小鼠中人类胸膜皮质瘤的PET/CT的植入与监测

摘要

本文介绍了通过将H2052/484中皮瘤细胞植入免疫功能性贫血小鼠胸腔，生成人类胸膜中皮瘤的正交小鼠模型。通过非侵入性多式联运 =¹⁸F_-2-fluo-2-脱氧-D-葡萄糖正电子发射断层扫描和计算机断层成像，对胸腔内肿瘤的发展进行了纵向监测。

摘要

恶性胸膜内皮瘤（MPM）是一种罕见的、具有攻击性的肿瘤，在覆盖肺部、心脏和胸腔的中皮内出现。MPM 开发主要与石棉相关。治疗只能提供适量的存活率，因为中位平均存活率从诊断时起为9-18个月。因此，必须确定更有效的治疗方法。描述新治疗靶点的大多数数据都是从体外实验中获得的，需要在可靠的体内临床前模型中进行验证。本文介绍了一种在将人类MPM细胞系H2052/484注射到免疫缺陷贫血小鼠胸腔后获得的这种可靠的MPM正位模型。在正交位位移植允许研究肿瘤在自然体内环境的进展。正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）分子成像使用临床^[18F+-2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖（=¹⁸F_FDG）放射跟踪器是检查MPM患者的首选诊断方法。因此，使用¹⁸F_FDG-PET/CT 纵向监测 H2052/484 正射模型的疾病进展。这种技术具有很高的3R潜力（Reuce动物的数量，Refine以减轻疼痛和不适，和Replace动物实验与替代品），因为肿瘤的发展可以监测非侵入性和动物的数量可以大大减少。

该模型显示高开发率，快速肿瘤生长，是成本效益，并允许快速临床翻译。通过使用这个正交异种性异种性MPM模型，研究人员可以评估治疗干预后可靠MPM模型的生物反应。

引言

恶性胸膜内皮瘤（MPM）是一种癌症，最常见的是与接触石棉纤维^1，2，3。虽然石棉在大多数西方国家已被禁用4，5，6，MPM的发病率仍然增加^7，8。最近，老鼠接触碳纳米管表明，它们^{可能导致人类健康}风险^很大。数据表明，接触这些产品可能导致慢性炎症和分子变化（例如，肿瘤抑制途径的丧失），从而导致恶性间皮瘤的恶化。目前，多壁碳纳米管是纳米技术最重要的产品之一，并越来越多地被纳入各种产品，如复合材料、储能材料、医药、电子和环境修复材料。

MPM是一种预后不佳的癌症，大多数患者在诊断后两年内死亡，因为目前治疗方式¹¹的疗效有限。MPM治疗的选择取决于癌症阶段。对于大多数早期MPM（阶段1，可能一些阶段2或3肿瘤），临床方法是一种多模态疗法，包括肿瘤的手术切除，与放疗和化疗¹²相关。结合顺铂和pemxed联合化疗，用于治疗大多数被诊断为晚期局部侵入性疾病的患者，即不适合手术切除，或否则不适合治疗手术^13，14。因此，迫切需要为MPM患者开发更有效的治疗方法。然而，很少有经过验证的体内动物模型能够反映MPM的临床相关性。几个小鼠MPM模型已经开发，但其中大多数没有忠实地重述MPM肿瘤微环境^{15，16，17，18}的复杂方面。在小鼠、基因工程MPM小鼠模型或鼠MPM细胞系协同移植模型中使用石棉诱导的MPM受到基本表型和功能差异的限制，因此，将新发现转化为临床效果不佳。其他临床前小鼠MPM模型主要依靠免疫缺陷小鼠的人类细胞系的皮下或围肠异种移植物。虽然这些模型很容易监测和提供基本数据，但这些异种移植物的微观环境并不与人类肿瘤相媲美，损害大多数这些临床前研究的转化能力^17，19。相反，正交异种移植更好地反映患者的肿瘤行为和治疗反应，因为他们被一个类似的微环境包围，在原始肿瘤部位¹⁶发现。

分子成像由+¹⁸F_FDG-PET/CT是纵向监测MPM^20，21患者疾病进展的首选方法。因此，采用这种非侵入性成像方法，极大地促进了临床前研究转化为临床试验^16，22。此外，它有助于减少所需的动物数量，因为每只动物代表自己的控制随着时间的推移。

在本文中，我们提出了一个可靠的正交异种异种移植MPM模型后，获得的人MPM细胞系H2052/484注射到胸腔的贫血小鼠。结合¹⁸F_FDG-PET/CT成像，该模型是研究新的诊断策略和治疗人体MPM的功能和机械效应的宝贵和可重复的方法。

研究方案

下文描述的所有程序均经机构动物护理和使用委员会以及瑞士日内瓦兽医国家办公室（授权 GE/106/16）批准。MPM细胞系H2052/484在我们的实验室建立和特征，详细在科林DJ等人^{的文章23。}简单地说，H2052/484细胞系是从将NCI-H2052（ATCC）细胞注射到免疫缺陷裸鼠体内后获得的胸腔肿瘤建立的。

1. 实验设计

1. 使用统计功率计算（例如http://powerandsamplesize.com/Calculators/）根据实验确定需要多少只小鼠。
2. 植入前至少一周，购买八到十周大的贫血雌性裸鼠Foxn1nu/nu，并在无特定病原体（SPF）环境中放置至少一周。

2. 用于植入的细胞制备

1. 计算每只小鼠注射 1 x 10⁶个细胞时需要多少个 H2052/484 细胞（步骤 1.1）。准备额外的细胞数量，作为注射小鼠将涉及注射器取样。
2. 在 RPMI 1640 培养基中培养 MPM H2052/484 细胞系，辅以 10% （v/v） 胎儿牛血清 （FBS）、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素，在组织培养箱中，在 37°C，CO₂.
3. 培养细胞植入约80%汇合（+7 x 10⁶细胞每15厘米培养皿）。
4. 移植前约1小时，准备细胞。
5. 丢弃介质，用无菌PBS清洗细胞，不含钙和镁（每15厘米培养皿10 mL），通过孵育5分钟，用0.05%胰蛋白酶-2 mM EDTA（每15厘米培养皿2 mL）分离细胞。
6. 收集RPMI培养基（每15厘米培养皿10 mL）的细胞，并使用血细胞计计算细胞。
7. 根据步骤 1.2 计算，收集要注射的小鼠数量的适当细胞数。
8. 在 300 x g下离心 3 分钟，在没有 FBS 的情况下用 10 mL RPMI 培养基清洗细胞颗粒，并在 300 x g下再次离心 3 分钟。
9. 在没有FBS的适当量的RPMI培养基中重新悬浮细胞，每50μL的浓度为1 x 10⁶个细胞，因为每只小鼠必须注入50μL的体积。

3. 肿瘤细胞植入

1. 在植入之前，通过喷洒消毒剂喷涂所有表面，在层流罩中准备麻醉系统和手术区域。在层流罩中准备无菌或消毒用品，包括麻醉系统、用于保持小鼠体温的加热垫、聚维酮碘溶液、30 G 汉密尔顿注射器（例如，705RN 注射器、30 G 针-20 mm-Point 样式 4），无菌纱布和棉签、无菌一次性手术刀和手术器械以及无菌微移液器和吸头。
2. 在消毒的流量罩中保持并打开微隔离的SPF-笼，并根据嫁接速度对一只又一只老鼠进行麻醉。对于实验技术人员来说，移植时间约为 5-10 分钟。
3. 麻醉小鼠首先诱导4-5%的异常。然后在加热垫上保持麻醉，同时用3%异二苯进行移植。通过鼠标失去正确的反射来确定麻醉的深度。
4. 一旦小鼠被麻醉，注射皮下0.05毫克/千克丁丙诺啡作为镇痛/术后止痛。
5. 将鼠标放在加热垫上的右侧（右侧侧下）。
6. 用聚维酮碘溶液清洁手术区域，用钝剪刀切开皮肤5毫米切口，用钝剪刀清除周围的脂肪和肌肉，露出肋骨。
7. 在没有FBS的情况下，以每50μLRPMI培养基的1 x10⁶细胞的浓度对细胞悬浮液进行均质化，并使用汉密尔顿注射器加载50μL的悬浮液。避免气泡，用70%酒精擦拭针头，以避免细胞非正交。每次注射前，使细胞悬浮液均匀化。
8. 缓慢地将细胞^{注入6排和7肋}骨之间的胸腔，角度为30°，深度为2~3毫米，正好在间质肌肉下方。确保不要将针头放在肋骨下方，不要注射到肺部。针应该通过肌肉的透明度可见 （图 1A）。
9. 用三到四个可吸收缝合线合伤口。
10. 将小鼠存放在温暖的环境中，直到它们醒来。
11. 第二天，重复丁丙诺啡注射。根据实验设计和授权对小鼠进行监测。

4. •¹⁸F_FDG-PET/CT 成像

注:以下描述的所有程序必须经过当地动物住房和成像设施的批准。确保根据当地辐射安全规则（例如，库存溶液活性、屏蔽罩处理）进口、储存和处理放射性物质。SPF条件可以通过在层流罩中操作动物并在与 SPF 兼容的扫描仪床上加载来保持（图 1B，C）。

1. 从植入H2052/484细胞后的第7天开始，每周监测一次执行PET/CT成像的肿瘤发育。每只动物都代表它自己的控制时间。
2. 在成像前，避免动物遇险，将小鼠运送到成像设施（如有）或使其靠近设施。
3. 快速小鼠12-16小时之前 *¹⁸F_FDG-PET/CT，减少背景信号。见Fueger^24，他描述了动物处理对18F_FDG-PET/CT扫描的影响。
4. 根据当地规则，对老鼠床进行净化和储存。
5. 记录所有时间的放射性剂量测量，注射和PET扫描，以便能够计算SUV。
6. 在注射 [¹⁸F_FDG]之前，在30°C下预加热小鼠30分钟，减少棕色脂肪组织（BAT）代谢。例如，在加热室中预热，使用加热垫或使用红外灯。
7. 使用剂量校准器，在 1 mL 胰岛素注射器中从 150-200 μL 的盐水中从库存溶液中制备 3⁄4 MBq 剂量 =¹⁸F_FDG。胰岛素注射器具有几乎无死体积的优点，可以避免测量注射后的剩余活动。
8. 如步骤 3.3 所述，使用异常胶对小鼠进行麻醉。称量小鼠，然后静脉注射3⁄4 MBq =¹⁸F_FDG。逆轨注射是一种选择的方法，因为它快速，容易，避免尾静脉注射问题或延迟接受腹内注射。
9. 注射后，在步骤3.5启动的温暖条件下，让小鼠在笼子里保持清醒45分钟。+¹⁸F_FDG 的接受时间为 1 小时;15分钟通常足以将小鼠装载在床上，并在 PET 之前执行 CT。
10. 如步骤 3.3 所述，使用异常胶对小鼠进行麻醉，并将其加载到扫描仪床上（图 1B）。
11. 将床转移到扫描仪，并让动物进行以肺部为中心的CT扫描。在 360° 旋转期间以 80 kVp、160 μA、1024 投影进行扫描，视野为 74 mm（1.6 倍放大倍率，凯旋采集示例）（图 1C）。
12. 将床移到 PET 子系统，并在¹⁸F_FDG 喷射后 1 小时后开始采集，持续时间为 15 分钟。对于大多数 PET/CT 系统，床可以自动从 CT 移动到 PET，以保持 FOV 居中于同一区域。
13. 将小鼠从成像室中取出，使其在笼子里恢复。
14. 根据当地规定，将老鼠留在一个专门用于放射性衰变的区域。

5. 分析¹⁸F_FDG-PET/CT 扫描

1. 重建CT扫描在上述条件下执行，矩阵为512，体素尺寸为0.144毫米（过滤后投影-FBP算法，内置软件）。使用有序子集期望最大-3 维-OSEM3D 算法的 20 次迭代重建 PET 扫描。通过扫描幻像圆柱体校准 Bq/mL 中的图像。根据您的内置软件解决方案自动共同注册 CT 和 PET 扫描。
2. 使用分析软件 （材料表） 分析肺体积。
   1. 通过单击"打开数据"图标加载 CT 数据作为参考 （参考）。然后通过单击"追加数据"图标将 PET 数据加载为输入 （Inp1）。
   2. 调整 CT 和 PET 的色阶（"WL"）以对比图像以进行目视检查。
   3. 从下拉菜单中选择3D ROI 工具，单击"添加 ROI"并命名文件Lungs。单击细分算法|邻域阈值.将输入定义为"背景"，将图像定义为参考。根据小鼠肺密度值输入最小值和最大值，通常为 -800 和 -300 HU。通过单击vtk图标检查 3D 呈现的肺，并检索通过单击显示表图标生成的表中的音量。
3. 通过提取最大标准吸收值 （SUVmax） 分析 =¹⁸F_FDG 在肿瘤中的吸收。
   1. 将 Bq/mL 中校准的 PET 图像转换为 SUV，从下拉菜单中选择算术，然后Scalar 乘法并使用inp1作为"选定"，Scalar为 Bq/mL，以 SUV 因子计算如下:SUV = （Bq/mL）/（注射剂量 （Bq）/体重 （g）。）。
   2. 从下拉菜单中选择3D ROI 工具，单击"添加 ROI"并命名文件"肿瘤"。单击3D 绘制模式|球体.仅取消选中2D。调整形状的大小并环绕肿瘤。例如，请确保不包含来自心脏的任何干扰信号。通过单击显示表图标来检索表中生成的表中的 SUVmax 值。

结果

H2052/484 正射模型
通过胸腔内注射培养癌细胞，特别是H2052/484细胞进行正交MPM模型，设置相对容易。上述不同步骤只需要适度的细胞培养知识，而中等训练的动物实验者可以进入手术步骤。裸体小鼠和细胞应在无菌条件下操作，以最大化植入的结果。通过仔细遵循这个方案，包括短暂的麻醉和最小的手术，我们只遇到1死亡在266小鼠注射不同的MPM细胞系。在266只被仔细注射的小鼠中?...

讨论

本文介绍了注射在贫血小鼠胸腔中的MPM H2052/484细胞的原始正交模型，以及一种通过小动物PET/CT成像进行监测的方法。该模型可以实施与适度的动物处理和手术技能，并显示一个非常好的发展速度。它允许在未治疗的小鼠中，在未治疗的小鼠中留出约10周的大实验窗口，并在注射后2周内对肿瘤进行非侵入性纵向检测。

正交模型依赖于将活细胞或组织直接植入肿瘤的初始环境中?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-mice bed	Minerve		bed for mice imaging
Athymic Nude-Foxn1n nu/nu	Envigo, Huntingdon, UK	6907F	immunodeficient mouse
Betadine	Mundipharma Medical Company, CH	111131	polyvidone iodine solution
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	14190094	Buffer for cell culture
Fetal bovine serum (FBS)	PAA Laboratories, Pasching, Austria	A15-101	cell culture medium supplement
Insulin syringes	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	324826	syringe for cell injection
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140122	antibiotics for cell culture medium
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	61870010	basal cell culture medium
Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL)	Alloga SA, CH	700320	opioid analgesic product
Triumph PET/SPECT/CT	Trifoil, Chatsworth, CA, USA		imaging equipment
Trypsin	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA	25050014	enzymatic cell dissociation buffer
Virkon S 2%	Milian, Vernier, CH	972472	disinfectant
Vivoquant	Invicro, Boston, MA, USA