Estimación estereológica de la longitud de la fibra colinérgica en el núcleo basalis de Meynert del cerebro del ratón

Resumen

La longitud de la fibra neuronal dentro de una estructura tridimensional de una región cerebral es un parámetro confiable para cuantificar la integridad estructural neuronal específica o la degeneración. Este artículo detalla un método de cuantificación estereológica para medir la longitud de la fibra colinérgica dentro del núcleo basalis de Meynert en ratones como ejemplo.

Resumen

La longitud de los axónicos colinérgicos u otros axónicos neuronales en varias regiones cerebrales a menudo se correlacionan con la función específica de la región. La estereología es un método útil para cuantificar los perfiles neuronales de varias estructuras cerebrales. Aquí proporcionamos un protocolo de estereología basado en software para estimar la longitud total de las fibras colinérgicas en el núcleo basalis de Meynert (NBM) del antebrazo basal. El método utiliza una sonda de bola espacial para estimaciones de longitud. Las fibras colinérgicas se visualizan mediante la colina acetiltransferasa (ChAT) inmunomanchado con el líquido rábano peroxidasa-diaminobenzidina (HRP-DAB) sistema de detección. El protocolo de tinción también es válido para la estimación de fibra y número de célula en varias regiones cerebrales utilizando software de estereología. El protocolo de estereología se puede utilizar para la estimación de cualquier perfil lineal como fibras colinoceptivas, fibras dopaminérgicas/catecolaminas, fibras serotonérgicas, procesos de astrocitos o incluso perfiles vasculares.

Introducción

Las estimaciones cuantitativas de longitud y/o densidad de las fibras nerviosas en el cerebro son parámetros importantes de los estudios neuropatológicos. La longitud de los axónicos colinérgicos, dopaminérgicos y serotonérgicos en varias regiones cerebrales a menudo se correlacionan con las funciones específicas de la región. Debido a que la distribución de estos axones es generalmente heterogénea, la estereología basada en el diseño se utiliza para evitar sesgos durante el muestreo. La sonda de bola espacial de estereología ha sido diseñada para proporcionar medidas eficientes y confiables de estructuras similares a líneas como fibras neuronales en una región de interés¹. La sonda hace una esfera virtual que se impone sistemáticamente en el tejido para medir las intersecciones de línea con la superficie de la sonda. Debido a que es imposible poner sondas de esfera en el tejido para su análisis, el software disponible comercialmente proporciona una esfera tridimensional virtual (3D), que es básicamente una serie de círculos concéntricos de varios diámetros que representan la superficie de la sonda de esfera.

La neurodegeneración colinérgica selectiva es una de las características consistentes de la enfermedad de Alzheimer (AD)^2,3,4. Transmisión colinérgica disfuncional se considera un factor causal para el deterioro cognitivo en AD. Disfunción colinérgica también es evidente en muchos otros trastornos mentales como el Parkinson, adicción, y la esquizofrenia. Diferentes aspectos de la neurodegeneración colinérgica se estudian en modelos animales (por ejemplo, reducción en la acetilcolina⁵, proteína ChAT⁶, neurodegeneración de fibra colinérgica en las proximidades de las placas amiloideas^6,y disminución de fibras colinérgicas y varicosidades sinápticas^7,8). Se cree que la degeneración de la fibra tiene lugar antes que la pérdida neuronal, porque la pérdida neuronal colinérgica no siempre se observa en los estudios. La mayoría de las neuronas colinérgicas están en el antecebrano basal y el tallo cerebral, y sus axones se proyectan a varias regiones cerebrales como los cortices y el hipocampo. NBM está situado en el antecebra basal y se encuentra como una de las áreas cerebrales comúnmente afectadas en AD.

El método fraccionador de estereología se basa en el muestreo aleatorio sistemático de un tejido en múltiples niveles. La fracción de muestreo de sección (SSF) es el muestreo sistemático no basado en computadora de secciones para el método de estereología fraccionador. La fracción de muestreo de área (ASF) es el fraccionamiento de un área de la región de interés en la sección. Fracción de muestreo de espesor (TSF) es el fraccionamiento del espesor de una sección. La sonda de bola espacial nos permite cuantificar perfiles de interés en una esfera 3D en ubicaciones fraccionadas. Aquí utilizamos una sonda de bola espacial para estimar la longitud total de las fibras colinérgicas en el NBM del cerebro del ratón para ilustrar los procedimientos. El protocolo actual proporciona detalles sobre el procesamiento de tejidos, métodos de muestreo para la estereología, tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo ChAT y estereología imparcial para estimar la longitud de la fibra colinérgica y la densidad de fibra en el NBM del cerebro del ratón.

Protocolo

Todos los procedimientos para el uso de estos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de Asuntos de Veteranos de Kansas City. Para los experimentos se utilizaron ratones de dieciocho meses de edad que sobreexpresaban la proteína precursora betamiloide mutante sueca (APPswe) y sus camaradas C57/BL6 WT. Los detalles de la cría y el genotipado se dan en He et al.⁸.

1. Perfusión y procesamiento de tejidos

1. Anestetizar ratones utilizando una inyección intraperitoneal con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Apriete los dedos para confirmar la falta de respuesta antes de continuar⁹.
2. Perfumar transcardialmente con 50 ml de hielo frío 0,1M de solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) seguido de un 4% de paraformaldehído (PFA) en un tampón de fosfato de 0,1 M (PB)¹⁰.
   ADVERTENCIA: La PFA es tóxica. Utilice equipo de protección personal (EPP) cuando trabaje con PFA.
3. Retirar los cerebros¹⁰ y sumergir en 4% PFA en 0,1 M PB a 4 oC para la postfijación durante 24 h. Lavar con DPBS 3x.
4. Cambie a una solución de sacarosa del 15% en 0,1 DPBS durante la noche y luego al 30% de solución de sacarosa en 0,1 M de DPBS durante otros 48 h a 4 oC.
5. Retire el tejido de la solución de sacarosa y congele en una cámara de criotome preestablecida a una temperatura de -20 oC. Las muestras congeladas se pueden almacenar en tubos sellados a -80 oC hasta su seccionamiento.
6. Incruste los tejidos en un medio de incrustación óptimo de la temperatura de corte (ver Tabla de Materiales)y monte en un disco de muestra. Cortar secciones seriales de 30 m de espesor en un plano coronal usando un criotome y recoger todas las secciones en consecuencia en 24 placas de cultivo de pozo seres llenos de solución crioprotectora (30% glicerol, 30% etilenglicol, 40% DPBS; Figura 1A–C). Conservar en un congelador de -20oC.
   NOTA: Las secciones más gruesas (p. ej., 50 m) son preferibles cuando es posible. Asegúrese de que las secciones se mantienen en orden de corte y todas las secciones están completamente en crioprotector. Una placa de 96 pocillos se puede utilizar como alternativa a 24 placas de pozos para recoger secciones.
7. Cubra los pozos con sellador de placas para evitar la evaporación y el secado. Conservar las placas a -20oC hasta su uso posterior. Las secciones almacenadas a -20 oC son estables durante varios meses para la inmunohistoquímica ChAT.

2. Selección sistemática de secciones para IHC

NOTA: Se debe realizar un estudio piloto para conocer el número total de secciones necesarias para lograr un coeficiente de error aceptable (CE). El valor CE es una expresión de la cantidad total de error en el procedimiento de muestreo. El valor más bajo representa el error mínimo y un valor CE inferior a 0,1 se considera aceptable por el software utilizado aquí (véase la Tabla de materiales)¹¹.

1. Identifique la primera y la última seccione de cada cerebro comparando características morfológicas con un atlas cerebral de ratón estándar como Franklin y Paxinos. NBM comienza en bregma -0.0mm y termina en -1.6 mm. Por lo tanto, alrededor de 50 secciones contienen NBM. El número total de secciones es uno de los parámetros necesarios durante la estereología. La selección de cada sección^8a (SSF 1/8) dio un total de 6-7 secciones para el análisis y dio un CE aceptable tanto para la estimación del volumen como para la estimación de la longitud de la fibra en nuestro estudio piloto.
2. Comience aleatoriamente con una de las primeras ocho secciones y luego muestree sistémicamente cada^8a sección hasta la última sección posterior que contenga NBM(Figura 1C).

3. Inmunohistoquímica

1. Transfiera las secciones crioconservadas a temperatura ambiente en crioprotector y luego tampón de fosfato de 0,1M (PB) en 6 placas de pozo.
2. Lavar 3x en PB.
3. Incubar en 0,3% H₂O₂ en metanol durante 15 min.
4. Lave 3 veces en solución salina con búfer de Tris (TBS).
5. Incubar en 0,25% De Tritón X-100 en TBS durante 30 min.
6. Bloquear con suero bovino 10% normal (NBS) en 0,1% Triton X-100 en TBS durante 30 min.
7. Incubar con una dilución de 1:1.000 de anticuerpos primarios ChAT antihumanos de cabra (ver Tabla de Materiales)en TBS con 0,1% de Tritón X-100 y 1% de NBS durante 48 h a 4oC.
8. Lavar 3 veces en TBS a temperatura ambiente. Realice toda la incubación y lavado a temperatura ambiente.
9. Incubar con anticuerpo secundario anticabra bovino biotintilado (ver Tabla de Materiales)durante 1 h.
10. Lavar 3 veces en TBS.
11. Incubar con el complejo de avidina-biotina-peroxidasa (ver Tabla de Materiales).
12. Lavar 3 veces en TBS.
13. Desarrollar utilizando una solución mejorada de sustrato de peroxidasa DAB (ver Tabla de Materiales)de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
    ADVERTENCIA: DAB es un presunto carcinógeno. Es tóxico por contacto e inhalación. Utilice EPP cuando trabaje con DAB.
14. Lave la sección un par de veces con agua destilada y guárdela en Tris pH a 7,6.
15. Monte las secciones en los portaobjetos gelatinizados. Todas las secciones de un tejido se pueden poner en la misma diapositiva. Seque al aire las secciones, deshidrate 2veces durante 5 min cada una con 70%, 90%, 95% y 100% etanol, y luego limpia las secciones con dos lavados de 10 min de xileno. Cubra las secciones utilizando un medio de montaje (consulte Tabla de materiales).
    NOTA: El tiempo de procesamiento de la deshidratación y la limpieza afecta al grosor de las secciones. Por lo tanto, se deben utilizar las mismas condiciones para todas las secciones. En el estudio actual, el valor medio para el espesor final fue de 21,11 a 0,45 m.
16. Mantenga las secciones en la campana de humos para secar. Las secciones secas están listas para la estereología.

4. Estereología

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para el microscopio y el software utilizado. Un objetivo de inmersión con una apertura numérica (NA) > 1.2 será útil y se debe utilizar si es necesario. Las diapositivas deben agruparse según el genotipo o el grupo de tratamiento y codificarse. La estereología completa de un estudio debe ser realizada por la misma persona y la persona que realiza la estereología debe ser ciega a la identidad de las diapositivas individuales o grupo examinado^1,12,13.

1. Abra un nuevo estudio en el software. (Archivo > Nuevo estudio). Se abrirá el cuadro de diálogo'Inicialización de estudio'. Rellene la información del estudio, utilizando Multi-level (Fraction Based)(Figura 2A).
2. Haga doble clic en 'Volumen' en Parámetros, que abrirá el cuadro de diálogo Volumen. Asigne un nombre a la característica de interés y seleccione la sonda 'Region Point Counting'. Haga clic en Siguiente.
3. Haga doble clic en el siguiente parámetro, 'Length'.
   1. Proporcione un nombre de la característica (por ejemplo,'L') Seleccione 'Esfera' sondeo y haga clic en Siguiente.
4. A continuación, haga clic en el cuadro de diálogo'Inicialización de estudio', que abrirá el cuadro 'Inicializaciónde caso '. Rellene la información del caso. Los grupos deben codificarse antes de iniciar el estudio. El número total de secciones es el número de secciones que comienzan desde la primera sección que contiene el área de interés hasta la última sección que contiene el área de interés (véase el paso 2.1). El intervalo de muestreo de sección es ocho, porque cada^sección 8 se seleccionó para la tinción IHC.
5. Al hacer clic en Siguiente, se abre el cuadro de diálogo 'Inicializaciónde sondeo ', que establecerá automáticamente la ampliación más baja para la selección de región y la estimación de volumen. Confirme la configuración y compruebe si la región de interés se puede identificar en la ampliación inferior seleccionada. Haga doble clic en'Volumen' y rellene 50.000 m³ por punto para la fracción de volumen de la región. Haga clic en Listo.
6. En Aumento de objeto (alto),establezca Longitud en 63x o 100x. Haga doble clic en 'Longitud' para abrir el cuadro de diálogo Longitud-Esfera y establezca el diámetro de la esfera en 10 m. Haga clic en Listo.
   NOTA: La zona de protección debe determinarse en función del grosor real de las secciones. El operador debe comprobar el grosor de las secciones en varios sitios para evitar cualquier daño. Si es necesario, ajuste el espesor de la zona de protección en función del espesor de la sección.
7. Establezca los valores adecuados para el área del marco, la altura del marco, la zona de protección y el espaciado del marco.
   NOTA: Estos valores dependen de la heterogeneidad de los perfiles de objeto (fibras) en la región de estudio. Un área de la trama de 400 m², la altura del marco de 10 m, la zona de protección de 2 m y el espaciado del marco de 300 m proporciona valores CE aceptables para la estimación de la longitud de la fibra en NBM. Se debe realizar un estudio piloto con estos valores antes de dirigirse al siguiente caso.
8. Siga las instrucciones proporcionadas por el software después de cada paso. Las instrucciones aparecen como un cuadro de diálogo y/o en la parte inferior de la pantalla.
9. Insertar Sección 1.
10. Con bajo aumento (5x), defina la región de interés haciendo un límite arbitrario alrededor del NBM. Haga clic en el botón Siguiente en la esquina izquierda de la ventana de vídeo. Siga las instrucciones y confirme que todos los puntos verdes están en el NBM. Los puntos se pueden incluir o excluir haciendo clic en los puntos.
    NOTA: No hay un límite definido y establecido alrededor del NBM. La selección está definida principalmente por el investigador. Las neuronas colinérgicas ChAT+ del NBM se pueden observar en la cápsula interna (ic) y globus pallidus (GP). En este protocolo, el ic con las neuronas colinérgicas ChAT+ y sus proyecciones (fibras) y GP entero se incluye en el NBM(Figura 1D).
11. Siga las instrucciones y cambie a 63x para mediciones de fibra en la fracción actual. Aparece el cuadro de diálogo 'Grosor de sección' en la pantalla. Establezca la superficie superior e inferior de la sección para medir el grosor real de la sección. Se debe utilizar el movimiento manual del eje Z. Haga clic en Hecho.
    NOTA: Si no hay fibra en el área, el paso se puede omitir para ir a la siguiente ubicación de fracción.
12. Mueva el eje Z lentamente de arriba a abajo en la altura del marco de la sección y marque todas las fibras que se intersecan en la superficie de la sonda de esfera virtual(Figura 3). Cuando haya terminado, haga clic en Siguiente para ir a la siguiente ubicación.
13. Después de completar todas las fracciones, el software le pedirá que inserte la siguiente sección. Repita los pasos 4.9–4.12 para las seis o siete secciones del tejido.
    1. Al final, el software generará un resultado para el caso que muestra los valores CE(Figura 4). Si el CE es aceptable, proceda al siguiente caso. Archivo > Nuevo caso. Si el CE no es aceptable(figura 4A),el software proporciona recomendaciones para cambiar algunos de los parámetros. En muchos casos, la disminución del espaciado de trama disminuye los valores CE a un rango aceptable(Figura 4B).
14. Después de completar todos los casos, genere resultados para cada caso y grupo (Archivo > Resultados).

5. Análisis y estadísticas

1. El software proporciona datos para cada muestra y cada grupo. El propio software calcula fracciones como SSF, ASF y TSF, y proporciona el volumen de referencia total (V_REF) y la longitud total (L) de las fibras en la región de referencia (en este caso, NBM)(Figura 4B). Exporte los datos y guarde o copie en el software estadístico de elección para el análisis de grupo. La Tabla 1 muestra los datos de resultados típicos para el análisis estadístico. Analice la densidad de fibra (Lv) dividiendo la longitud total de la fibra con el volumen de referencia.

Resultados

Los resultados representativos se muestran en la Tabla 1 y la Figura 5. El grupo C, que fue decodificado como grupo APPswe (APP), tenía una longitud de fibra significativamente menor(Figura 5B)y densidad de longitud de fibra(Figura 5C)en comparación con sus "littermates" de tipo salvaje (WILD). Los resultados mostraron que no hubo ninguna diferencia significativa en el volumen del...

Discusión

Aquí demostramos un método para estimar la densidad de fibras colinérgicas en el NBM utilizando una sonda de bola espacial (esfera). Esta sonda estima la longitud total de la fibra en la región de interés. La longitud total se puede dividir por el volumen de la región para obtener la densidad de fibra. Para estimar el volumen de la región, se utilizó el método de recuento de puntos Cavalieri. El método de recuento de puntos Cavalieri es un estimador imparcial y eficiente de un volumen de referencia 3D para cual...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABC kit	Vector Laboratories	PK6100
Anti-ChAT Antibody	Millipore, MA, USA	AB144P
Bovine anti-goat IgG-B	Santacruz Biotechnology	SC-2347
Bovine Serum, Adult	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B9433
Cryostat	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G2025
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1009
Immpact-DAB kit	Vector Laboratories	SK4105	Enhanced DAB peroxidase substrate solution
Ketamine	Westward Pharmaceuticals, NJ, USA	0143-9509-01
Microscope	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA	AF6000	Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	62550-12
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P6148
Permount mounting medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
Stereologer Software	Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA	Stereologer2000	Installed on a Dell Desktop computer.
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	Tris base
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T5941	Tris hydrochloride
Xylazine	Bayer, Leverkusen, Germany	Rompun
Xylenes, Histological grade	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056