Implantación y monitorización por PET/CT de un modelo ortotópico de mesotelioma pleural humano en ratones atímicos

Resumen

Este artículo describe la generación de un modelo de ratón ortotópico de mesotelioma pleural humano mediante la implantación de células de mesotelioma H2052/484 en la cavidad pleural de ratones atímicos inmunocomprometidos. El monitoreo longitudinal del desarrollo de tumores intrapleurales se evaluó mediante tomografía multimodal no invasiva [¹⁸F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography and computed tomography.

Resumen

El mesotelioma pleural maligno (MPM) es un tumor raro y agresivo que surge en el mesotelio que cubre los pulmones, el corazón y la cavidad torácica. El desarrollo de MPM se asocia principalmente con el amianto. Los tratamientos proporcionan sólo una supervivencia modesta, ya que el promedio de supervivencia media es de 9 a 18 meses desde el momento del diagnóstico. Por lo tanto, deben identificarse tratamientos más eficaces. La mayoría de los datos que describen nuevas dianas terapéuticas se obtuvieron de experimentos in vitro y deben validarse en modelos preclínicos in vivo fiables. Este artículo describe uno de estos modelos ortotópicos MPM fiables obtenidos después de la inyección de una línea celular MPM humana H2052/484 en la cavidad pleural de ratones atímicos inmunodeficientes. El trasplante en el sitio ortotópico permite estudiar la progresión del tumor en el entorno natural in vivo. La radiografía molecular de tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT) utilizando la radiosonda clínica [¹⁸F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose ([¹⁸F]FDG) es el método de diagnóstico de elección para examinar a pacientes con MPM. En consecuencia, se utilizó [¹⁸F]FDG-PET/CT para monitorear longitudinalmente la progresión de la enfermedad del modelo ortotópico H2052/484. Esta técnica tiene un alto potencial 3R(Reduce el número de animales, Refine para disminuir el dolor y la incomodidad, y Replace experimentación con animales con alternativas) ya que el desarrollo del tumor puede ser monitoreado de forma no invasiva y el número de animales requeridos podría reducirse significativamente.

Este modelo muestra una alta tasa de desarrollo, un rápido crecimiento tumoral, es rentable y permite una rápida traducción clínica. Mediante el uso de este modelo de MPM de xenoinjerto ortotópico, los investigadores pueden evaluar las respuestas biológicas de un modelo MPM fiable después de intervenciones terapéuticas.

Introducción

El mesotelioma pleural maligno (MPM) es un cáncer asociado con mayor frecuencia a la exposición a fibras de amianto^1,2,3. Aunque el amianto ha sido prohibido en la mayoría de los países occidentales^4,5,6, la incidencia de MPM sigue aumentando^7,8. Recientemente, la exposición de ratones a nanotubos de carbono sugiere que pueden resultar en un riesgo significativo para la salud en los seres humanos^9,10. Los datos sugieren que la exposición a estos productos puede inducir inflamación crónica y cambios moleculares (por ejemplo, pérdida de vías supresoras tumorales) que subyacen a la progresión al mesotelioma maligno. Actualmente, los nanotubos de carbono multipared son uno de los productos más importantes de la nanotecnología y se incorporan cada vez más en diversos productos como compuestos, materiales de almacenamiento de energía, medicina, electrónica y materiales de remediación ambiental.

EL MPM es un cáncer con mal pronóstico, y la mayoría de los pacientes mueren dentro de los dos años posteriores al diagnóstico debido a una eficacia limitada de las modalidades de tratamiento actuales¹¹. La elección del tratamiento para mpM depende de la etapa del cáncer. Para la mayoría de los MPM en estadio temprano (etapa 1 y posiblemente algunos tumores en estadio 2 o 3), el enfoque clínico es una terapia multimodal que incluye la resección quirúrgica de los tumores, asociada a la radioterapia y la quimioterapia^12. Se indica una quimioterapia combinada con cisplatino y pemetrexed para el tratamiento de la mayoría de los pacientes diagnosticados con enfermedad invasiva localmente avanzada, que no es susceptible de resección quirúrgica, o que de otro modo no son candidatos a la cirugía curativa^13,14. Por lo tanto, es urgente desarrollar tratamientos más eficaces para los pacientes con MPM. Sin embargo, hay pocos modelos animales in vivo validados que reflejen la relevancia clínica de MPM. Se han desarrollado varios modelos murianos MPM, pero la mayoría de ellos no recapitulan fielmente los aspectos complejos del microambiente tumoral MPM^15,16,17,18. El uso de MPM inducido por amianto en ratones, modelos de ratón MPM genéticamente diseñados o modelos de trasplante singéneo de líneas celulares MPM murinas están limitados por diferencias fenotípicas y funcionales fundamentales y, en consecuencia, traducen mal nuevos descubrimientos a la clínica. Otros modelos de MPM murinos preclínicos se basan principalmente en xenoinjertos subcutáneos o peritoneales de líneas celulares humanas en ratones inmunodeficientes. Si bien estos modelos son fáciles de controlar y proporcionan datos fundamentales, el microambiente de estos xenoinjertos no es tan comparable a los tumores humanos que deterioran el poder traslacional de la mayoría de estos estudios preclínicos^17,19. Por el contrario, los xenoinjertos ortotópicos reflejan mejor el comportamiento tumoral del paciente y la respuesta al tratamiento, ya que están rodeados de un microambiente similar al que se encuentra en el sitio original del tumor^16.

La toma de imágenes moleculares por [¹⁸F]FDG-PET/CT es el método de elección para monitorear longitudinalmente la progresión de la enfermedad en pacientes con MPM^20,21. Por lo tanto, recurrir a este método de imagen no invasiva promueve en gran medida la traducción de estudios preclínicos a ensayos clínicos^16,22. Además, ayuda a reducir el número requerido de animales, ya que cada animal representa su propio control a lo largo del tiempo.

En este artículo, presentamos un modelo MPM de xenoinjerto ortotópico fiable obtenido después de la inyección de la línea celular MPM humana H2052/484 en la cavidad pleural de ratones atímicos. Junto con la imagen [¹⁸F]FDG-PET/CT, este modelo es un método valioso y reproducible para estudiar los efectos funcionales y mecanicistas de las nuevas estrategias de diagnóstico y tratamientos para MPM humano.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos a continuación fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales y por la oficina estatal de veterinarios de Ginebra, Suiza (Autorización GE/106/16). La línea de células MPM H2052/484 fue establecida y caracterizada en nuestro laboratorio como se detalla en el artículo de Colin DJ y et al.²³. Brevemente, la línea celular H2052/484 se estableció a partir de un tumor torácico obtenido después de una inyección intrapleural de células NCI-H2052 (ATCC) en ratones desnudos inmunodeficientes.

1. Diseño experimental

1. Determine cuántos ratones se necesitan de acuerdo con el experimento utilizando el cálculo estadístico de potencia (por ejemplo, http://powerandsamplesize.com/Calculators/).
2. Al menos una semana antes de la implantación, compre de ocho a diez semanas de edad, ratones desnudos femeninos de edad Foxn1nu nu/nu y alojarlos en un entorno específico libre de patógenos (SPF) durante al menos una semana.

2. Preparación de células para la implantación

1. Calcule cuántas células H2052/484 se necesitan ya que cada ratón se inyecta con 1 x 10⁶ celdas (paso 1.1). Preparar un número adicional de células como inyección a ratones implicará el muestreo de la jeringa.
2. Cultivo de la línea celular MPM H2052/484 en medio RPMI 1640 complementado con 10% (v/v) suero bovino fetal (FBS), 100 unidades/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina en una incubadora de cultivo de tejido a 37 oC con 5% CO₂.
3. Células de cultivo para la implantación de aproximadamente 80% de confluencia (7 x 10⁶ células por plato Petri de 15 cm).
4. Aproximadamente 1 h antes del injerto, prepare las células.
5. Deseche los medios, lave las células con PBS estéril sin calcio y magnesio (10 ml por plato petri de 15 cm) y desprenda las células incubando durante 5 min con 0.05% trypsin-2 mM EDTA (2 mL por plato Petri de 15 cm).
6. Recoger las células en medio RPMI (10 ml por plato Petri de 15 cm) y contar las células utilizando un hemocitómetro.
7. Recoja el número adecuado de células para el número de ratones que se inyectarán teniendo en cuenta como calculado según el paso 1.2.
8. Centrifugar a 300 x g durante 3 min, lavar el pellet celular en 10 ml de medio RPMI sin FBS y volver a centrifugar a 300 x g durante 3 min.
9. Resuspenda las células en un volumen apropiado de medio RPMI sin FBS a una concentración de 1 x 10⁶ celdas por 50 l, ya que cada ratón debe inyectarse con un volumen de 50 l.

3. Implantación de células tumorales

1. Antes de la implantación, prepare el sistema de anestesia y el área quirúrgica en una campana de flujo laminar pulverizando todas las superficies con un desinfectante. Preparar suministros estériles o desinfectados en la campana de flujo laminar, incluido el sistema de anestesia, la almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal del ratón, la solución de yodo de polividona, una jeringa Hamilton de 30 G (por ejemplo, jeringa 705RN, aguja de 30 G-20 mm-Punto Estilo 4), gasas estériles y hisopos de algodón, bisturíes e instrumentos de cirugía desechables estériles y micropipetas y puntas estériles.
2. Mantenga y abra las jaulas de SPF microaisladas en la campana de flujo desinfectada y anestesie un ratón tras otro de acuerdo con la velocidad de injerto. La duración del injerto es de unos 5-10 minutos para los técnicos experimentados.
3. Anestetiza a los ratones induciendo primero con 4–5% de isoflurano. A continuación, mantener bajo anestesia en la almohadilla de calentamiento mientras se injerta con 3% de isoflurano. Determinar la profundidad de la anestesia por la pérdida de reflejo de enderedo por ratón.
4. Una vez anestesiado un ratón, inyectar por vía subcutánea 0,05 mg/kg de buprenorfina como analgésico/postoperatorio.
5. Coloque el ratón en su lado derecho (decúito lateral derecho) en la almohadilla de calentamiento.
6. Limpiar el área quirúrgica con solución de yodo de polividona y hacer una incisión de 5 mm de la piel y limpiar la grasa circundante y los músculos con tijeras contundentes para exponer las costillas.
7. Homogeneizar la suspensión celular a una concentración de 1 x 10⁶ células por medio RPMI sin FBS y cargar 50 ml de la suspensión con la jeringa de Hamilton. Evite las burbujas de aire y limpie la aguja con 70% de alcohol para evitar el injerto no ortotópico de células. Homogeneizar la suspensión celular antes de cada inyección.
8. Inyectar lentamente las células en la cavidad pleural entre las^{costillas 6} y 7 con un ángulo de 30o y una profundidad de 2-3 mm justo debajo de los músculos intercostales. Asegúrese de no inyectar se inyecta en los pulmones manteniendo la aguja justo debajo de las costillas. La aguja debe ser visible por transparencia a través de los músculos(Figura 1A).
9. Cierre la herida con tres a cuatro suturas absorbibles.
10. Almacene a los ratones en un ambiente caliente hasta que despierten.
11. Al día siguiente, repita la inyección de buprenorfina. Monitoree los ratones de acuerdo con el diseño experimental y la autorización.

4. [¹⁸F]FDG-PET/CT Imaging

NOTA: Todos los procedimientos descritos a continuación deben ser aprobados por las instalaciones locales de alojamiento e imágenes para animales. Asegúrese de que los materiales radiactivos se importan, almacenan y manipulan de acuerdo con las normas locales de seguridad de la radiación (por ejemplo, la actividad de las soluciones de stock, el manejo del capó blindado). Las condiciones de SPF se pueden mantener manipulando animales en una campana de flujo laminar y cargándolos en un lecho de escáner compatible con SPF(Figura 1B, C).

1. Monitorear el desarrollo tumoral realizando imágenes PET/CT, una vez a la semana, a partir del día 7 después de la implantación de las células H2052/484. Cada animal representa su propio control a lo largo del tiempo.
2. Evite el socorro de los animales antes de la toma de imágenes transportando ratones a la carcasa de la instalación de imágenes si están disponibles o manténgalos cerca de la instalación.
3. Ratones rápidos para 12-16 h antes de [¹⁸F]FDG-PET/CT que reduce las señales de fondo. Véase Fueger²⁴ que describió el impacto de la manipulación de animales en [¹⁸F]FDG-PET/CT scans.
4. Descontaminar y almacenar el lecho de ratones de acuerdo con las normas locales.
5. Registre todas las veces de las dosis de radiactividad mediciones, inyecciones y tomografías por emisión de arena para poder calcular suV.
6. Ratones precalentados a 30oC durante 30 minutos antes de la inyección de [¹⁸F]FDG que reduce el metabolismo del tejido adiposo marrón (BAT). Por ejemplo, precalentar en cámaras de calefacción, mediante el uso de almohadillas de calefacción o mediante el uso de lámparas infrarrojas.
7. Preparar 3–4 dosis mBq de [¹⁸F]FDG de la solución en stock en 150-200 l de solución salina en jeringas de insulina de 1 ml utilizando un calibrador de dosis. Las jeringas de insulina tienen la ventaja de no tener casi ningún volumen muerto y podrían evitar la medición de la actividad restante después de la inyección.
8. Anestetizar ratones con isoflurano como se describe en el paso 3.3. Pesar ratones y luego inyectar por vía intravenosa 3–4 MBq [¹⁸F]FDG. La inyección retro-orbital es un método de elección, ya que es rápida, fácil y evita problemas de inyección de vena de cola o retraso en la aceptación de la inyección intraperitoneal.
9. Después de la inyección, deje a los ratones despiertos durante 45 minutos en sus jaulas bajo las condiciones cálidas iniciadas en el paso 3.5. La duración de [¹⁸F]FDG la toma es de 1 h; 15 min son normalmente suficientes para cargar ratones en la cama y realizar TC antes de PET.
10. Anestetizar ratones con isoflurano como se describe en el paso 3.3 y cargarlos en el lecho del escáner(Figura 1B).
11. Transfiera la cama al escáner y someta a los animales a una tomografía computarizada centrada en los pulmones. Adquiera exploraciones a 80 kVp, 160 a A, 1024 proyecciones durante una rotación de 360o, con un campo de visión de 74 mm (aumento de 1,6x, ejemplo de adquisición de Triumph)(Figura 1C).
12. Mueva la cama al subsistema PET e inicie la adquisición 1 h después de [¹⁸F]FDG inyección para una duración de 15 min. Con la mayoría de los sistemas PET/CT, la cama se puede mover automáticamente de la TC al PET para mantener el FOV centrado en la misma área.
13. Retire los ratones de la cámara de imágenes y permítales recuperarse en su jaula.
14. Mantener ratones en un área dedicada a la descomposición radiactiva de acuerdo con las reglas locales.

5. Análisis de [¹⁸F]FDG-PET/CT Scans

1. Reconstruir las exploraciones CT realizadas en las condiciones mencionadas anteriormente con una matriz de 512 y un tamaño de voxel de 0.144 mm (algoritmo de proyección posterior filtrada-FBP, software incorporado). Reconstruya los escaneos PET utilizando un algoritmo de 20 iteraciones de un algoritmo Dimension-3 Dimension-OSEM3D de la expectativa de subconjunto ordenado. Calibre las imágenes en Bq/ml escaneando un cilindro fantasma. Co-registre automáticamente las tomografías computarizadas y PET de acuerdo con su solución de software integrada.
2. Analice los volúmenes de los pulmones utilizando el software de análisis(Tabla de materiales).
   1. Cargue los datos CT como referencia (Ref) haciendo clic en el icono Abrir datos. A continuación, cargue los datos PET como entrada (Inp1) haciendo clic en el icono Anexar datos.
   2. Ajuste las escalas de color ("WL") de CT y PET para que contrasten las imágenes para la inspección visual.
   3. Seleccione Herramienta de ROI 3D en el menú desplegable, haga clic en Agregar ROI y asigne al archivo el nombre Pulmones. Haga clic en Algoritmos de segmentación ( Segmentation Algorithms) Umbral de vecindad. Definir entrada como fondo e imagen como referencia. Introduzca Min y Max según los valores de densidad pulmonar del ratón, normalmente -800 y -300 HU. Inspeccione los pulmones renderizados en 3D haciendo clic en el icono vtk y recupere el volumen de la tabla generada haciendo clic en el icono Mostrar tabla.
3. Analizar [¹⁸F]FDG la ingesta de tumores mediante la extracción de los valores máximos de la admisión estándar (SUVmax).
   1. Convierta las imágenes PET calibradas en Bq/ml a SUV seleccionando Aritmética en el menú desplegable, luego Scalar Multiplicar y use inp1 como Seleccionado y Escalar es Bq/mL a factor SUV calculado de la siguiente manera: SUV - Bq (/mL)/(dosis inyectada (Bq)/peso corporal(g)).
   2. Seleccione 3D ROI Tool en el menú desplegable, haga clic en Agregar ROI y asigne al archivo el nombre Tumores. Haga clic en el modo de pintura 3D Esfera. Desmarque 2D solamente. Ajusta el tamaño de la forma y rodea los tumores. Asegúrese de no incluir ninguna señal que interfiera de corazón, por ejemplo. Recuperar el valor SUVmax en la tabla generada haciendo clic en el icono Mostrar tabla.

Resultados

El modelo ortotópico H2052/484
Los modelos de MPM ortotópicos por inyección intratorácica de células cancerosas cultivadas, especialmente células H2052/484 son relativamente fáciles de configurar. Los diferentes pasos descritos anteriormente sólo requieren un conocimiento modesto del cultivo celular y los pasos de la cirugía son accesibles para los experimentadores de animales moderadamente entrenados. Los ratones y células desnudas deben manipularse en condiciones estériles para maximizar ...

Discusión

Este artículo describe un modelo ortotópico original de células MPM H2052/484 inyectadas en la cavidad pleural de ratones atímicos y un método de monitoreo por imágenes PET/CT de animales pequeños. Este modelo se puede implementar con habilidades moderadas de manejo de animales y cirugía y muestra una muy buena tasa de desarrollo. Permite una gran ventana experimental de unas 10 semanas en ratones no tratados y la detección longitudinal no invasiva de tumores tan pronto como 2 semanas después de la inyección.<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-mice bed	Minerve		bed for mice imaging
Athymic Nude-Foxn1n nu/nu	Envigo, Huntingdon, UK	6907F	immunodeficient mouse
Betadine	Mundipharma Medical Company, CH	111131	polyvidone iodine solution
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	14190094	Buffer for cell culture
Fetal bovine serum (FBS)	PAA Laboratories, Pasching, Austria	A15-101	cell culture medium supplement
Insulin syringes	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	324826	syringe for cell injection
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140122	antibiotics for cell culture medium
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	61870010	basal cell culture medium
Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL)	Alloga SA, CH	700320	opioid analgesic product
Triumph PET/SPECT/CT	Trifoil, Chatsworth, CA, USA		imaging equipment
Trypsin	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	25050014	enzymatic cell dissociation buffer
Virkon S 2%	Milian, Vernier, CH	972472	disinfectant
Vivoquant	Invicro, Boston, MA, USA