Estimativa estereológica do comprimento da fibra cholinergica no Núcleo Basalis de Meynert do Cérebro do Rato

Resumo

O comprimento da fibra neuronal dentro de uma estrutura tridimensional de uma região cerebral é um parâmetro confiável para quantificar a integridade estrutural neuronal específica ou a degeneração. Este artigo detalha um método de quantificação estereológica para medir o comprimento da fibra cholinergicdentro do núcleo basalis de Meynert em camundongos como exemplo.

Resumo

O comprimento de axônons cholinergic ou outros axônticos neuronais em várias regiões cerebrais são frequentemente correlacionados com a função específica da região. A estereologia é um método útil para quantificar perfis neuronais de várias estruturas cerebrais. Aqui fornecemos um protocolo de estereorologia baseado em software para estimar o comprimento total das fibras colinérgicas no núcleo basalis de Meynert (NBM) do cérebro do forebrain basal. O método usa uma sonda de bola espacial para estimativas de comprimento. As fibras colinérgicas são visualizadas pelo sistema de detecção de acetiltransferase de colina (ChAT) com o sistema de detecção de peroxidase-diaminobenzidina (HRP-DAB). O protocolo de coloração também é válido para estimativa de fibras e números de células em várias regiões cerebrais usando software de estereologia. O protocolo de estereorologia pode ser usado para estimativa de quaisquer perfis lineares, como fibras colececeptivas, fibras dopaminérgicas/catecolaminergicas, fibras sorotonergicas, processos ascicitos ou até mesmo perfis vasculares.

Introdução

Estimativas quantitativas de comprimento e/ou densidade de fibras nervosas no cérebro são parâmetros importantes de estudos neuropatológicos. O comprimento dos axônhonas cholinergicgic, dopaminergice e sorotonergicos em várias regiões cerebrais são frequentemente correlacionados com as funções específicas da região. Como a distribuição desses axôlos é geralmente heterogênea, a estereorologia baseada em design é usada para evitar viés durante a amostragem. A sonda de bola espacial da estereorologia foi projetada para fornecer medidas eficientes e confiáveis de estruturas semelhantes a linhas, como fibras neuronais em uma região de interesse¹. A sonda faz uma esfera virtual que é imposta sistematicamente no tecido para medir intersecções de linha com a superfície da sonda. Por ser impossível colocar sondas de esfera no tecido para análise, o software comercialmente disponível fornece uma esfera virtual tridimensional (3D), que é basicamente uma série de círculos concêntricos de vários diâmetros que representam a superfície da sonda esfera.

A neurodegeneração colinérgica seletiva é uma das características consistentes da doença de Alzheimer (AD)^2,3,4. A transmissão colinérgica disfuncional é considerada um fator causal para o declínio cognitivo em AD. A disfunção colinérgica também é evidente em muitos outros transtornos mentais, como Parkinson, vício e esquizofrenia. Diferentes aspectos da neurodegeneração cholinergicsão são estudados em modelos animais (por exemplo, redução na acetilcolina^5,proteína ChAT^6,neurodegeneração de fibras cholinergicas nas proximidades de placas amiloides⁶, e diminuição em fibras cholinergic e varicos sinápticos^7,8). Acredita-se que a degeneração da fibra ocorra antes da perda neuronal, porque a perda neuronal cholinergica nem sempre é observada em estudos. A maioria dos neurônios colinérgicos estão no cérebro basal e no tronco cerebral, e seus axôlos projetam para várias regiões cerebrais, como os cortices e o hipocampo. O NBM está situado no cérebro basal e descobriu-se ser uma das áreas cerebrais comumente afetadas em D.C.

O método fracionário da estereologia baseia-se na amostragem aleatória sistemática de um tecido em múltiplos níveis. A fração amostral de seção (SSF) é a amostragem sistemática não baseada em computador de seções para o método fracionário de estereology. A fração amostral de área (ASF) é a fracionamento de uma área da região de interesse no trecho. Fração amostral de espessura (TSF) é a fracionamento da espessura de uma seção. A sonda de bola espacial nos permite quantificar perfis de interesse em uma esfera 3D em locais fracionados. Aqui usamos uma sonda de bola espacial para estimar o comprimento total das fibras cholinergic no NBM do cérebro do rato para ilustrar os procedimentos. O protocolo atual fornece detalhes sobre processamento de tecidos, métodos de amostragem para estereology, coloração imunohistoquímica usando o anticorpo ChAT e estereorologia imparcial para estimar o comprimento da fibra cholinergice e a densidade de fibras no NBM do cérebro do rato.

Protocolo

Todos os procedimentos para o uso desses animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais do Centro de Idosos de Kansas City. Camundongos de 18 meses de idade superexpressam proteína precursora beta-amilóide sueca (APPswe) e seus companheiros de lixo C57/BL6 WT foram usados para os experimentos. Detalhes da reprodução e genotipagem são dados em He et al.⁸.

1. Perfusão e processamento de tecidos

1. Camundongos anestesiados utilizando uma injeção intraperitoneal com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Beliscar os dedos para confirmar a falta de resposta antes de continuar⁹.
2. Transcardially perfundia com ~50 mL de gelo frio 0,1M Dulbecco tampão de soro (DPBS) seguido por 4% de paraformaldeído (PFA) em 0,1M tampão de fosfato (PB)¹⁰.
   ATENÇÃO: PfA é tóxico. Use equipamentos de proteção individual (EPI) ao trabalhar com PFA.
3. Remova o cérebro¹⁰ e mergulhe em 4% pfa em 0,1 M PB a 4 °C para pós-fixação por 24 h. Lave com DPBS 3x.
4. Mudança para solução de sacarose de 0,1 DPBS durante a noite e, em seguida, 30% solução de sacarose em 0,1 M DPBS para mais 48 h a 4 °C.
5. Remova o tecido da solução de sacarose e congele em uma câmara de criotome predefinida a uma temperatura de -20 °C. Amostras congeladas podem ser armazenadas em tubos lacrados a -80 °C até a secção.
6. Incorpore tecidos em um ótimo meio de incorporação de temperatura de corte (ver Tabela de Materiais)e monte em um disco de espécime. Corte seções de 30 μm de espessura em um plano coronal usando um criotome e colete todas as seções consequentemente em 24 placas de cultura de poço cheias de solução crioprotetora (30% glicerol, 30% glicol de etileno, 40% DPBS; Figura 1A-C). Guarde em um freezer de -20 °C.
   NOTA: Seções mais grossas (por exemplo, 50 μm) são preferíveis quando viáveis. Certifique-se de que as seções são mantidas em ordem de corte e todas as seções estão completamente em crioprotetor. Uma placa de 96 poços pode ser usada como alternativa a 24 placas de poço para coletar seções.
7. Cubra os poços com selador de placas para evitar evaporação e secagem. Guarde placas a -20 °C até o uso. As seções armazenadas a -20 °C estão estáveis por vários meses para imunohistoquímica do ChAT.

2. Seleção sistemática de seção para IHC

NOTA: Um estudo piloto deve ser feito para saber o número total de seções necessárias para alcançar um coeficiente aceitável de erro (CE). O valor CE é uma expressão da quantidade total de erro no procedimento amostral. O menor valor representa o erro mínimo e um valor CE inferior a 0,1 é considerado aceitável pelo software aqui utilizado (ver Tabela de Materiais)¹¹.

1. Identifique as primeiras e últimas seções para cada cérebro comparando características morfológicas com um atlas cerebral padrão do rato, como Franklin e Paxinos. NbM começa em bregma -0,0mm e termina em -1,6 mm. Portanto, cerca de 50 seções contêm NBM. O número total de seções é um dos parâmetros necessários durante a estereorologia. A seleção de cada^8ª seção (SSF = 1/8) deu um total de 6-7 seções para a análise e rendeu um CE aceitável tanto para estimativa de volume quanto para estimativa de comprimento de fibra em nosso estudo piloto.
2. Comece aleatoriamente com uma das oito primeiras seções e, em seguida, amostrar sistematicamente a cada 8^ª seção até a última seção posterior contendo NBM(Figura 1C).

3. Imunohistoquímica

1. Transfira as seções crioreservadas para temperatura ambiente em crioprotetor e, em seguida, 0,1M tampão de fosfato (PB) em 6 placas de poço.
2. Lave 3x na PB.
3. Incubar em 0,3% H₂O₂ em metanol por 15 min.
4. Lave 3x em salino tampão tris (TBS).
5. Incubar em 0,25% Triton X-100 em TBS por 30 min.
6. Bloco com soro bovino 10% normal (NBS) em 0,1% Triton X-100 em TBS por 30 min.
7. Incubar com uma diluição de 1:1.000 de anticorpos primários anti-humanos chat de cabra (ver Tabela de Materiais) em TBS com 0,1% Triton X-100 e 1% NBS para 48 h a 4 °C.
8. Lave 3x em TBS à temperatura ambiente. Realize mais incubação e lavagem à temperatura ambiente.
9. Incubacom anticorpo secundário biotinylated bovino (ver Tabela de Materiais) por 1h.
10. Lave 3x em TBS.
11. Incubar com o complexo avidin-biotina-peroxidase (ver Tabela de Materiais).
12. Lave 3x em TBS.
13. Desenvolva-se usando uma solução avançada de substrato peroxidase DAB (ver Tabela de Materiais) de acordo com as recomendações do fabricante.
    ATENÇÃO: DAB é um suspeito de carcinógeno. É tóxico por contato e inalação. Use EPI ao trabalhar com DAB.
14. Lave o trecho algumas vezes com água destilada e mantenha em Tris pH = 7,6.
15. Monte as seções nos slides gelatinizados. Todas as seções de um tecido podem ser colocadas no mesmo slide. O ar seca as seções, desidrata2x por 5 min cada com 70%, 90%, 95%, e 100% de etanol, e depois limpar as seções com duas lava-matas de 10 min xylene. Deslize as seções usando meio de montagem (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: O tempo de processamento da desidratação e da limpeza afeta a espessura das seções. Portanto, as mesmas condições devem ser utilizadas para todas as seções. No presente estudo, o valor médio para a espessura final foi de 21,11 ± 0,45 μm.
16. Mantenha as seções no capô da fumaça para secar. As seções secas estão prontas para estereology.

4. Estereology

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para o microscópio e o software utilizados. Um objetivo de imersão com abertura numérica (NA) > 1.2 será útil e deve ser utilizado se necessário. Os slides devem ser agrupados de acordo com o genótipo ou grupo de tratamento e codificados. A estereorologia completa para um estudo deve ser realizada pela mesma pessoa e a pessoa que realiza a estereologia deve ser cega à identidade dos slides individuais ou grupo examinado^1,12,13.

1. Abra um novo estudo no software. (File > New Study). Uma caixa de diálogo 'Inicializaçãode Estudo ' será aberta. Preencha as informações do estudo, utilizando Multi-level (Fraction Based) (Figura 2A).
2. Clique duas vezes em 'Volume' Parâmetros, que abrirá a caixa de diálogo Volume. Nomeie o recurso de interesse e selecione a sonda'Contagemde Pontos da Região '. Clique em seguir.
3. Clique duas vezes no próximo parâmetro,'Comprimento'.
   1. Forneça um nome do recurso (porexemplo, 'L') Selecione 'Sphere' sonda e clique em Next.
4. Em seguida, clique na caixa de diálogo 'Inicializaçãodo Estudo ', que abrirá a caixa 'Case Initialization' caixa . Preencha as informações do caso. Os grupos devem ser codificados antes de iniciar o estudo. O número total de seções é o número de seções a partir da primeira seção contendo a área de interesse até a última seção contendo área de interesse (ver etapa 2.1). O intervalo amostral da seção é de oito, pois cada^8seção foi selecionada para a coloração do IHC.
5. Clicando Em seguida abre a caixa de diálogo 'Inicialização de Sonda', que definirá automaticamente a menor ampliação para a seleção e estimativa de volume da região. Confirme as configurações e verifique se a região de interesse pode ser identificada na ampliação mais baixa selecionada. Clique duas vezes em'Volume' e preencha 50.000 μm³ por ponto para a fração de volume da região. Clique em Feito.
6. a Ampliação do Objeto (Alto),coloque o comprimento em 63x ou 100x. Clique duas vezes em 'Comprimento' para abrir a caixa de diálogo Long-Sphere e definir o diâmetro da esfera para 10 μm. Clique feito.
   NOTA: A zona de guarda deve ser determinada com base na espessura real das seções. O operador deve verificar a espessura das seções em vários locais para evitar qualquer dano. Se necessário, ajuste a espessura da zona de guarda com base na espessura da seção.
7. Defina valores apropriados para área de quadros, altura do quadro, zona de guarda e espaçamento de quadros.
   NOTA: Esses valores dependem da heterogeneidade dos perfis de objetos (fibras) na região de estudo. Uma área de quadros de 400 μm², altura do quadro de 10 μm, zona de guarda de 2 μm e espaçamento de quadros de 300 μm dá valores ce aceitáveis para estimativa de comprimento de fibra em NBM. Um estudo piloto deve ser realizado com esses valores antes de ir para o próximo caso.
8. Siga as instruções fornecidas pelo software após cada etapa. As instruções aparecem como uma caixa de diálogo e/ou na parte inferior da tela.
9. Insira a Seção 1.
10. Em baixa ampliação (5x), defina a região de interesse fazendo um limite arbitrário em torno do NBM. Clique no botão Next no canto esquerdo da janela de vídeo. Siga as instruções e confirme que todos os pontos verdes estão no NBM. Os pontos podem ser incluídos ou excluídos clicando nos pontos.
    NOTA: Não há limite definido e definido em torno do NBM. A seleção é definida principalmente por investigadores. Os neurônios cholinergic chat+ do NBM podem ser observados na cápsula interna (ic) e globus pallidus (GP). Neste protocolo, o ic com neurônios cholinergic ChAT+ e suas projeções (fibras) e GP inteiro está incluído no NBM (Figura 1D).
11. Siga as instruções e mude para 63x para medições de fibra na fração atual. A caixa de diálogo 'Section Thickness' aparece na tela. Defina a superfície superior e inferior da seção para medir a espessura real da seção. O movimento manual do eixo Z deve ser usado. Clique em Done.
    NOTA: Se não houver fibra na área, o passo pode ser ignorado para ir para o próximo local de fração.
12. Mova o eixo Z lentamente de cima para baixo na altura do quadro da seção e marque todas as fibras interseccionais na superfície da sonda esfera virtual(Figura 3). Quando feito, clique em Next para ir para o próximo local.
13. Depois de completar todas as frações, o software pedirá para inserir a próxima seção. Repita os passos 4.9-4.12 para todas as seis ou sete seções do tecido.
    1. No final, o software gerará um resultado para o caso mostrando os valores ce (Figura 4). Se o CE for aceitável, prossiga para o próximo caso. Arquivo > Novo Caso. Se o CE não for aceitável (Figura 4A),o software fornece recomendações para alterar alguns dos parâmetros. Em muitos casos, a diminuição do espaçamento do quadro diminui os valores da CE para uma faixa aceitável (Figura 4B).
14. Após a conclusão de todos os casos, gere resultados para cada caso e grupo (Arquivo > Resultados).

5. Análise e estatística

1. O software fornece dados para cada amostra e cada grupo. O próprio software calcula frações como SSF, ASF e TSF, e fornece o volume total de referência (V_REF)e o comprimento total (L) das fibras na região de referência (neste caso, NBM) (Figura 4B). Exporte os dados e salve ou copie para o software estatístico de escolha para entre a análise do grupo. A Tabela 1 mostra dados típicos de resultados para análise estatística. Analise a densidade de fibras (Lv) dividindo o comprimento total da fibra com o volume de referência.

Resultados

Os resultados representativos são mostrados na Tabela 1 e Figura 5. O Grupo C, que foi decodificado como APPswe Group (APP), teve comprimento de fibra significativamente menor (Figura 5B) e densidade de comprimento de fibra(Figura 5C) em comparação com seus companheiros de lixo tipo selvagem (WILD). Os resultados mostraram que não houve diferença significativa no volume do NBM ...

Discussão

Aqui demonstramos um método para estimar a densidade de fibras cholinergic no NBM usando uma sonda de esfera espacial (esfera). Esta sonda estima o comprimento total da fibra na região de interesse. O comprimento total pode ser dividido pelo volume da região para obter a densidade da fibra. Para estimar o volume da região, utilizou-se o método de contagem de pontos Cavalieri. O método de contagem de pontos Cavalieri é um estimador imparcial e eficiente de um volume de referência 3D para qualquer região. O métod...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABC kit	Vector Laboratories	PK6100
Anti-ChAT Antibody	Millipore, MA, USA	AB144P
Bovine anti-goat IgG-B	Santacruz Biotechnology	SC-2347
Bovine Serum, Adult	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B9433
Cryostat	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G2025
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1009
Immpact-DAB kit	Vector Laboratories	SK4105	Enhanced DAB peroxidase substrate solution
Ketamine	Westward Pharmaceuticals, NJ, USA	0143-9509-01
Microscope	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA	AF6000	Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	62550-12
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P6148
Permount mounting medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
Stereologer Software	Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA	Stereologer2000	Installed on a Dell Desktop computer.
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	Tris base
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T5941	Tris hydrochloride
Xylazine	Bayer, Leverkusen, Germany	Rompun
Xylenes, Histological grade	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056