Identificación de trampas extracelulares de neutrófilos en tromba arterial felino incrustada en parafina mediante microscopía de inmunofluorescencia

Resumen

Describimos un método para identificar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en trombos arteriales cardiogénicas felinos finos fijos fijos fijos y con parafina incorporados de formaldehído mediante la recuperación de antígenos inducidos por calor y un protocolo de doble inmunoetiquetado.

Resumen

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET), compuestas de ADN libre de células (CFDNA) y proteínas como histonas y neutrófilos elastasa (NE), son liberadas por neutrófilos en respuesta a inflamación sistémica o patógenos. Aunque anteriormente se ha demostrado que los NET aumentan la formación de coágulos e inhiben la fibrinólisis en humanos y perros, el papel de las NET en gatos con tromboembolismo arterial cardiogénico (CATE), una complicación potencialmente mortal secundaria a la cardiomiopatía hipertrófica , es desconocido. Un método estandarizado para identificar y cuantificar los NETen s en trombos arteriales cardiogénicos en gatos hará avanzar nuestra comprensión de su papel patológico en CATE. Aquí, describimos una técnica para identificar NETs en trombos fijas y incrustadas en parafina dentro de la bifurcación aórtica, extraídas durante la necropsia. Después de la desfinación con xileno, las secciones aórticas se sometieron a una recuperación indirecta de antígenoininina inducido por calor. Las secciones fueron bloqueadas, permeabilizadas y ex vivo NETs fueron identificadas por la colocalización de ADN libre de células (cfDNA), histona citrulinated H3 (citH3), y elastasa de neutrófilos (NE) utilizando microscopía de inmunofluorescencia. Para optimizar la inmunodetección de NETs en trombos, la autofluorescencia de los elementos tisulares se limitó mediante el uso de un proceso de enfriamiento de autofluorescencia antes de la microscopía. Esta técnica podría ser una herramienta útil para estudiar NETs y trombosis en otras especies y ofrece nuevas perspectivas sobre la fisiopatología de esta condición compleja.

Introducción

Los gatos con miocardiopatía hipertrófica corren el riesgo de sufrir complicaciones tromboembólicas potencialmente mortales^1,2. A pesar de la alta morbilidad y mortalidad asociada s con el tromboembolismo arterial cardiogénico felino (CATE), la fisiopatología subyacente del CATE en gatos se entiende mal. También hay herramientas diagnósticas y terapéuticas limitadas para tratar e identificar gatos en riesgo de esta devastadora condición^3.

Además de su papel en la inmunidad innata, se ha demostrado que los neutrófilos desempeñan un papel en la trombosis mediante la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que son redes similares a redes de ADN libre de células (CFDNA) incrustadas con histonas y proteínas granulares como la elastasa de neutrófilos (NE) y la mieloperoxidasa. Los neutrófilos se someten a la formación de NETs en respuesta a la inflamación sistémica, el encuentro directo con patógenos y la interacción con las plaquetas activadas^4,5,6,7. En perros, se ha demostrado que el ADN derivado de neutrófilos inhibe la lisis de coágulos, mientras que las proteínas NET aceleran la formación de coágulos. La capacidad de los NETs para atrapar células circulantes y componentes de coagulación también es clave para sus propiedades trombogénicas^8,9,10,11,12.

Los NET se detectan mediante la colocación de proteínas neutrófilas extracelulares, histonas y ADNr. Debido a esto, la identificación y cuantificación de neTs en tejidos fijos por inmunofluorescencia de tejidos desparafinados es superior a la hematoxilina tradicional y la mancha de eosina (H&E) utilizando la microscopía de campo brillante^4,5. Varios estudios en humanos con microscopía de inmunofluorescencia identificaron las NET como componentes estructurales de trombos arteriales coronarios, trombos cerebral, aterombosis y trombosa venosa^{13,,14,,15,,16,,17}. Hasta la fecha, no se ha descrito un método estandarizado para detectar y cuantificar NETs en trombos felinos. Debido a que la identificación de NETs en trombos arteriales cardiogénicos felinos puede facilitar futuras investigaciones traslacionales en NETys y trombosis, describimos técnicas de identificación y evaluación de LA RED en trombos arteriales incrustados en parafina en gatos.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Davis. Las necropsias y biopsias de tejidos se realizaron con el consentimiento de los propietarios.

1. Fijación de tejidos, incrustación y seccionamiento

1. Diseccionar la bifurcación aórtica, incluyendo la aorta descendente, la arteria femoral y las arterias ilíacas comunes(Figura 1A),poco después de la eutanasia humana o la muerte. Blunt disecciona la fascia(Figura 1B)antes de sumergirla completamente en un 10% de formalina con amortiguación neutra durante un mínimo de 24 h y no más de 48 h.
2. Para deshidratar la muestra, primero sumergir en 10% de formalina con amortiguación neutra calentada a 37 oC durante 1 h. A continuación, sumergir en concentraciones crecientes de etanol calentado a 37 oC (70%, 95%, 100%) 2x para 1 h cada uno. Por último, sin enrsuar, sumergir 2x en 100% tolueno calentado a 37 oC para 1 h cada uno.
3. Añadir parafina calentada a 62oC y permitir que la parafina se solidifique completamente durante la noche.
4. Sección 2–3 m del tejido incrustado en parafina utilizando un microtome y colocar en diapositivas de vidrio cargadas positivamente. Conservar los tejidos seccionados a -80 oC hasta que se pueda seguir analizando.

2. Desparafinación, rehidratación y recuperación de antígenos inducidos por calor

1. Para realizar la desparafinación y rehidratación de secciones en diapositivas de vidrio, coloque los portaobjetos de vidrio en bastidores y procese en el siguiente orden:
   1. Sumergir completamente en 100% xileno durante 3 min. Repita este paso 2x. No enjuague entre pasos.
   2. Sumergir completamente en concentraciones decrecientes de etanol (100%, 95%, 70%) a temperatura ambiente (RT), 3x para 3 min cada uno. No enjuague entre pasos.
   3. Sumergir completamente en agua desionizada durante 2 min.
2. Coloque las secciones en la solución salina tris-buffered con 0.1 % Tween (TBST, pH a 7.6) durante 2-3 min.
3. Llenar el depósito con agua desionizada calentada a 100oC. Deje que la cámara de vapor se equilibre durante 20 minutos.
   NOTA: La recuperación de antígenos inducida por calor se realiza mejor con calentamiento indirecto generado por un vapor con un ajuste de temperatura preestablecido, como un vapor de alimentos.
4. Caliente la solución de recuperación de antígenos disponible en el uso comercial que contiene Tris y EDTA (pH a 95-97 oC en una placa caliente con temperatura controlada con agitación constante. Asegúrese de que no hierva.
   NOTA: La solución debe volverse turbia una vez que se calienta.
5. Vierta la solución de recuperación de antígeno calentado en un recipiente de diapositivas y coloque el recipiente en la cámara del vapor. Permita que la solución de recuperación de antígenos se equilibre a la temperatura del vapor durante 3-4 min. Asegúrese de que la temperatura de la cámara es de 95 oC.
6. Sumerja las diapositivas completamente en la solución de recuperación de antígeno calentado y continúe la aplicación de calefacción externa a través del vapor durante 20 minutos.
7. Retire el recipiente de la corredera del vapor y permita que las diapositivas y la solución de recuperación de antígenos se enfríen a RT. Almacene la solución de recuperación de antígenos diluido a 4 oC y reutilice hasta 2 veces si es necesario.
8. Lave los portaobjetos 3 veces con TBST durante 5 min.

3. Apagado de inmunoetiquetado y autofluorescencia

NOTA: En la Tabla 1 se detalla la composición de los búferes de bloqueo utilizados en los pasos siguientes.

1. Incubar secciones en el búfer de bloqueo 1 durante 2 h a RT bajo balanceo suave (30–50 rpm). Sellar con película de parafina para evitar el secado.
2. Sin lavar, aplicar inmediatamente 100 l de anticuerpo de histona citrulinado antihumano con filina de conejo diluido H3 (citH3) (0,03 mg/ml diluido en el tampón de bloqueo 1) directamente sobre la diapositiva.
3. Coloque un cubreobjetos (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) en cada sección para permitir una distribución uniforme de la mezcla de anticuerpos.
4. Incubar durante 12–16 h a 4oC con balanceo suave (30–50 rpm). Sellar con película de parafilm para evitar el secado.
5. Lavar 3 veces con TBST durante 5 min.
6. Aplicar 100 l de anticuerpo anticonejo de cabra conjugado a Alexa Fluor 488 (diluido a una concentración final de 0,04 mg/ml o 1:50 en el búfer de bloqueo 1) como se describe en el paso 3.3. Incubar durante 1 h a RT bajo suave balanceo (30-50 rpm). Proteja las diapositivas de la luz.
7. Lavar con TBST 3x durante 5 min.
8. Incubar secciones en el búfer de bloqueo 2 durante la noche a 4 oC bajo balanceo suave (30-50 rpm). Proteger de la luz.
9. Lavar con TBST 3x durante 5 min.
10. Bloquee las secciones en el búfer de bloqueo 3 como se describe en el paso 3.3 en RT para 2 h bajo balanceo suave (30-50 rpm).
11. Incubar secciones con anticuerpo NE antihumano de conejo policlonal biotinulado (concentración final de 0,2 g/ml en el búfer de bloqueo 3) a 4 oC durante 12-16 h, tal como se describe en los pasos 3.2–3.4.
12. Lavar con TBST 3x durante 5 min.
13. Incubar con Alexa Fluor 594 conjugado de esptavidina (diluido a 1:100 o 0.02 mg/ml en el búfer de bloqueo 3) como se describe en los pasos 3.2–3.3 para 1 h en RT. Proteger de la luz y sellar con parafina para evitar el secado.
14. Lavar con TBST 1x durante 5 min.
15. Aplicar 100 l de mezcla de solución de temple autofluorescencia directamente en las secciones durante 1 min según las instrucciones del fabricante.
16. Lave inmediatamente los portaobjetos con TBST 6x durante 10 min.
17. Cubra cada diapositiva con 100 sl de 300 nM DAPI durante 5 minutos en la oscuridad.
18. Lavar con TBST durante 3 min. Repita esto para un total de 5x.
19. Aplique una gota (50 l) de medio de montaje antidescolor, parte del kit de enfriamiento de autofluorescencia, directamente sobre el portaobjetos de vidrio que rodea la sección. Coloque suavemente un cubreobjetos (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) suavemente sobre la sección sin crear burbujas.
20. Deje que las muestras se curen durante la noche en la oscuridad a 4 oC hasta que el medio de montaje se haya endurecido para el análisis microscópico con lentes de inmersión.

4. Identificación de trampa extracelular de neutrófilos

NOTA: El siguiente protocolo utiliza un microscopio de epifluorescencia invertida con una cámara CCD digital de 1.280 x 960 (consulte Tabla de materiales).

1. Para localizar el trombo, escanee cranealmente a caudal a lo largo de la longitud de la aorta, la bifurcación aórtica y cada arteria femoral utilizando microscopía de contraste de fase con un objetivo 10x. Un trombo es una conglomeración de tejido que contiene glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas adyacentes al endotelio en contraste de fase y microscopía de campo brillante(Figura 2A, Figura 2B).
2. En primer lugar, examine las secciones para las NET utilizando el canal DAPI (excitación 357/44 nm) con objetivos 10x y 20x(Figura 2C). Tenga en cuenta que cfDNA aparece como ADN descondensado que no está dentro de los confines del citoplasma de una célula cuando se ve en el contraste de fase o microscopía de campo brillante.
3. Identificar el NE extracelular y citH3 en los canales rojos de Texas (excitación 585/29 nm, emisión a 628/32 nm) y canal de proteína fluorescente verde (excitación a 470/22 nm, emisión a 525/50 nm), respectivamente, con objetivos de 10, 20 y 40x.
4. Evalúe y analice los NET dentro de un trombo utilizando el software disponible, como la imagen J (NIH). La formación NET se identifica en función de la colocación de cfDNA, citH3 extracelular y NE como se describió anteriormente¹⁸. Mantenga un tiempo de exposición constante y ganancias de cada canal a lo largo de la adquisición de imágenes para evitar la saturación en la intensidad de los píxeles.
5. Mapear cada trombo en función de su proximidad a la aorta descendente dividiéndolo en tres zonas iguales, con la Zona 1 más cercana a la aorta, la Zona 3 más alejada de la aorta, y la Zona 2 entre las Zonas 1 y 3). Con el operador cegado a la condición médica de cada sujeto, tome al menos diez campos aleatorios en cada zona. Caracterizar la distribución de NETs en trombos promediando el número de campos con NETs en cada zona o calculando el área de ocupación media de NET por zona.

Resultados

Usando este protocolo para la desfinación, la recuperación de antígenos inducidos por calor y la doble inmunoetiquetado de trombos incrustados en parafina, identificamos neTs en CATE felino por primera vez. Los trombos dentro de la bifurcación aórtica se localizaban mediante microscopía de fluorescencia y microscopía de campo brillante utilizando tinción estándar de H&E y microscopía de contraste de fase. En la microscopía de campo brillante, los trombos arteriales felinos consistían en glóbulos rojos, leuco...

Discusión

Describimos un protocolo para identificar NETs en trombos arteriales cardiogénicos felinos fijos utilizando un protocolo de doble inmunoetiquetado y una microscopía de inmunofluorescencia. Aunque sólo se tiñó el trombo arterial cardiogénico, en teoría este protocolo podría utilizarse para otros tipos de trombos y en otras especies veterinarias. La identificación de NETs dentro de trombos arteriales felinos sugiere que los NET pueden desempeñar un papel en la trombosis en gatos.

La de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate	ThermoFisher Scientific	Catalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
EVOS FL Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific	AMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10x	ThermoFisher Scientific	AMEP4681	NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20x	ThermoFisher Scientific	AMEP4682	NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40x	ThermoFisher Scientific	AMEP4699	NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	ThermoFisher Scientific	Catalog # A32723
Goat serum	Jackson Immuno Research Labs	Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibody	Bioss Antibodies	Bs-6982R-Biotin	Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40	Pierce	Product # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slides	Thomas Scientific	Manufacturer No. 1354W-72
Rabbit serum	Life Technology	Catalog # 10510
Target Retrieval Solution	Agilent Dako	S2367	TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit	Vector Laboratories	SP-8400