Stereologische Abschätzung der cholinergen Faserlänge im Nukleus Basalis von Meynert des Maushirns

Zusammenfassung

Die neuronale Faserlänge innerhalb einer dreidimensionalen Struktur einer Hirnregion ist ein zuverlässiger Parameter, um spezifische neuronale strukturelle Integrität oder Degeneration zu quantifizieren. Dieser Artikel beschreibt eine stereologische Quantifizierungsmethode zur Messung der cholinergen Faserlänge innerhalb des Kernbasalis von Meynert bei Mäusen als Beispiel.

Zusammenfassung

Die Länge von cholinergen oder anderen neuronalen Axonen in verschiedenen Hirnregionen korreliert oft mit der spezifischen Funktion der Region. Die Stereologie ist eine nützliche Methode, um neuronale Profile verschiedener Gehirnstrukturen zu quantifizieren. Hier stellen wir ein softwarebasiertes Stereologie-Protokoll zur Schätzung der Gesamtlänge cholinerger Fasern im Kern basalis von Meynert (NBM) des Basalvorhirns zur Verfügung. Die Methode verwendet eine Raumkugelsonde für Längenschätzungen. Die cholinerge Fasern werden durch Cholin-Acetyltransferase (ChAT) Immunfärbung mit dem Meerrettich peroxidase-Diaminobenzidin (HRP-DAB) Detektionssystem visualisiert. Das Färbeprotokoll gilt auch für die Faser- und Zellzahlenschätzung in verschiedenen Hirnregionen mit Stereologie-Software. Das stereologische Protokoll kann zur Abschätzung von linearen Profilen wie chollinoceptiven Fasern, dopaminergen/katecholaminergen Fasern, serotonergen Fasern, Astrozytenprozessen oder sogar Gefäßprofilen verwendet werden.

Einleitung

Quantitative Schätzungen der Länge und/oder Dichte von Nervenfasern im Gehirn sind wichtige Parameter neuropathologischer Studien. Die Länge der cholinergen, dopaminergen und serotonergen Axone in verschiedenen Hirnregionen sind oft mit den spezifischen Funktionen der Region korreliert. Da die Verteilung dieser Axone im Allgemeinen heterogen ist, wird die designbasierte Stereologie verwendet, um Verzerrungen während der Probenahme zu vermeiden. Die Raumkugelsonde der Stereologie wurde entwickelt, um effiziente und zuverlässige Messungen von linienähnlichen Strukturen wie neuronalen Fasern in einer Region von Interesse zu bieten¹. Die Sonde bildet eine virtuelle Kugel, die systematisch im Gewebe aufgezwungen wird, um Linienschnitte mit der Oberfläche der Sonde zu messen. Da es unmöglich ist, Kugelsonden zur Analyse in das Gewebe zu legen, bietet die kommerziell erhältliche Software eine virtuelle dreidimensionale (3D) Kugel, die im Grunde eine Reihe konzentrischer Kreise mit verschiedenen Durchmessern ist, die die Oberfläche der Kugelsonde darstellen.

Selektive cholinerge Neurodegeneration ist eines der konsistenten Merkmale der Alzheimer-Krankheit (AD)^2,3,4. Dysfunktionale cholinerge Übertragung gilt als ein ursächlichen Faktor für kognitive Nk. Cholinerge Dysfunktion ist auch bei vielen anderen psychischen Störungen wie Parkinson, Sucht, und Schizophrenie offensichtlich. Verschiedene Aspekte der cholinergen Neurodegeneration werden in Tiermodellen untersucht (z.B. Reduktion in Acetylcholin⁵, ChAT-Protein⁶, cholinerge Faser-Neurodegeneration in der Nähe von Amyloid-Plaques⁶, und Abnahme der cholinergen Fasern und synaptischen Varikosen^7,8). Es wird angenommen, dass die Faserdegeneration früher als der neuronale Verlust stattfindet, da cholinerge neuronaler Verlust nicht immer in Studien beobachtet wird. Die meisten cholinergen Neuronen befinden sich im Basalvorhirn und im Hirnstamm, und ihre Axone projizieren auf verschiedene Hirnregionen wie die Kortizes und den Hippocampus. NBM befindet sich im Basalvorhirn und ist einer der am häufigsten betroffenen Hirnbereiche in AD.

Die Fraktionatormethode der Stereologie basiert auf einer systematischen Stichprobenerhebung eines Gewebes auf mehreren Ebenen. Section Sampling Fraction (SSF) ist die nicht computergestützte systematische Probenahme von Abschnitten für die Fraktionatormethode der Stereologie. Flächenstichprobenfraktion (ASF) ist die Fraktionierung eines Bereichs der Interessenregion in diesem Abschnitt. Die Dickeentnahmefraktion (TSF) ist die Fraktionierung der Dicke eines Abschnitts. Die Raumkugelsonde ermöglicht es uns, Profile von Interesse in einer 3D-Kugel an fraktionierten Stellen zu quantifizieren. Hier verwenden wir eine Raumkugelsonde zur Schätzung der Gesamtlänge cholinerger Fasern im NBM des Maushirns, um die Abläufe zu veranschaulichen. Das aktuelle Protokoll enthält Details zur Gewebeverarbeitung, Probenahmemethoden für die Stereologie, immunhistochemische Färbung mit dem ChAT-Antikörper und unvoreingenommene Stereologie zur Schätzung der cholinergen Faserlänge und Faserdichte im NBM des Maushirns.

Protokoll

Alle Verfahren zur Verwendung dieser Tiere wurden vom Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Für die Experimente wurden 18 Monate alte Mäuse verwendet, die das schwedische Mutamyloid-Vorläuferprotein (APPswe) und ihre C57/BL6-WT-Wurfmate überexpressionierten. Einzelheiten zur Zucht und Genotypisierung finden Sie in He et al.⁸.

1. Perfusion und Gewebeverarbeitung

1. Anästhesisieren Sie Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Pinch Zehen, um einen Mangel an Antwort zu bestätigen, bevor Sie⁹fortsetzen.
2. Transkardinal perfuse mit 50 ml eiskalt0,1M DulbeccoPhosphat gepufferte Saline (DPBS) gefolgt von 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1M Phosphatpuffer (PB)¹⁰.
   VORSICHT: PFA ist giftig. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA) bei der Arbeit mit PFA.
3. Gehirne¹⁰ entfernen und in 4% PFA in 0,1 M PB bei 4 °C für die Postfixierung für 24 h eintauchen. Mit DPBS 3x waschen.
4. Wechseln Sie zu 15% Saccharoselösung in 0,1 DPBS über Nacht und dann 30% Saccharoselösung in 0,1 M DPBS für weitere 48 h bei 4 °C.
5. Entfernen Sie das Gewebe aus der Saccharoselösung und frieren Sie in einer Kryotomkammer ein, die auf eine Temperatur von -20 °C voreingestellt ist. Gefrorene Proben können bis zum Schnitt in versiegelten Rohren bei -80 °C gelagert werden.
6. Gewebe in optimales Schnitttemperatur-Einbettmedium einbetten (siehe Materialtabelle)einbetten und auf einer Probenscheibe montieren. Schneiden Sie die 30 m dicken Abschnitte in einer koronalen Ebene mit einem Kryotom und sammeln Sie alle Abschnitte folglich in 24 Brunnenkulturplatten, die mit Kryoprotektorlösung gefüllt sind (30% Glycerin, 30% Ethylenglykol, 40% DPBS; Abbildung 1A–C). In einem Gefrierschrank von -20 °C aufbewahren.
   HINWEIS: Dickere Abschnitte (z. B. 50 m) sind vorzuziehen, wenn dies möglich ist. Stellen Sie sicher, dass die Abschnitte in Schnittreihenfolge gehalten werden und alle Abschnitte vollständig kryoprotektoris sind. Eine 96-Wellplatte kann als Alternative zu 24 Brunnenplatten verwendet werden, um Abschnitte zu sammeln.
7. Bedecken Sie die Brunnen mit Plattenversiegelung, um Verdunstung und Trocknung zu verhindern. Platten bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung lagern. Bei -20 °C gelagerte Abschnitte sind für die ChAT-Immunhistochemie für mehrere Monate stabil.

2. Systematische Schnittauswahl für IHC

ANMERKUNG: Es sollte eine Pilotstudie durchgeführt werden, um die Gesamtzahl der Abschnitte zu kennen, die erforderlich sind, um einen akzeptablen Fehlerkoeffizienten (CE) zu erreichen. Der CE-Wert ist ein Ausdruck der Gesamtfehlermenge im Samplingverfahren. Der niedrigste Wert stellt den minimalen Fehler dar, und ein CE-Wert unter 0,1 wird von der hier verwendeten Software als akzeptabel angesehen (siehe Tabelle der Materialien)¹¹.

1. Identifizieren Sie den ersten und letzten Abschnitt für jedes Gehirn, indem Sie morphologische Merkmale mit einem Standard-Maus-Gehirnatlas wie Franklin und Paxinos vergleichen. NBM beginnt bei Bregma -0,0 mm und endet bei -1,6 mm. Daher enthalten etwa 50 Abschnitte NBM. Die Gesamtzahl der Abschnitte ist einer der Parameter, die während der Stereologie erforderlich sind. Die Auswahl jedes^8. Abschnitts (SSF = 1/8) ergab insgesamt 6–7 Abschnitte für die Analyse und ergab in unserer Pilotstudie ein akzeptables CE sowohl für die Volumenschätzung als auch für die Faserlängenschätzung.
2. Beginnen Sie zufällig mit einem der ersten acht Abschnitte und proben Sie dann jeden^8. Abschnitt systemisch bis zum letzten hinteren Abschnitt, der NBM enthält (Abbildung 1C).

3. Immunhistochemie

1. Übertragen Sie die kryokonservierten Abschnitte auf Raumtemperatur in Kryoprotektor und dann 0,1M Phosphatpuffer (PB) in 6 Brunnenplatten.
2. Waschen Sie 3x in PB.
3. Inkubieren Sie in 0,3%_H2O2 in Methanol für 15 min.
4. Waschen Sie 3x in Tris-gepufferter Salin (TBS).
5. Inkubieren Sie in 0,25% Triton X-100 in TBS für 30 min.
6. Block mit 10% normalem Rinderserum (NBS) in 0,1% Triton X-100 in TBS für 30 min.
7. Inkubieren Sie mit einer Verdünnung von humanen ChAT-Primärantikörpern von Ziegen (siehe Materialtabelle)in TBS mit 0,1% Triton X-100 und 1% NBS für 48 h bei 4 °C.
8. Waschen Sie 3x in TBS bei Raumtemperatur. Führen Sie alle weiteren Inkubation und Waschen bei Raumtemperatur.
9. Inkubieren Sie mit biotinylatierten Rindern Anti-Ziegen-Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) für 1 h.
10. Waschen Sie 3x in TBS.
11. Inkubieren Sie mit dem Komplex avidin-biotin-peroxidase (siehe Materialtabelle).
12. Waschen Sie 3x in TBS.
13. Entwickeln Sie mit einer verbesserten DAB-Peroxidase-Substratlösung (siehe Materialtabelle)gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
    VORSICHT: DAB ist ein vermutetes Karzinogen. Es ist giftig durch Kontakt und Inhalation. Verwenden Sie PSA, wenn Sie mit DAB arbeiten.
14. Waschen Sie den Abschnitt ein paar Mal mit destilliertem Wasser und halten Sie in Tris pH = 7.6.
15. Montieren Sie die Abschnitte auf den gelatinierten Dias. Alle Abschnitte aus einem Gewebe können auf die gleiche Folie gelegt werden. Die Abschnitte trocknen, 2x für je 5 min mit 70%, 90%, 95% und 100% Ethanol trocknen und dann die Abschnitte mit zwei 10 min Xylolwäschen löschen. Abdeckung der Abschnitte mit Montagemedium (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Die Verarbeitungszeit der Austrocknung und Rodung wirkt sich auf die Dicke der Abschnitte aus. Daher sollten die gleichen Bedingungen für alle Abschnitte verwendet werden. In der aktuellen Studie lag der Mittelwert für die Enddicke bei 21,11 bis 0,45 m.
16. Halten Sie die Abschnitte in der Dunstabzugshaube zum Trocknen. Die trockenen Abschnitte sind bereit für die Stereologie.

4. Stereologie

HINWEIS: Siehe Materialtabelle für das verwendete Mikroskop und die verwendete Software. Ein Tauchziel mit einer numerischen Blende (NA) > 1.2 ist nützlich und sollte bei Bedarf verwendet werden. Die Dias sollten nach Genotyp oder Behandlungsgruppe gruppiert und kodiert werden. Die vollständige Stereologie für eine Studie sollte von derselben Person durchgeführt werden, und die Person, die die Stereologie durchführt, sollte blind für die Identität der einzelnen Dias oder der untersuchten Gruppe^1,12,13sein.

1. Öffnen Sie eine neue Studie in der Software. (Datei > Neue Studie). Ein Dialogfeld"Studieninitialisierung"wird geöffnet. Füllen Sie die Studieninformationen mit Multi-Level (Fraction Based) aus (Abbildung 2A).
2. Doppelklicken Sie unter Parameterauf 'Volume', wodurch das Dialogfeld Lautstärke geöffnet wird. Benennen Sie das Voninteresse enthaltene Feature, und wählen Sie den Prüfpunkt RegionPoint Countingaus. Klicken Sie auf Weiter.
3. Doppelklicken Sie auf den nächsten Parameter 'Länge'.
   1. Geben Sie einen Namen des Features an(z. B. 'L') Wählen Sie 'Kugel' Und klicken Sie auf Weiter.
4. Klicken Sie als Nächstes auf das Dialogfeld "Studieninitialisierung",in dem das Feld "Fallinitialisierung"geöffnet wird. Geben Sie die Anfrageinformationen ein. Gruppen müssen vor Beginn der Studie codiert werden. Die Gesamtzahl der Abschnitte ist die Anzahl der Abschnitte, beginnend mit dem ersten Abschnitt, der den Interessenbereich enthält, bis zum letzten Abschnitt, der den Bereich von Interesse enthält (siehe Schritt 2.1). Das Abschnittsabtastintervall beträgt acht, da jeder^8. Abschnitt für die IHC-Färbung ausgewählt wurde.
5. Wenn Sie auf Weiter klicken, wird das Dialogfeld "Probeinitialisierung"geöffnet, in dem automatisch die niedrigste Vergrößerung für die Regionsauswahl und die Volumenschätzung festgelegt wird. Bestätigen Sie die Einstellungen, und überprüfen Sie, ob der Interessenbereich bei der ausgewählten unteren Vergrößerung identifiziert werden kann. Doppelklicken Sie auf'Volumen' und füllen Sie 50.000 m³ pro Punkt für den Regionsvolumenanteil aus. Klicken Sie auf Fertig.
6. Setzen Sie unter Objekt (Hohe) Vergrößerung die Länge auf 63x oder 100x. Doppelklicken Sie auf 'Länge', um das Dialogfeld Länge-Sphäre zu öffnen und den Durchmesser der Kugel auf 10 m festzulegen. Klicken Sie auf Fertig.
   HINWEIS: Die Schutzzone sollte anhand der tatsächlichen Dicke der Abschnitte bestimmt werden. Der Bediener muss die Dicke der Abschnitte an mehreren Standorten überprüfen, um Schäden zu vermeiden. Passen Sie bei Bedarf die Dicke der Schutzzone basierend auf der Schnittdicke an.
7. Legen Sie geeignete Werte für Rahmenbereich, Rahmenhöhe, Schutzzone und Rahmenabstand fest.
   HINWEIS: Diese Werte hängen von der Heterogenität der Objektprofile (Fasern) im Studienbereich ab. Eine Rahmenfläche von 400^'m2, Rahmenhöhe von 10 'm, Schutzzone von 2 'm und Rahmenabstand von 300 'm ergibt akzeptable CE-Werte für die Faserlängenschätzung in NBM. Eine Pilotstudie muss mit diesen Werten durchgeführt werden, bevor Sie zum nächsten Fall gehen.
8. Folgen Sie den Anweisungen der Software nach jedem Schritt. Die Anweisungen werden entweder als Dialogfeld und/oder am unteren Rand des Bildschirms angezeigt.
9. Fügen Sie Abschnitt 1 ein.
10. Definieren Sie bei niedriger Vergrößerung (5x) den Interessenbereich, indem Sie eine willkürliche Grenze um die NBM festlegen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter in der linken Ecke des Videofensters. Folgen Sie den Anweisungen und bestätigen Sie, dass sich alle grünen Punkte im NBM befinden. Die Punkte können durch Anklicken der Punkte eingeschlossen oder ausgeschlossen werden.
    HINWEIS: Es gibt keine definitive, festgelegte Grenze um die NBM. Die Auswahl ist meist vom Ermittler definiert. Die ChAT+ cholinergen Neuronen der NBM können in der inneren Kapsel (ic) und dem Globus pallidus (GP) beobachtet werden. In diesem Protokoll ist das ic mit ChAT+ cholinergen Neuronen und ihren Projektionen (Fasern) und ganzen GP im NBM enthalten (Abbildung 1D).
11. Befolgen Sie die Anweisungen und wechseln Sie zu 63x für Fasermessungen bei der aktuellen Fraktion. Das Dialogfeld 'Schnittdicke' wird auf dem Bildschirm angezeigt. Legen Sie die obere und untere Oberfläche des Abschnitts fest, um die tatsächliche Dicke des Abschnitts zu messen. Die manuelle Z-Achsenbewegung sollte verwendet werden. Klicken Sie auf Fertig.
    HINWEIS: Wenn sich keine Faser im Bereich befindet, kann der Schritt übersprungen werden, um zum nächsten Bruchplatz zu wechseln.
12. Verschieben Sie die Z-Achse langsam von oben nach unten in der Rahmenhöhe des Schnitts, und markieren Sie alle sich schneidenden Fasern auf der Oberfläche der virtuellen Kugelsonde (Abbildung 3). Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Weiter, um zum nächsten Speicherort zu wechseln.
13. Nach Abschluss aller Brüche wird die Software aufgefordert, den nächsten Abschnitt einzufügen. Wiederholen Sie die Schritte 4.9–4.12 für alle sechs oder sieben Abschnitte des Gewebes.
    1. Am Ende generiert die Software ein Ergebnis für den Fall, der die CE-Werte anzeigt (Abbildung 4). Wenn die CE akzeptabel ist, fahren Sie mit dem nächsten Fall fort. Datei > Neuer Fall. Wenn das CE nicht akzeptabel ist (Abbildung 4A), bietet die Software Empfehlungen, um einige der Parameter zu ändern. In vielen Fällen verringert die Verringerung des Rahmenabstands die CE-Werte auf einen akzeptablen Bereich(Abbildung 4B).
14. Nachdem Sie alle Anfragen abgeschlossen haben, generieren Sie Ergebnisse für jeden Fall und jede Gruppe (Datei > Ergebnisse).

5. Analyse und Statistik

1. Die Software stellt Daten für jedes Beispiel und jede Gruppe bereit. Die Software selbst berechnet Brüche wie SSF, ASF und TSF und stellt das gesamte Referenzvolumen (V_REF) und die Gesamtlänge (L) der Fasern im Referenzbereich (in diesem Fall NBM)(Abbildung 4B) bereit. Exportieren Sie die Daten und speichern oder kopieren Sie in die statistische Software ihrer Wahl für die Gruppenanalyse. Tabelle 1 zeigt typische Ergebnisdaten für die statistische Analyse. Analysieren Sie die Faserdichte (Lv), indem Sie die gesamte Faserlänge mit dem Referenzvolumen dividieren.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Abbildung 5dargestellt. Gruppe C, die als APPswe-Gruppe (APP) decodiert wurde, hatte eine deutlich geringere Faserlänge (Abbildung 5B) und eine Faserlängendichte (Abbildung 5C) im Vergleich zu ihren Wildtyp-Wurfmatten (WILD). Die Ergebnisse zeigten, dass es keinen signifikanten Unterschied im Volumen der NBM zwischen den beiden anal...

Diskussion

Hier zeigen wir eine Methode zur Abschätzung der Dichte cholinerger Fasern in der NBM mit einer Raumkugelsonde ( Kugel). Diese Sonde schätzt die gesamte Faserlänge in der Region von Interesse. Die Gesamtlänge kann durch das Volumen der Region geteilt werden, um die Faserdichte zu erhalten. Um das Volumen der Region zu schätzen, wurde die Cavalieri-Punktzählungsmethode verwendet. Die Cavalieri-Punktzählungsmethode ist ein unvoreingenommener und effizienter Schätzer eines 3D-Referenzvolumens für jede Region. Die M...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABC kit	Vector Laboratories	PK6100
Anti-ChAT Antibody	Millipore, MA, USA	AB144P
Bovine anti-goat IgG-B	Santacruz Biotechnology	SC-2347
Bovine Serum, Adult	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B9433
Cryostat	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G2025
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1009
Immpact-DAB kit	Vector Laboratories	SK4105	Enhanced DAB peroxidase substrate solution
Ketamine	Westward Pharmaceuticals, NJ, USA	0143-9509-01
Microscope	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA	AF6000	Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	62550-12
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P6148
Permount mounting medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
Stereologer Software	Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA	Stereologer2000	Installed on a Dell Desktop computer.
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	Tris base
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T5941	Tris hydrochloride
Xylazine	Bayer, Leverkusen, Germany	Rompun
Xylenes, Histological grade	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056