
   זהירות: היזהרו לא לפגוע בחיה. פתיחת שסתומים רחב מדי או מהר מדי יכול להאריך את שרירי וני ולגרום לתמותה. בשלב זה מיוצרים דגימות דקות (למשל, מינים של אנדונטה, לפטופה, באטרבקיהוכו ') ואנשים צעירים פגיעים במיוחד. טיפול בכוח מינים שבריריים עלול לפצח את הפגזים ולגרום לתמותה. במקרים מסוימים, לסחוט בעלי חיים דקים מתוך שולי הפגז הקדמי והאחורי, תוך כדי התבוננות על פני השטח הגחוני, יגרום הפגז flex ו משחק מעט, המאפשר אחד להתבונן הזימים או לפתוח את הפגזים ולהימנע מפגיעה השברירי שולי מעטפת.
   הערה: ניתן להשתמש בכלים כדי לסייע בשלב זה, אך יכולים גם לגרום לתמותה אם לא להשתמש בטיפול ויש להימנע ממנה במידת האפשר. לדוגמה, ניתן להשתמש בערכת מעבר או בקבוצה ששונתה של פלייר הפוך כדי לסייע בחטט באדם פתוח ובטריז יכול לשמש כדי לסייע בשימוש בשסתומים הפתוחים. ייתכן שמכשירים אלה אינם נחוצים אם אדם אחר זמין לסייע (כלומר, אדם אחד מחזיק את בעל החיים פתוח בעוד מבצע תמרונים של המזרק לחילוץ). פגיעה או הפרדה של רקמת המעטפת מן הקרום יכול לגרום לעיוותים בצמיחה ותמותה³⁷; לכן, חשוב להימנע מניתוק הקשר בין רקמת המעטפת לבין השוליים החיצוניים של המעטפת.
4. השתמשו בקצה המחט של המזרק כדי לחדור בעדינות לצינור מים אחד של הזימים המנופחים של חיית הכיס. הבא, בעדינות לגרוף את תכולת הגיל על ידי ניצול קצה משופע של המחט.
   הערה: לתוכן הגיל יש בדרך כלל עקביות בלבן חלבי, שאמורה להיות גלויה בקצה השופע של המחט.
   1. הכנס את תוכן המזרק ישירות לצלחת פטרי אם מיקרוסקופ זמין בקלות. אחרת, לאחסן את התוכן בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה פלסטיק 1.5 mL עם נוזל מיועד (ראה שלב 2.1) להערכה מאוחרת יותר.
      הערה: מזער הפרעה וטיפול בדגימות glochidia במהלך התחבורה כדי למנוע נזק מופחת הכדאיות^32,35.
5. הקלטת מידע על סוג מזהה המין, מעמד ה, אורך של נקבה (mm), אספן ופרטי התקשרות, מדינה, מחוז, ניקוז, מיקום אוסף ספציפי, קו רוחב וקו אורך, מזהה ייחודי עבור הזימים לדוגמה, מזהה ייחודי עבור אתר הסקר ותאריך האיסוף אם תוכן הגיל חולץ (איור 3). הקלט מזהה ייחודי בכל אחד מכלי הגבייה כדי להבטיח רשומות נתונים מדויקות במהלך התעבורה.
   1. לצלם את השסתום החיצוני הימני של המוססל לאימות זהות ולכלול את הצינור המסומן עם קריא מזהה ייחודי בתמונה. באופן אופציונלי, לאסוף פרמטרים אביוטיים אחרים וביוטיים כדי להשלים את המידע על הסביבה ואת הקהילה מוסזל נמצא (ראה איור 3 להצעות).

איור 3: דוגמה לגליון נתונים של השדה. יש צורך בדיווח נתונים מדויק אם מדגם הזימים נלקח להפקת מידע אמין. זוהי דוגמה לגליון נתונים של שדה עם השדות המינימליים והפרמטרים האביוטיים המיותרים שייאספו יחד עם כל דגימת זימים. לקבלת מידע מקיף יותר, עיין בשלב 4.1 בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. הערכת מעבדה של תוכן גיל

1. אם תוכן הגיל הוא בצינור 1.5 mL, להעביר אותם צלחת פטרי ולמלא את החלק התחתון של המנה עם מים. מערבולת בעדינות את צלחת פטרי בתנועה מעגלית לאסוף את התוכן במרכז הצלחת לתצוגה מרוכזת יותר של המדגם.
   הערה: שפופרת 1.5 mL אולי צריך להיות ריקון החוצה באמצעות בקבוק השפריץ או להעביר pipet מלא מים אם תוכן הגיל הם דבקים קירות הצינור.
2. מניחים את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ מבתר כדי להעריך את המדגם. במידת האפשר, צלם תמונה של דגימת הזימים מתחת למיקרוסקופ ותייג אותו במזהה הייחודי למדגם זה.
   1. תוצאות ההקלטה של השלבים ההתפתחותיים נמצאים בכל דגימת זימים. השתמש באיור 4 כמדריך לאפיון כל שלב התפתחותי. במקרים מסוימים, הנקבות עשויות להיות הזחלים מהורהר בשלבים התפתחותיים מרובים; לפיכך, דווח על כל שלב התפתחותי שנצפה במדגם נתון (לדוגמה, ' ביצה/DG/IMG/FDG '). ברגע שנשמר glochidia הוערכו, המשך לסעיף 4. אם מזוהים glochidia במלואו ו-אטוה לא שימש לשימור, המשך לשלב 3.3.
      הערה: ביצה, גושים ביצים; די. ג'י, לפתח גלוצ'ידיה; IMG, בוגר glochidia; FDG, מפותח גלוצ'ידיה.

איור 4: ייצוגים עבור שלבים שונים של פיתוח glochidia בזימים חיות-כיס. (א) ביצה מיסות (ביצה) יש קרום שגורם ביצים להתאחד. בתוך כל ממברנה ביצה יש מסה כדורית אטומה של תאים מבדילים. מסה כדורית אטומה עשויה להתפצל לתוך גושים כדוריים מרובים במהלך חלוקת התא המוקדם אבל צריך עדיין להיות מוקלט כמו ביצה עד צורה ברורה שסתום הוא נצפתה. (ב) בוגר glochidia (IMG) יש מסה ברורה בצורת bivalve הכלול בתוך קרום הביצה. (ג) לפתח glochidia (DG) יש צורה ברורה שסתום, לא קרום ביצה, רקמה מאורגנת בתוך, לעתים קרובות מטושטשת המראה. פיתוח גלוצ'ידיה (DG) אינם מגיבים כאשר הם חשופים ל-"די. ג'י" ומסווגים כ-DG (T) כאשר הנתונים נרשמים. (ד) התפתחו במלואו glochidia (fdg) יש את הצורה שסתום ברור וני רקמת שריר המאפשר glochidia לסגור. Glochidia מפותח לחלוטין (FDG) הם נצפו לעתים קרובות שני שסתומים פתוחים לאחר שימור. שני שסתומים פתוחים בדרך כלל הצמד סגור, או הצמד פתוח וסגור, כאשר הם חשופים לנאל ומסווגים ' FDG (T) '. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. התנהלות נתרן כלוריד (מבחן) כדי להעריך עוד יותר את הכדאיות של כל glochidia מפותח במלואו על ידי הוספת גביש של הנאגל ל-droplet תת-ערכה של דגם הזימים³⁵. . באמצעות סגירת השסתומים ממצב פתוח דווח על כל גלוצ'ידיה שנבדק על-ידי מלח עם ' (T) ' בסוף הייעוד כאשר הנתונים נרשמים.
   הערה: glochidia מפותח לחלוטין עשוי להיות גם נצפתה באופן פעיל הצמדה פתוח וסגור ללא חשיפה לנאל.

4. דווח למאגר

1. גישה לאינטרנט של fmga http://arcg.is/089uee, שפותחה באמצעות תוכניות תוכנה מקוונות^38,39,40. הדף FMGA מספק קישור לטופס הזנת הנתונים בשולחן העבודה ולהורדת יישומים עבור מכשירים ניידים. האפליקציה הניידת מאפשרת הזנת נתונים בשדה^וב41האוטומטי.
   הערה: לוח השנה וגרפיקה אחרים המשויכים לאירועי ההיסטוריה של מיני מים מתוקים מוסל החיים ניתן למצוא גם בלוח המחוונים של FMGA.
   1. השתמש ביישום הנייד או באתר שולחן העבודה כדי להקליט תוצאות בטופס הזנת הנתונים על-ידי שימוש בתפריטים נפתחים ובשדות הזנת טקסט. עבור ערכות נתונים גדולות, טרום-קיימות, פנה למחברים עבור גיליון האלקטרוני של התבנית. הזן נתונים מוקלטים תחת כותרות העמודות המתאימות, זכור כי כל רשומה, או שורה בגיליון האלקטרוני, מייצגת תצפיות של דגימת זימים מאדם אחד בודד.
   2. שלח את התוצאות והם יתווספו למסד הנתונים של FMGA לאחר שאומת על-ידי מנהל, שרשאי לפנות לאספן כדי לבקש פרטים נוספים או תמונות.
      הערה: לאחר שהנתונים מאומתים ומצולמים במסד הנתונים של fmga כל לוחות השנה הגרפיים והגרפיקה האינטראקטיבית האחרים המוצגים בלוח המחוונים של FMGA יעודכנו.

תוצאות

פרוטוקול זה הוחל במהלך לכידה-סימן-לשחזר מחקר כי פיקוח על הקהילה מים מתוקים בתוך 750 m² למתוח ברוס קריק (מחוז וולטון, פלורידה) מינואר 2015 עד דצמבר 2015. דגימת שדה תוזמנה להתרחש כל ארבעה שבועות; עם זאת, בשל אירועים בעלי זרימה גבוהה, הדגימה לא נערכה באפריל או בספטמבר של 2015. סוכנויות המדינה והפדרלית כולל המחקר הגאולוגי האמריקני, ארה ב. דגים וחיות בר, והנציבות פלורידה דגים ושימור חיות הבר סייעה בסקרים שטח ודגימה גיל. כל נקבה gravid נתקל במהלך הסקר היה נתון בתוך השדה בדגימת תוכן באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, מתויג (ראה טבלת חומרים), והניח בחזרה למצע הנהר. דגימות הזימים אוחסנו ב-95% אטוח והועברו למעבדה של מרכז המחקר הגיאולוגי בארה ב ובמרכז לחקר המים להערכת תוכן הגיל.

על ידי תיוג נקבות ולכידה מראש אותם במרווחי זמן חודשיים במהלך השנה, הערכנו הן קטלני ולא קטלני השפעות של פרוטוקול דגימה הגיל על סך של 90 אנשים. שבעת המינים הבאים שבעה מינים במהלך המחקר הזה: אליפטי פוללאטה (n = 5), fuמנורת בורוקיי (n = 1), החמיטה הדרומי (n = 19), Obovaria Choctawensis (n = 1), סטרופטוס וויליסי (n = 1), וילזא ל (n = 60) ו וילזא (n = 3). הדגימה שלנו כללה אנשים החל 24 מ"מ עד 80 מ"מ באורך כולל ושני מינים (F. בורוקיי ו H. האוסטרליס) מוגן על ידי מעשה המינים בסכנת הכחדה בארה ב. כל הנתונים הנמצאים בשימוש במחקר זה זמינים לציבור אנו מספקים גישה לערכת הנתונים שלנו על הsciencebase (https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)⁴².

הישרדות היתה העריכו על ידי כמה אנשים שנלקחו בחיים לאחר מדגם הזימים אוסף. הבחנו הישרדות גבוהה (97%) במהלך המחקר עם מספר התמותה, ואולי תורם לירידה מראש, המצוין על ידי תצפיות באתר. התוצאות הראו סביב 51% של אנשים (46 של 90) נמצאו להישאר gravid בין אירועי דגימה רצופים. עוד 10% של אנשים (9 של 90) נמצאו gravid, נתפס מחדש לא gravid, ומצא שוב gravid. כ 39% של אנשים (35 של 90) במחקר זה נמצאו gravid, מדגם הזימים נלקח, אבל כאשר נתפס שוב במהלך השנה, הם מעולם לא נמצאו gravid בפעם השנייה. התוצאות מעידות על כך שהפרוטוקול המתואר כאן אינו קטלני ולא קטלני, ואינו מפריע באופן משמעותי לתקופת הההרהר הנוכחית לאחר דגימת הזימים.

למרות שמידות המדגם במחקר זה אינן שוות על פני מינים, תוצאות ממחקר זה להדגיש את היישומים מועילים ומעשי של פרוטוקול זה. לוח השנה הגרוויתי עבור V. lienosa ממחיש gravid נקבות מהורהר fdg נמצאו כמעט בכל חודש של השנה למעט אוגוסט, כאשר רק נקבות מהורהר ביצה נמצאו (איור 5a). בחודשים יולי, אוגוסט ודצמבר, נמצאו ה-H הדרומי הנשי (NG). חלק גדול יותר של נקבות היו FDG מהורהר בחודשים ינואר ופברואר אבל נמצאו גם באוקטובר ונובמבר (איור 5B). לא אנשים של E. pullata נמצאו מהורהר fdg למרות הנקבות היו ביצה מהורהר ממאי עד יוני, ואחת gravid נקבה הקליט (gfr) בחודש יוני (איור 5c). הגרצ היחיד של בורוקיי הנשי נמצא Gfr בחודש יוני והוא נתפס מחודש יולי. אותו אדם O. choctawensis נאסף fdg בחודש פברואר ושוב בחודש יולי. רק ס. וויליאמס נמצא. והוא נתפס שלוש פעמים נקבה זו נמצאה FDG במרץ, NG בחודש מאי, GFR ביוני, ו ביצה באוגוסט (איור 5C). הנקבות gravid של V. הוויבקס מהורהר fdg נמצאו בין פברואר ויוני (איור 5c).

איור 5: תוצאות המחקר בברוס קריק, פלורידה הציג בפורמט בלוח השנה הגראקות. (א) לוח השנה הגריואני עבור וילזא ל לוכדת/מסכם. (ב) לוח השנה האביבי של ההקוטה הדרומי לוכדת/מסכם. (ג) לוחות שנה של כל המינים עם פחות מ -10 אנשים שנדגמו. ציר y כולל קיצורים עבור החודשים ינואר (Ja), פברואר (ו'), מרץ (מר), מיי (My), יוני (Jn), יולי (Jl) אוגוסט (א), אוקטובר (O), נובמבר (N) ודצמבר (ד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

שמעות

שימור מינים בלתי מוצלחים תלוי בגיוס מוצלח בתוך האוכלוסיות הנמצאות באזור. במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך בהפצה מלאכותית כדי להגדיל את הגיוס של אוכלוסיות בסיכון אלה. זה דורש החוקרים להיות מעודכנים על העיתוי של רבייה פעילה עבור כל מינים ואולי יישום שיטות שונות או נוהלי ניהול להפחתת ההשפעה על הגיוס. כקבוצה מגובשת של אורגניזמים, היא החשובה ביותר להקמת גישה סטנדרטית ובלתי קטלנית לחקר הרגלי הרבייה, ולספק פלטפורמה שבה יש לקמפל ולהמחיש את הנתונים כדי ליידע את הקהילה המדעית עם העדכניות ביותר מידע זמין. מחקר זה מספק פרוטוקול צעד אחר צעד כדי להבטיח אמצעי זהירות נלקחים, ואת תכולת הגיל ניתן לטעום ולהעריך בצורה מספקת של רכיכות נקבה. פרוטוקול זה נבדק להשפעות קטלניות ובלתי קטלניות, ומאפשר לחוקרים ולמנהלים ליישם באחריות את המתודולוגיה הזאת. פיתחנו גם חבילה של כלי ניהול מסדי נתונים ויישומים כדי להקל על ההידור של מידע באופן פומבי על לוח מחוונים ידידותי למשתמש זמין. מחקרים על אפידמיולוגיה, מורפולוגיה glochidia, היסטוריה של החיים, phylogenetics, התפשטות, ו translocations יכולים להועיל ולהשתמש במאגר זה של מידע הגראקות הזמני עבור כל המינים של מולים מים מתוקים.

מחקר זה לבדו תמך ממצאי מחקרים קודמים של הרגלי הרבייה כמה מינים, אך גם חשף מידע הרומן על אחרים. למרות ש -v. vibex נאסף בפחות מספרים מאשר v. lienosa, הדמיון ניתן למצוא בין השניים המבוססים על הנתונים הגרביתיים. שני מינים של וילזא נראה להרהר glochidia מפותח לחלוטין במהלך חלק גדול של השנה, אשר מאפיין אותם כביום overing. הדבר מתאים למחקרים קודמים על מינים ויל, ^43,44,45. התוצאות של מחקר זה מציע H. האוסטרליס ניתן למצוא gravid מאוקטובר וממזג האויר לתוך יוני, למעט לא לכידות נמצאו gravid בדצמבר. מחקר שפורסם בעבר זיהה congener H. altilis עם התקופה הגרווית של ארבעה חודשים, מרץ עד יוני^46,47. ממצא זה ממחיש תקופה ממושכת יותר מאשר מחשבה קודם לכן ובדרך כלל הקבוצה H. האוסטרליס כביום מוגזם. כמין מוגן פדרלי, תקופות מהורהר שונות עבור h. altilis ו -h. האוסטרליס יכול להשפיע על החלטות ניהול כדי להגן טוב יותר על אוכלוסיות במהלך זמנים פעילים מחדש. אליטיו פולטה נמצאו רק gravid עם ביצה במאי ויוני אשר מתאים לאפיון שלהם כמו מינים טקיטיטיים עם תקופה קצרה מאוד מהורהר^{24,48,49, 50}. כאשר הנתונים מודרו על מינים אליפטי באמצעות פרוטוקול זה, מידע מפורט יכול להפוך את מאמצי השטח ליעילים יותר כאשר שלבים מסוימים בפיתוח glochidial מיועדים, מאז glochidial נמצאים רק כמה חודשים מתוך השנה. היסק ממינים אחרים בעלי גדלים נמוכים יותר הוא מוגבל, אך כאשר הנתונים הם הידור לתוך מסד הנתונים, גדלים מדגם גבוה יותר ייתן תובנה הרגלי הרבייה של מינים נוספים מוסזל.

הערות פרוצדורליות

מולים מים מתוקים והגלוצ'ידיה שלהם ידועים כפגיעים לאנתרופוגניים^10,35. במהלך הבדיקה הגריווית, שסתומים מוססל אולי לא קל לפתוח, ולאלץ בחוסר זהירות את השסתומים לפתוח יכול לגרום נזק מכוון ולגרום למתח או תמותה. כמה מינים שבריריים (למשל, מינים של אנדונטה, לפטוdea, באטרבקיה, וכו ') ואנשים קטנים יותר עשויים להיות פגזים שבירים מאוד השרירים וני חלש שיכולים לשבור ולקרוע בקלות. דגימה הגיל יכול להיחשב גורם מלחיץ אם הטיפול לא נעשה באחריות ובזהירות. מחקר קודם מצא כי טיפול וחשיפה אווירית של מולים במהלך זמנים פעילים מחדש עלול לגרום ללחץ פיזיולוגי שונים, כולל שחרור מוקדם של תוכן הגיל³⁴. עם זאת, מחקר ניצול מתודולוגיה דומה כפי שמתואר כאן, נמצא טיפול מולים נקבה במהלך הדגימה הגיל לא לקטוע את הקבוצה הנוכחית או לגרום שחרור מוקדם בשני לטווח קצר וארוך במין מהורהר¹⁶. יתר על כן, מזרק סטרילי צריך לשמש במהלך פרוטוקול זה כדי למנוע זיהום בלתי מכוון או זיהום לחצות כאשר הזימים הדקדמי של אנשים מרובים. בנוסף, glochidia הם שבירים, אפרוחים יכול להיות התבגר הדגיש אבל לא גורשו. Glochidia מבוגרים בבריאות ירודה יכול לגרום לאנשים פחות המגיבים בדיקות מלח³⁵. בעת ביצוע ההבחנה בין DG (T) ו-FDG (T) חשוב לבדוק מלח עם גודל מדגם גדול, לעשות הערות על תצפיות לזהות בקפידה הבדלים בין DG ו-FDG glochidia באמצעות התיאורים המסופקים במחקר זה. כאשר הטיפול הנכון נלקח, הלחץ מינימלי הנגרמת על ידי הליך זה יכול לאפשר מולים נקבה להמשיך glochidia מהורהר באופן טבעי להפחית את ההשפעות על גיוס באוכלוסייה.

ניתן להקליט נתונים נוספים כדי להשלים את מסד הנתונים ולספק הקשר רחב להרגלי הרבייה של מולים מים מתוקים. כמה מינים (למשל, מינים של Fuפמוטים), נצפו יש זימים של צבעים שונים המבוססים על שלב הפיתוח של glochidia⁵¹. במהלך בדיקה ראשונית של הנקבה, ניתן לכלול תיאור של צבע הזימים בנתונים המדווחים כדי לאפשר חקירה עתידית. גם, בשלב זה בפרוטוקול, החוקרים יכולים לשים לב אם הנקבה המהורערת נמצאה גלוצ'ידיה מהורהר בשני הזימים החיצוניים (ectoבראנפה), שני זימים פנימיים (אנדוברפון), או כל ארבעת הזימים (טטרגניים)¹⁷. ניתן להוסיף מידע זה ל-FMGA ולסייע במילוי פערי הנתונים בנוגע להרהר בכל מיני מינים. תנאי הסביבה, במיוחד טמפרטורת המים, ניתן לאסוף ולהקליט בתחום להתבוננות מקיפה יותר של מעמד ותזמון של מינים בטווחי latitudinal שונים. מחקרים מראים כי פרמטרים סביבתיים, כגון טמפרטורה, photoperiod, שיעור הזרימה, וזמינות המזון, עשוי לגרום לאירועי הרבייה במים המתוקים מולים^{52,53,54,55 ,56} שדות נוספים ניתן להוסיף למסד הנתונים כפי שהם מוגשים כדי לקדם מחקר עתידי על גורמים אביוטיים המשפיעים על השפעות. שינוי לכידה-סימן-לשחזר המודל לאחר המחקר שלנו ניתן גם להוסיף לפרוטוקול זה, אשר יאפשר לחוקרים לפקח על הרגלי הרבייה של מוסזל ספציפי ולחשוף מידע על אפרוחים מרובים בשנה.

הדיוק של מידע ב-FMGA חדרים תלוי במקור. לדוגמה, הכזב של מולים מים מתוקים נפוץ בשל מינים רבים שיש להם מאפיינים חיצוניים דומים המתקשים להבחין בין מינים⁵⁷. מדגם זימים מאדם מזויף יכול ליצור בלבול ומידע כוזב לתקופה מהורהרת של מין. אם דגימת זימים נלקח, תמונות צריך להילקח בתוך שני השסתומים (אם הפרט אינו חי), מחוץ לשסתום הימני, ואת המלחת (ציר שבו שני שסתומים להתחבר) והגישו עם נתונים באמצעות האתר השולחני או יישום סלולרי. כמו כן, אנו מברכים תמונות של תוכן הזימים. בתוך טופסי ההגשה יש תפריט נפתח המאפשר לאספן לציין את רמת הביטחון שלהם בנוגע לזיהוי המינים. לפני שהרשומה מאומתת, מידע זה יילקח בחשבון בעת בדיקת זיהוי מלקט מפני הפצה סבירה וכדומה. בשל הרמה הגבוהה של וריאציה מורפולוגית מתוך מינים של Unionidae הגשת דגימות רקמות היא מעודדת וייתכן שיהיה צורך להקל זיהוי מולקולרי.

השלכות עתידיות

כשיטה שאינה קטלנית, ניתן להחיל פרוטוקול זה על מינים נפוצים ומחוקים. לוחות השנה הגרוניים של מינים בלתי מיומנים יכולים לסייע למנהלי שימור העוסקים בחקיקה בסכנת הכחדה ובתכנון שחזור על-ידי מתן מידע לפרקי זמן כאשר מינים פעילים מחדש. המדינה וסוכנויות הפדרלי לנהל מינים בסיכון יכול טוב יותר לייעץ הקצאות לפעמים כאשר המינים אינם פגיעים ולהתרבות, ואפילו להגביל את הקציר של דגים מארחים בזמן מולים הם מהורהר במלואו glochidia. בנוסף, סקרי שטח יכולים למקד את המינים במהלך תקופות שאינן פוריות כדי למזער את ההשפעה לתהליכי הגיוס. מסד הנתונים הנגיש לציבור, FMGA מספק כלי לחוקרים ומנהלים להשיג מידע הרבייה חשוב על כל מיני מטרה מים מתוקים מינים. בנוסף, מאגר המידע ידגיש את פערי הנתונים, תעודד מחקר נוסף על דפוסי המהרהר ספציפיים למינים. מאז ההבנה דפוס הרבייה של המין מאפשר החלטות ניהול נאותה להיות מיושם, אנו מקווים כי הפרוטוקול שלנו ואת מסד הנתונים להקל על המים המתוקים בעתיד מחקר, שימור, והתאוששות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL snap cap centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510	Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost.
20 G needle on 10 mL disposable syringe	Exelint International	26255	sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2"
Dissecting Microscope	any	any
Marking Pen	Fisher Scientific	13-379-4	This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof.
Molecular grade ethanol	any	any	Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work.
Paper	any	any	Needed to record information on samples collected.
Pen/pencil	any	any	If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine.
Petri dish	DWK Life Sciences (Kimble)	23000-9050	This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used.
Sodium Chloride	any	any	Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this.
Speculum	any	any	Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.
Sterile water	any	any	Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection.
Super glue	Gorilla	Gorilla super glue gel	Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Tags	Hallprint	FPN 8x4	Only needed if conducting a capture-mark-recapture study.
Transfer Pipet	Thermo Scientific Samco	225	This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable.
Tweezers	any	any	Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this.
Waterproof paper	RainWriter	any	Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from.
Wooden pick	any	any	Only needed if you want help opening the valves of a live mussel.