Stima stereologica della lunghezza della fibra colinergica nel Nucleus Basalis di Meynert del cervello del topo

Riepilogo

Lunghezza della fibra neuronale all'interno di una struttura tridimensionale di una regione del cervello è un parametro affidabile per quantificare specifica integrità strutturale neuronale o degenerazione. Questo articolo descrive in dettaglio un metodo di quantificazione stereologica per misurare la lunghezza della fibra colinergica all'interno del nucleo basalis di Meynert nei topi come esempio.

Abstract

La lunghezza degli assoni colinergici o di altri neuronali in varie regioni del cervello è spesso correlata con la funzione specifica della regione. La stereologia è un metodo utile per quantificare i profili neuronali di varie strutture cerebrali. Qui forniamo un protocollo di stereologia basato su software per stimare la lunghezza totale delle fibre colinergiche nel nucleo basalis di Meynert (NBM) del prosencefalo basale. Il metodo utilizza una sonda a sfera spaziale per le stime di lunghezza. Le fibre collinergiche sono visualizzate da colina acetiltransferasi (ChAT) immunostaining con il rafano peroxidase-diaminobenzidina (HRP-DAB) sistema di rilevamento. Il protocollo di colorazione è valido anche per la stima della fibra e del numero di cellule in varie regioni del cervello utilizzando software di stereologia. Il protocollo di stereologia può essere utilizzato per la stima di eventuali profili lineari come fibre coccolincettive, fibre dopaminergiche/catecholaminergiche, fibre sitonergiche, processi astrociti, o anche profili vascolari.

Introduzione

Le stime quantitative della lunghezza e/o della densità delle fibre nervose nel cervello sono parametri importanti degli studi neuropatologici. La lunghezza degli assoni colinergici, dopaminergici e sierotonergici in varie regioni del cervello sono spesso correlati con le funzioni specifiche della regione. Poiché la distribuzione di questi assoni è generalmente eterogenea, la stereologia basata sulla progettazione viene utilizzata per evitare distorsioni durante il campionamento. La sonda spaziale di stereologia è stata progettata per fornire misure efficienti e affidabili di strutture simili a linee come le fibre neuronali in una regione di interesse¹. La sonda crea una sfera virtuale che viene imposta sistematicamente nel tessuto per misurare le intersezioni della linea con la superficie della sonda. Poiché è impossibile inserire sonde di sfera nel tessuto per l'analisi, il software disponibile in commercio fornisce una sfera tridimensionale virtuale (3D), che è fondamentalmente una serie di cerchi concentrici di vari diametri che rappresentano la superficie della sonda di sfera.

La neurodegenerazione colinergica selettiva è una delle caratteristiche coerenti del morbo di Alzheimer (AD)^2,3,4. Trasmissione colinergica disfunzionale è considerato un fattore causale per il declino cognitivo in AD. Disfunzione colinergica è evidente anche in molti altri disturbi mentali come il morbo di Parkinson, dipendenza, e schizofrenia. Diversi aspetti della neurodegenerazione colinergica sono studiati in modelli animali (ad esempio, riduzione dell'acetilcolina⁵, proteina ChAT⁶, neurodegenerazione della fibra colinergica in prossimità di placche amiloidi⁶, e diminuzione delle fibre colinergiche e varicosità sinaptiche^7,8). Degenerazione di fibra è creduto per avvenire prima della perdita neuronale, perché la perdita neuronale colinergica non è sempre osservata negli studi. La maggior parte dei neuroni colinergici sono nel prosencefalo basale e il tronco encefalico, e loro assoni proiettano in varie regioni del cervello come le cortici e l'ippocampo. NBM è situato nel prosencefalo basale e si trova ad essere una delle aree del cervello comunemente colpite in AD.

Il metodo frazionario della stereologia si basa sul campionamento casuale sistematico di un tessuto a più livelli. La frazione di campionamento di sezione (SSF) è il campionamento sistematico non basato su computer delle sezioni per il metodo frazionario della stereologia. La frazione di campionamento dell'area (ASF) è la frazione di un'area dell'area di interesse nella sezione. La frazione di campionamento dello spessore (TSF) è la frazione dello spessore di una sezione. La sonda spaziale a sfera ci permette di quantificare i profili di interesse in una sfera 3D in posizioni frazionate. Qui usiamo una sonda a sfera spaziale per stimare la lunghezza totale delle fibre colinergiche nella NBM del cervello del topo per illustrare le procedure. Il protocollo attuale fornisce dettagli sull'elaborazione dei tessuti, sui metodi di campionamento per la stereologia, sulla colorazione immunoistochimica che utilizza l'anticorpo ChAT e sulla stereologia imparziale per stimare la lunghezza della fibra colinergica e la densità delle fibre nella NBM del cervello del topo.

Protocollo

Tutte le procedure per l'utilizzo di questi animali sono state approvate dal Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi di 18 mesi che sovraesprimono la proteina precursore del beta-amiloide mutante svedese (APPPawe) e i loro compagni di cucciolata C57/BL6 WT. I dettagli dell'allevamento e della genotipizzazione sono forniti in Egli et al.⁸.

1. Perfusione e lavorazione dei tessuti

1. Anestesia topi con iniezione intraperitoneale con ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Avvicinare le dita dei dati per confermare la mancanza di risposta prima di continuare⁹.
2. Transcardialmente perfusio con 50 mL di ghiaccio freddo 0,1M di fosfato tamponato salina (DPBS) seguito dal 4% di paraformaldeide (PFA) in buffer di fosfato da 0,1 M (PB)¹⁰.
   AVVISO: il PFA è tossico. Utilizzare dispositivi di protezione personale (PPE) quando si lavora con PFA.
3. Rimuovere i cervelli¹⁰ e immergersi nel 4% PFA in 0,1 M PB a 4 gradi centigradi per la post-fissazione per 24 h. Lavare con DPBS 3x.
4. Passare alla soluzione di saccarosio del 15% in 0,1 DPBS durante la notte e quindi al 30% di saccarosio in 0,1 M DPBS per un altro 48 h a 4 gradi centigradi.
5. Togliere il tessuto dalla soluzione di saccarosio e congelare in una camera criotoma preimpostata ad una temperatura di -20 gradi centigradi. I campioni congelati possono essere conservati in tubi sigillati a -80 gradi centigradi fino alla sezionamento.
6. Incorporare i tessuti nel mezzo di incorporamento ottimale della temperatura di taglio (vedere Tabella dei materiali)e montare su un disco campione. Tagliare le sezioni seriali spesse 30 m in un piano coronale utilizzando un criotome e raccogliere di conseguenza tutte le sezioni in 24 piastre di coltura ben piene di soluzione crioprotectant (30% glicerolo, 30% glicole di etilene, 40% DPBS; Figura 1A–C). Conservare in un congelatore da -20 gradi centigradi.
   NOTA: quando possibile sono preferibili le sezioni più spesse (ad es., 50 m). Assicurarsi che le sezioni siano mantenute in ordine di taglio e che tutte le sezioni siano completamente in crioprotectant. Una piastra da 96 pozzetto può essere utilizzata in alternativa a 24 piatti ben per raccogliere le sezioni.
7. Coprire i pozzetti con il sigillante a piastre per evitare l'evaporazione e l'essiccazione. Conservare le piastre a -20 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo. Le sezioni immagazzinate a -20 gradi centigradi sono stabili per diversi mesi per l'immunohistochimica ChAT.

2. Selezione sistematica delle sezioni per IHC

NOTA: è necessario uno studio pilota per conoscere il numero totale di sezioni necessarie per ottenere un coefficiente accettabile di errore (CE). Il valore CE è un'espressione della quantità totale di errore nella procedura di campionamento. Il valore minimo rappresenta l'errore minimo e un valore CE inferiore a 0,1 è considerato accettabile dal software utilizzato qui (vedere Tabella dei materiali)¹¹.

1. Identificare la prima e l'ultima sezione per ogni cervello confrontando le caratteristiche morfologiche con un atlante cerebrale del topo standard come Franklin e Paxinos. NBM inizia a bregma -0,0 mm e termina a -1,6 mm. Pertanto, circa 50 sezioni contengono NBM. Il numero totale di sezioni è uno dei parametri richiesti durante la stereologia. La selezione di ogni sezione^8th (SSF - 1/8) ha dato un totale di 6-7 sezioni per l'analisi e ha prodotto una CE accettabile sia per la stima del volume che per la stima della lunghezza della fibra nel nostro studio pilota.
2. Iniziare in modo casuale con una delle prime otto sezioni e quindi campionare sistemicamente ogni 8^a sezione fino all'ultima sezione posteriore contenente NBM (Figura 1C).

3. Immunoistochimica

1. Trasferire le sezioni crioconservate a temperatura ambiente in crioprotectant e poi 0.1M fosfato buffer (PB) in 6 piastre di pozzo.
2. Lavare 3x in PB.
3. Incubare in 0.3% H₂O₂ in metanolo per 15 min.
4. Lavare 3x in salina (TBS) con buffer Res.
5. Incubare in 0.25% Triton X-100 in TBS per 30 min.
6. Blocco con 10% siero bovino normale (NBS) in 0.1% Triton X-100 in TBS per 30 min.
7. Incubare con una diluizione di 1:1,000 di luedini anticorpi primari anti-umani di capra (vedi Tabella dei Materiali)in TBS con 0,1% Triton X-100 e 1% NBS per 48 h a 4 gradi centigradi.
8. Lavare 3x in TBS a temperatura ambiente. Eseguire ogni ulteriore incubazione e lavaggio a temperatura ambiente.
9. Incubato con anticorpo secondario bovino biotinylato anti-capra (vedi Tabella dei materiali)per 1 h.
10. Lavare 3volte in TBS.
11. Incubare con il complesso avidino-biotina-perossidasi (vedi Tabella dei materiali).
12. Lavare 3volte in TBS.
13. Sviluppare utilizzando una soluzione avanzata di substrato DAB perossidasi (vedere Tabella dei materiali)in base alle raccomandazioni del produttore.
    AVVISO: DAB è un sospetto cancerogeno. È tossico per contatto e inalazione. Utilizzare PPE quando si lavora con DAB.
14. Lavare la sezione un paio di volte con acqua distillata e tenere in Tris pH 7.6.
15. Montare le sezioni sui vetrini gelatinizzati. Tutte le sezioni di un tessuto possono essere inserite nella stessa diapositiva. Asciugare l'aria delle sezioni, disidratare 2x per 5 min ciascuna con 70%, 90%, 95% e 100% etanolo, quindi cancellare le sezioni con due orme 10 min di xilene. Coprire le sezioni utilizzando il supporto di montaggio (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: il tempo di elaborazione della disidratazione e della compensazione influisce sullo spessore delle sezioni. Pertanto, le stesse condizioni devono essere utilizzate per tutte le sezioni. Nello studio attuale, il valore medio per lo spessore finale era di 21,11 x 0,45 m.
16. Mantenere le sezioni nella cappa fumi ad asciugare. Le sezioni asciutte sono pronte per la stereologia.

4. Stereologia

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per il microscopio e il software utilizzato. Un obiettivo di immersione con un'apertura numerica (NA) > 1.2 sarà utile e deve essere utilizzato se necessario. I vetrini devono essere raggruppati in base al genotipo o al gruppo di trattamento e codificati. La stereologia completa per uno studio deve essere eseguita dalla stessa persona e la persona che esegue la sterologia deve essere cieca all'identità delle singole diapositive o gruppo esaminato^1,12,13.

1. Aprire un nuovo studio nel software. (File > Nuovo studio). Si aprirà la finestra di dialogo 'Inizializzazione studio'. Compilare le informazioni dello studio, utilizzando Multi-level (Fraction Based) (Figura 2A).
2. Fare doppio clic su 'Volume' in Parametri, che aprirà la finestra di dialogo Volume. Assegnare un nome alla caratteristica di interesse e selezionare la sonda 'Conteggio punti regione'. Fare clic su Avanti.
3. Fare doppio clic sul parametro successivo, 'Lunghezza'.
   1. Specificare un nome della funzionalità (adesempio, 'L') Selezionare 'Sfera' probe e fare clic su Avanti.
4. Successivamente, fare clic sulla finestra di dialogo 'Inizializzazione studio', che aprirà la casella 'Inizializzazione caso'. Inserire le informazioni sul caso. I gruppi devono essere codificati prima di iniziare lo studio. Il numero totale di sezioni è il numero di sezioni a partire dalla prima sezione contenente l'area di interesse fino all'ultima sezione contenente l'area di interesse (vedere il punto 2.1). L'intervallo di campionamento della sezione è otto, perché ogni 8^a sezione è stata selezionata per la colorazione IHC.
5. Facendo clic su Avanti si apre la finestra di dialogo 'Inizializzazione sonda', che imposterà automaticamente l'ingrandimento più basso per la selezione dell'area e la stima del volume. Confermare le impostazioni e verificare se l'area di interesse può essere identificata con l'ingrandimento inferiore selezionato. Fare doppio clic su'Volume' e riempire 50.000 m³ per punto per la frazione di volume regione. Fare clic su Fine.
6. In Ingrandimento oggetto (alto), impostare Lunghezza su 63x o 100x. Fare doppio clic su 'Lunghezza' per aprire la finestra di dialogo Lunghezza-Sfera e impostare il diametro della sfera su 10 m. Fare clic su Fatto.
   NOTA: La zona di guardia deve essere determinata in base allo spessore effettivo delle sezioni. L'operatore deve verificare lo spessore delle sezioni in più siti per evitare danni. Se necessario, regolare lo spessore della zona di protezione in base allo spessore della sezione.
7. Impostare i valori appropriati per l'area della cornice, l'altezza della cornice, la zona di protezione e la spaziatura della cornice.
   NOTA: Questi valori dipendono dall'eterogeneità dei profili oggetto (fibre) nella regione di studio. Un'area del telaio di 400 m², l'altezza del telaio di 10 m, la zona di guardia di 2 m e la spaziatura del telaio di 300 m forniscono valori CE accettabili per la stima della lunghezza della fibra in NBM. Uno studio pilota deve essere eseguito con questi valori prima di passare al caso successivo.
8. Seguire le istruzioni fornite dal software dopo ogni passaggio. Le istruzioni vengono visualizzate come finestra di dialogo e/o nella parte inferiore dello schermo.
9. Inserire la sezione 1.
10. A basso ingrandimento (5x), definire l'area di interesse facendo un confine arbitrario intorno al NBM. Fare clic sul pulsante Avanti nell'angolo sinistro della finestra video. Seguire le istruzioni e confermare che tutti i punti verdi sono in NBM. I punti possono essere inclusi o esclusi facendo clic sui punti.
    NOTA: Non esiste un limite definito intorno al NBM. La selezione è per lo più definita da investigatori. Nella capsula interna (ic) e nel globus pallidus (GP) si possono osservare i neuroni colinergici ChAT. In questo protocollo, l'ic con i neuroni colinergici ChAT e le loro proiezioni (fibre) e l'intero GP è incluso nella NBM (Figura 1D).
11. Seguire le istruzioni e passare a 63x per le misurazioni della fibra alla frazione corrente. Sullo schermo viene visualizzata la finestra di dialogo 'Spessore sezione'. Impostare la superficie superiore e inferiore della sezione per misurare lo spessore effettivo della sezione. Si deve usare il movimento manuale dell'asse z. Fare clic su Fatto.
    NOTA: Se non c'è fibra nell'area, il passaggio può essere saltato per passare alla posizione della frazione successiva.
12. Spostare lentamente l'asse sbarrato dall'alto verso il basso nell'altezza del telaio della sezione e contrassegnare tutte le fibre intersecanti sulla superficie della sonda della sfera virtuale (Figura 3). Al termine, fare clic su Avanti per passare alla posizione successiva.
13. Dopo aver completato tutte le frazioni, il software chiederà di inserire la sezione successiva. Ripetere i passaggi da 4,9 a 4,12 per tutte e sei o sette sezioni del tessuto.
    1. Alla fine, il software genererà un risultato per il caso che mostra i valori CE (Figura 4). Se la CE è accettabile, passare al caso successivo. File > Nuovo caso. Se la CE non è accettabile (Figura 4A), il software fornisce consigli per modificare alcuni parametri. In molti casi, la riduzione della spaziatura dei frame riduce i valori CE a un intervallo accettabile (Figura 4B).
14. Dopo aver completato tutti i casi, generare i risultati per ogni caso e gruppo (File > Risultati).

5. Analisi e statistiche

1. Il software fornisce i dati per ogni campione e ogni gruppo. Il software stesso calcola frazioni come SSF, ASF e TSF e fornisce il volume di riferimento totale (V_REF) e la lunghezza totale (L) delle fibre nella regione di riferimento (in questo caso, NBM) (Figura 4B). Esportare i dati e salvare o copiare nel software statistico di scelta per tra l'analisi di gruppo. La tabella 1 mostra i dati dei risultati tipici per l'analisi statistica. Analizzare la densità della fibra (Lv) dividendo la lunghezza totale della fibra con il volume di riferimento.

Risultati

I risultati rappresentativi sono riportati nella tabella 1 e nella figura 5. Il gruppo C, che è stato decodificato come gruppo APPswe (APP), aveva una lunghezza della fibra significativamente inferiore (Figura 5B) e densità di lunghezza della fibra (Figura 5C) rispetto ai loro compagni di cucciolata di tipo selvaggio (WILD). I risultati hanno mostrato che non vi era alcuna differe...

Discussione

Qui dimostriamo un metodo per stimare la densità delle fibre colinergiche nel NBM utilizzando una sonda palla spaziale (sfera). Questa sonda stima la lunghezza totale della fibra nella regione di interesse. La lunghezza totale può essere divisa per il volume della regione per ottenere la densità della fibra. Per stimare il volume della regione, è stato utilizzato il metodo di conteggio punti Cavalieri. Il metodo di conteggio punti Cavalieri è uno stimatore imparziale ed efficiente di un volume di riferimento 3D per ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABC kit	Vector Laboratories	PK6100
Anti-ChAT Antibody	Millipore, MA, USA	AB144P
Bovine anti-goat IgG-B	Santacruz Biotechnology	SC-2347
Bovine Serum, Adult	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B9433
Cryostat	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G2025
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1009
Immpact-DAB kit	Vector Laboratories	SK4105	Enhanced DAB peroxidase substrate solution
Ketamine	Westward Pharmaceuticals, NJ, USA	0143-9509-01
Microscope	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA	AF6000	Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	62550-12
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P6148
Permount mounting medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
Stereologer Software	Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA	Stereologer2000	Installed on a Dell Desktop computer.
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	Tris base
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T5941	Tris hydrochloride
Xylazine	Bayer, Leverkusen, Germany	Rompun
Xylenes, Histological grade	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056