Имплантация и мониторинг ПЭТ/КТ ортотопической модели плевральной мезотелиомы человека у атимических мышей

Резюме

В этой статье описывается поколение ортотопической мыши модели человека плевральной мезотелиомы путем имплантации H2052/484 мезотелиомы клеток в плевральной полости иммунокомпромиссных атимических мышей. Продольный мониторинг развития интрафлеурных опухолей оценивался с помощью неинвазивной мультимодальной no¹⁸ФЗ-2-фторо-2-дезокси-D-глюкозы позитронно-глюкозной позитронной эмиссионной томографии и компьютерной томографии.

Аннотация

Злокачественная плевральная мезотелиома (MPM) является редкой и агрессивной опухолью, возникающей в мезотелиии, которая покрывает легкие, сердце и грудную полость. Развитие MPM в основном связано с асбестом. Лечение обеспечивает лишь скромную выживаемость, так как средняя продолжительность выживаемости составляет 9-18 месяцев с момента постановки диагноза. Поэтому необходимо определить более эффективное лечение. Большинство данных, описывающих новые терапевтические цели, были получены в ходе экспериментов in vitro и должны быть проверены в надежных доклинических моделях in vivo. В этой статье описывается одна из таких надежных ортотопических моделей MPM, полученных после инъекции человеческой линии клеток MPM H2052/484 в плевральную полость иммунодефицитных атгимических мышей. Трансплантация в ортотопии позволяет изучать прогрессирование опухоли в естественной среде in vivo. Позитронно-эмиссионная томография/компьютерная томография (ПЭТ/КТ) молекулярная томография с использованием клинической no¹⁸F'-2-fluoro-2-deoxy-D-глюкозы^{(No 18}F'FDG) радиотрейд является методом диагностики выбора для обследования пациентов с MPM. Соответственно, для продольного мониторинга прогрессирования заболевания ортотопической модели H2052/484 использовался¹⁸ФЗФГ-ПЭТ/КТ. Этот метод имеет высокий потенциал 3R(Reduce количество животных, Refine для уменьшения боли и дискомфорта, и Replace животных экспериментов с альтернативами), так как развитие опухоли можно контролировать неинвазивно и количество животных, необходимых может быть значительно сокращена.

Эта модель отображает высокий уровень развития, быстрый рост опухоли, является экономически эффективным и позволяет быстро ею клинический перевод. Используя эту ортотопическую модель xenograft MPM, исследователи могут оценить биологические реакции надежной модели MPM после терапевтических вмешательств.

Введение

Злокачественная плевральная мезотелиома (MPM) является рак чаще всего связаны с воздействием асбеста волокон^1,2,3. Хотя асбест был запрещен в большинстве западных стран^4,5,6, заболеваемость MPM по-прежнему растет^7,8. В последнее время воздействие мышей нананотрубки углерода предполагает, что они могут привести к значительному риску для здоровья людей^9,10. Данные показывают, что воздействие этих продуктов может вызвать хроническое воспаление и молекулярные изменения (например, потеря опухолевых путей супрессора), которые лежат в основе прогрессии злокачественной мезотелиомы. В настоящее время многостенные углеродные нанотрубки являются одним из наиболее важных продуктов нанотехнологий и все чаще включаются в различные продукты, такие как композиты, материалы для хранения энергии, медицина, электроника и материалы для восстановления окружающей среды.

MPM является рак с плохим прогнозом, и большинство пациентов умирают в течение двух лет после постановки диагноза из-за ограниченной эффективности текущих методов лечения¹¹. Выбор лечения МПМ зависит от стадии рака. Для большинства ранних стадиях MPM (стадия 1 и, возможно, некоторые стадии 2 или 3 опухоли), клинический подход мультимодальной терапии, включая хирургическую резекцию опухолей, связанных с лучевой терапией и химиотерапией¹². Комбинированная химиотерапия с цисплатином и пеметрексом показана для лечения большинства пациентов с диагнозом прогрессирующее локально инвазивное заболевание, которое не поддается хирургической резекции, или которые в противном случае не являются кандидатами на лечебную операцию^13,14. Поэтому существует настоятельная необходимость в разработке более эффективных методов лечения пациентов СМП. Тем не менее, Есть несколько проверенных моделей in vivo животных, которые отражают клиническую релевантность MPM. Было разработано несколько моделей murine MPM, но большинство из них не подытожают сложные аспекты микросреды опухоли MPM^15,16,17,18. Использование асбеста индуцированной MPM у мышей, генетически модифицированных моделей мыши MPM, или моделей сингенной трансплантации линий клеток Murine MPM ограничены фундаментальными фенотипическими и функциональными различиями и, следовательно, плохо переводят новые открытия в клинику. Другие доклинические модели Murine MPM в основном полагаются на подкожные или перитонеальные ксенотранспланты клеточных линий человека у иммунодефицитных мышей. Хотя эти модели легко контролировать и предоставлять фундаментальные данные, микроокружение этих ксенотрансплантатов не то, что сопоставимы с человеческими опухолями, ухудшающих трансляционную силу большинства из этих доклинических исследований^17,19. И наоборот, ортотопические ксенотрансплантаты лучше отражают поведение опухоли пациента и ответ на лечение, поскольку они окружены аналогичной микросредой, как один найти в первоначальном сайте опухоли¹⁶.

Молекулярная визуализация по No¹⁸F'FDG-PET/CT является методом выбора продольно контролировать прогрессирование заболевания у пациентов с MPM^20,21. Поэтому прибегая к этому неинвазивный метод визуализации, значительно способствует переводу доклинических исследований на клинические испытания^16,22. Кроме того, это помогает уменьшить необходимое количество животных, как каждое животное представляет свой собственный контроль с течением времени.

В этой статье мы представляем надежную ортотопическую модель ксенотрансплантата MPM, полученную после инъекции клеточной линии MPM человека H2052/484 в плевральную полость агимических мышей. Эта модель, в сочетании с изображением No¹⁸F'FDG-PET/CT, является ценным и воспроизводимым методом изучения функциональных и механистических эффектов новых диагностических стратегий и методов лечения МПМ человека.

протокол

Все процедуры, описанные ниже, были утверждены институциональным комитетом по уходу за животными и использованию и ветеринарным государственным отделением в Швейцарии (Authorization GE/106/16). Линия клеток MPM H2052/484 была создана и охарактеризована в нашей лаборатории как подробно описано в статье Colin DJ и и др.²³. Кратко, H2052/484 клеточная линия была создана из грудной опухоли, полученной после интраплеуальной инъекции клеток NCI-H2052 (ATCC) в иммунодефицитных обнаженных мышей.

1. Экспериментальный дизайн

1. Определить, сколько мышей необходимо в соответствии с экспериментом с помощью статистического расчета мощности (например, http://powerandsamplesize.com/Calculators/).
2. По крайней мере за неделю до имплантации, купить от восьми до десяти недель атгимических самок обнаженных мышей Foxn1nu nu/nu и разместить их в конкретных патоген-бесплатно (SPF) окружающей среды, по крайней мере неделю.

2. Подготовка клеток для имплантации

1. Рассчитайте, сколько h2052/484 клеток необходимо, как каждая мышь вводится с 1 х 10⁶ клеток (шаг 1.1). Подготовка дополнительного количества клеток, как инъекция на мышей будет включать в себя выборку шприца.
2. Культура MPM H2052/484 клеточной линии в RPMI 1640 средних дополнен 10% (v/v) сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг /мЛ streptomycin в ткани культуры инкубатора на 37 градусов по Цельсию с 5% CO₂.
3. Культурные клетки для имплантации примерно до 80% слияния (7 х 10⁶ клеток на 15 см чашку Петри).
4. Около 1 ч до прививки, подготовить клетки.
5. Откажитесь от носителей, вымойте клетки стерильными PBS без кальция и магния (10 мл на 15 см петри блюдо) и отсоедините клетки путем инкубации в течение 5 мин с 0,05% трипсин-2 мМ EDTA (2 мл на 15 см Петри блюдо).
6. Соберите клетки в среде RPMI (10 мл на 15 см чашку Петри) и посчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
7. Соберите соответствующее количество клеток для количества мышей, которые будут введены рассматривается как рассчитывается в соответствии с шагом 1.2.
8. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин, мыть клеточные гранулы в 10 мл rpMI среды без FBS и центрифуги снова на 300 х г в течение 3 мин.
9. Повторное приостановку клеток в соответствующем объеме среды RPMI без FBS до концентрации 1 х 10⁶ ячеек на 50 Л, так как каждая мышь должна быть введена с объемом 50 зл.

3. Имплантация опухолевых клеток

1. Перед имплантацией подготовьте анестезию системы и хирургической области в ламинаре потока капот путем распыления всех поверхностей с дезинфицирующим средством. Подготовка стерильных или дезинфицированных поставок в ламинаре потока капот, включая анестезию системы, нагревательная площадка для поддержания температуры тела мыши, поливидон йод ный раствор, 30 G Гамильтон шприц (например, 705RN шприц, 30 G иглы-20 мм-точка стиль 4), стерильная марля и ватные тампоны, стерильные одноразовые скальпели и хирургические инструменты, стерильные микропипеты и наконечники.
2. Храните и откройте микроизолированные SPF-клетки в дезинфицируемом капоте потока и анестезируйте одну мышь за другой в соответствии со скоростью прививки. Длительность прививки составляет около 5-10 мин для экспериментированных техников.
3. Анестезируйских мышей, вызывая первый с 4-5% изолюран. Затем поддерживать под наркозом на грелке при прививке с 3% изолюран. Определить глубину анестезии при потере рефлекса высыхания мышью.
4. После того, как мышь анестезируется, вводят подкожно 0,05 мг/кг бупренорфин в качестве обезболивающее/послеоперационное обезболивание.
5. Поместите мышь на правой стороне (правый боковой decubitus) на грелку.
6. Очистите хирургическую область с раствором йода поливидона и сделать 5 мм разрез кожи и очистить окружающие жир и мышцы тупыми ножницами, чтобы разоблачить ребра.
7. Гомогенизировать суспензию клеток в концентрации 1 х 10⁶ ячеек на 50 Л среды RPMI без FBS и загрузить 50 зл. Избегайте пузырьков воздуха и протрите иглу 70% алкоголя, чтобы избежать неортотопической прививки клеток. Гомогенизировать суспензию клетки перед каждой инъекцией.
8. Медленно впрысните клетки в плевральную полость между^6-м и^7-м ребрами с углом 30 "и глубиной 2-3 мм только под межреберными мышцами. Убедитесь в том, чтобы не вводить в легкие, сохраняя иглу только под ребрами. Игла должна быть видна прозрачностью через мышцы(Рисунок 1А).
9. Закройте рану тремя-четырьмя абсорбируемыми швами.
10. Храните мышей в теплой среде, пока они не проснутся.
11. На следующий день после, повторить бупренорфин инъекции. Мониторинг мышей в соответствии с экспериментальной конструкцией и разрешением.

4. No¹⁸F'FDG-PET/CT Imaging

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, описанные ниже, должны быть одобрены местными объектами размещения животных и визуализации. Убедитесь, что радиоактивные материалы импортируются, хранятся и обрабатываются в соответствии с местными правилами радиационной безопасности (например, деятельность по складских растворов, обработка защитного капота). Условия SPF могут быть сохранены путем манипулирования животных в ламинарном капоте потока и путем загрузки их в SPF-совместимую кровать сканера(рисунок 1B, C).

1. Мониторинг развития опухоли, выполняя ПЭТ/КТ-изображение, один раз в неделю, начиная с 7-го дня после имплантации клеток H2052/484. Каждое животное представляет свой собственный контроль с течением времени.
2. Избегайте бедствия животных до изображения путем транспортировки мышей для визуализации жилья объекта, если имеются или держать их близко к объекту.
3. Быстрые мыши на 12-16 ч до¹⁸F'FDG-PET/CT, который уменьшает фоновые сигналы. См. Fueger^24, который описал влияние обработки животных на¹⁸F'FDG-PET/CT..
4. Обеззараживание и хранение мышей кровать в соответствии с местными правилами.
5. Запись все времена измерения радиоактивности, инъекции и ПЭТ-сканирования, чтобы иметь возможность вычислить внедорожники.
6. Предварительно разогретые мыши при температуре 30 градусов по Цельсию в течение 30 мин до инъекции¹⁸F-FDG, что уменьшает коричневый жировой ткани (BAT) метаболизма. Например, предварительно подогреть в отопительных камерах, с помощью грелковых колодок или с помощью инфракрасных ламп.
7. Приготовьте 3-4 МБК дозы¹⁸F-FDG из запасного раствора в 150-200 л сольника в 1 мл инсулиновых шприцев с помощью калибратора дозы. Инсулинш имеет то преимущество, что почти нет мертвого объема и может избежать измерения оставшейся активности после инъекции.
8. Анестезируйских мышей с изофлураном, как описано в шаге 3.3. Взвешивать мышей, а затем вводить внутривенно 3-4 MBq¹⁸F'FDG. Ретро-орбитальной инъекции является методом выбора, поскольку это быстро, легко и позволяет избежать проблем ы впрыска хвостовой вена или задержки поглощения интраперитонеальной инъекции.
9. После инъекции, оставьте мышей спать в течение 45 минут в своих клетках в теплых условиях, инициированных в шаге 3.5. Продолжительность поглощения¹⁸ФЗФГ составляет 1 ч; 15 мин, как правило, достаточно, чтобы загрузить мышей на кровать и выполнить КТ до ПЭТ.
10. Анестезируйских мышей с изофлураном, как описано в шаге 3.3 и загрузить их на кровать сканера(Рисунок 1B).
11. Перенесите кровать к сканеру и подвергните животных КТ по центру легких. Приобретайте скана на 80 кВт, 160 qA, 1024 проекции во время вращения 360 ", с полем зрения 74 мм (1,6x увеличение, пример Триумф приобретения) (Рисунок 1C).
12. Переместите кровать в подсистему ПЭТ и начните приобретение 1 ч после инъекции¹⁸F'FDG в течение 15 минут. С большинством ПЭТ/ КТ систем, кровать может быть перемещена автоматически из КТ в ПЭТ держать FOV по центру на той же области.
13. Удалить мышей из камеры изображения и позволить им восстановить в клетке.
14. Держите мышей в области, посвященной радиоактивному распаду в соответствии с местными правилами.

5. Анализ¹⁸F'FDG-PET/CT сканирования

1. Реконструкция КТ,3, выполненная в условиях, упомянутых выше, с матрицей 512 и размером с воксель 0,144 мм (алгоритм фильтровальной обратной проекции-FBP, встроенное программное обеспечение). Реконструкция ПЭТ-сканирования с помощью 20 итераций упорядоченного алгоритма ожидания подмноза Максимум-3 Размер-OSEM3D. Калибровать изображения в Bq/mL, сканируя фантомный цилиндр. Автоматически регистрируйте КТ и ПЭТ-сканирование в соответствии со встроенным программным решением.
2. Анализ объемов легких с помощью аналитического программного обеспечения(Таблица материалов).
   1. Загрузите данные КТ в качестве ссылки(Ref), нажав на значок Open Data. Затем загрузите ПЭТ-данные в качестве ввода(Inp1), нажав на значок данных приложения.
   2. Отрегулируйте цветовые весы ("WL") КТ и ПЭТ, чтобы контрастировать изображения для визуального осмотра.
   3. Выберите 3D ROI Tool из выпадающего меню, нажмите на Добавить roI и назовите файл легких. Нажмите на алгоритмы сегментации (ru) Соседство Порогинг. Определите вход как фон и изображение как Ref. Введите Мин и Макс в соответствии с мышью значения плотности легких, как правило, -800 и -300 HU. Проинспектировать 3D оказанные легкие, нажав на значок vtk и получить объем в таблице, генерируемой, нажав на значок Таблицы Показать.
3. Проанализируйте^{поглощение 18}F'FDG в опухолях, извлекая максимальные стандартные значения поглощения (SUVmax).
   1. Преобразуйте ПЭТ-изображения, откалиброванные в Bq/mL для внедорожника, выбрав арифметику из выпадающего меню, затем Scalar Multiply и используйте inp1 как Выбранный и Scalar - Bq/mL для фактора внедорожника, рассчитанного как последующий: SUV q (Bq/mL)/(впрыскаемая доза (Bq)/вес тела(g)).
   2. Выберите 3D ROI Tool из выпадающего меню, нажмите на Добавить ROI и назовите файл Опухоли. Нажмите на режим 3D краски (ru) Сфера. Uncheck 2D только. Отрегулируйте размер формы и окружите опухоли. Убедитесь в том, чтобы не включать каких-либо помех сигналов, поступающих от сердца, например. Получить значение SUVmax в таблице, генерируемой нажатием на значок таблицы Show.

Результаты

Ортотопическая модель H2052/484
Ортотопические модели MPM путем внутриторакальной инъекции культивированных раковых клеток, особенно H2052/484 клеток относительно легко настроить. Различные шаги, описанные выше, требуют только скромных знаний клеточной культуры, и этапы операции д?...

Обсуждение

В этой статье описывается оригинальная ортотопическая модель клеток MPM H2052/484, впрыскиваемых в плевральную полость агимических мышей, и метод мониторинга с помощью изображения ПЭТ/КТ у мелких животных. Эта модель может быть реализована с умеренной обработки животных и хирургии навыки и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-mice bed	Minerve		bed for mice imaging
Athymic Nude-Foxn1n nu/nu	Envigo, Huntingdon, UK	6907F	immunodeficient mouse
Betadine	Mundipharma Medical Company, CH	111131	polyvidone iodine solution
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	14190094	Buffer for cell culture
Fetal bovine serum (FBS)	PAA Laboratories, Pasching, Austria	A15-101	cell culture medium supplement
Insulin syringes	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	324826	syringe for cell injection
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140122	antibiotics for cell culture medium
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	61870010	basal cell culture medium
Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL)	Alloga SA, CH	700320	opioid analgesic product
Triumph PET/SPECT/CT	Trifoil, Chatsworth, CA, USA		imaging equipment
Trypsin	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	25050014	enzymatic cell dissociation buffer
Virkon S 2%	Milian, Vernier, CH	972472	disinfectant
Vivoquant	Invicro, Boston, MA, USA