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要約

熱誘導抗原検索と二重免疫標識プロトコルを用いてホルムアルデヒド固定およびパラフィン埋め込みネコの心原性動脈血栓中の好中球外細胞トラップ(NET)を同定する方法について述べた。

要約

細胞外トラップ(NET)は、細胞を含まないDNA(cfDNA)とヒストンや好中球エラスターゼ(NE)などのタンパク質から構成され、全身性炎症や病原体に応答して好中球によって放出される。NETsは以前、ヒトや犬の血栓形成を増強し、線維化症を阻害することが示されているが、肥大性心筋症に続く生命を脅かす合併症である心原性動脈血栓塞栓症(CATE)を有する猫におけるNETsの役割は不明です。猫の心原性動脈血栓におけるNETを同定し、定量化する標準化された方法は、CATEにおける病理学的役割の理解を進める。ここでは、壊死中に抽出された大動脈分岐内のホルムアルデヒド固定およびパラフィン埋め込みトロンビ中のNETを同定する技術について述べている。キシレンとの脱パラフィン後、大動脈切片は間接的に熱誘導抗原の検索を受けた。その後、切片を遮断、透過、およびex vivo NETsを、無細胞DNA(cfDNA)、ヒストンH3(citH3)、および免疫蛍光顕微鏡を用いた好中球エラスターゼ(NE)の共局在化によって同定された。血栓中のNETの免疫検出を最適化するために、組織元素の自己蛍光は顕微鏡検査の前に自己蛍光消光プロセスを用いて制限された。この技術は、他の種のNETおよび血栓症を研究するのに有用なツールとなり、この複雑な状態の病態生理学に関する新しい洞察を提供する可能性がある。

概要

肥大性心筋症の猫は、生命を脅かす血栓塞栓性合併症のリスクがある 1,,2.猫の心原性動脈血栓塞栓症(CATE)に関連する高い罹患率と死亡率にもかかわらず、猫におけるCATEの基礎となる病態生理は十分に理解されていない。この壊滅的な状態の危険にさらされている猫を治療し、識別するための限られた診断および治療ツールもあります 3.

自然免疫におけるその役割に加えて、好中球は、ヒストンと好中球エラスターゼ(NE)および骨髄ペロペロキシダーゼのような顆粒タンパク質で覆われた無細胞DNA(cfDNA)のウェブのようなネットワークである好中球細胞外トラップ(NETs)を放出することによって血栓症に役割を果たすることが示されている。好中球は、全身性炎症、病原体との直接の遭遇、および活性化された血小板44、5、6、75,6との相互作用に応答してNETs形成を受ける。犬では、好中球由来のDNAが血栓溶血を阻害し、NETタンパク質が血栓形成を加速することが示されている。NETsが循環細胞および凝固成分をトラップする能力は、血栓原性特性88、9、10、11、12の鍵でもあります。,9,10,11,12

NETは細胞外好中球タンパク質、ヒストン、およびcfDNAの共局在化によって検出される。このため、脱パラフィン組織の免疫蛍光による固定組織におけるNETの同定および定量は、明視野顕微鏡44,55を用いた伝統的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色よりも優れている。免疫蛍光顕微鏡を用いたいくつかのヒト研究では、NETsを冠状動脈血栓、脳卒中血栓、アテローム血栓症、静脈血栓13、14、15、16、17の構造成分として同定した。13,14,15,16,17現在までに、ネコ血栓中のNETを検出および定量する標準化された方法は説明されていない。ネコの心原性動脈血栓におけるNETの同定は、NETsおよび血栓症における将来の翻訳研究を促進する可能性があるため、猫におけるパラフィン埋め込まれた動脈血栓におけるNET同定および評価の技術について述べている。

プロトコル

ここで説明するすべての方法は、カリフォルニア大学デービス校の制度的動物管理および使用委員会のガイドラインに従って行われました。組織の壊死と生検は、所有者の同意を得て行われました。

1. 組織固定、埋め込み、切除

  1. 大動脈分岐を解剖し、下降大動脈、大腿動脈、および一般的な腸骨動脈(図1A)を含む、人道的安楽死または死亡の直後に。鈍いは、少なくとも24時間と48時間未満の10%中性緩衝ホルマリンにそれを完全に沈める前に、筋膜(図1B)を解剖します。
  2. 試料を脱水するために、まず10%中性緩衝ホルマリンを1時間37°Cに加熱して沈水する。その後、37°C(70%、95%、100%)に加熱されたエタノール濃度の上昇に沈水それぞれ1時間2倍。最後に、すすかずに、100%トルエンで2倍を1時間加熱して37°Cに加熱した。
  3. 62°Cに加熱したパラフィンを加え、パラフィンを完全に一晩固める。
  4. ミクロトームを使用したパラフィン埋め込み組織のセクション2~3 μmを、正に帯電したガラススライドに配置します。さらに分析するまで-80°Cで切除組織を保管してください。

2. 脱パラフィン、再水和、熱誘導抗原の検索

  1. ガラススライド上のセクションの分離と水分補給を実行するには、ガラススライドをラックに配置し、次の順序で処理します。
    1. 3分間100%キシレンで完全に沈み込む。ステップ間でリンスしないでください。
    2. エタノールの濃度を減少させる完全に水没 (100%, 95%, 70%)室温(RT)で、3倍の3分ずつ。ステップ間でリンスしないでください。
    3. 2分間、脱イオン水に完全に沈み込みます。
  2. 2~3 分間、0.1 % Tween (TBST, pH = 7.6) でトリスバッファー生理液線にセクションを配置します。
  3. 100°Cに加熱脱イオン水で貯水池を充填します。蒸気室を20分間平衡化します。
    注:熱誘導抗原の検索は、食品蒸し器などの温度設定が設定されたスチーマーによって生成された間接加熱で行うのが最善です。
  4. トリスとEDTA(pH=9)を含む市販の抗原検索溶液を温度制御ホットプレート上で95〜97°Cに加熱し、一定の攪拌を行います。沸騰しないようにしてください。
    注: ソリューションは、温めると曇りになります。
  5. 加熱した抗原検索液をスライド容器に注ぎ、容器を蒸し器のチャンバーに入れます。抗原検索溶液を3~4分間、蒸気器の温度に平衡化させ、チャンバーの温度が約95°Cであることを確認します。
  6. 熱い抗原の検索の解決にスライドを完全に水に沈め、20分間の蒸し器を介して外部加熱の適用を続ける。
  7. スチーマーからスライド容器を取り出し、スライドおよび抗原検索溶液を冷却してRTに冷却させ、希釈された抗原検索溶液を4°Cに保存し、必要に応じて最大2倍再利用します。
  8. スライド3xをTBSTで5分間洗います。

3. 免疫標識と自己蛍光のクエンチ

注:表 1は、次の手順で使用されるブロッキング バッファの構成を示しています。

  1. 緩やかな揺れ(30~50 rpm)の下でRTで2時間ブロックバッファ1のインキュベートセクション。乾燥を避けるためにパラフィンフィルムでシールします。
  2. 洗浄せずに、100μLの希釈ウサギポリクローナル抗ヒトシトルリン化ヒストンH3(citH3)抗体(0.03mg/mLをブロッキングバッファー1に希釈)をスライドに直接塗布します。
  3. 各セクションにカバースリップ(24 mm x 40 mm x 0.13~0.17 mm)を配置し、抗体混合物の均等な分布を可能にします。
  4. 穏やかな揺れ(30-50のrpm)と4 °Cで12-16時間のインキュベート。乾燥を避けるためにパラフィルムフィルムでシールします。
  5. TBSTで3倍の洗濯を5分間洗います。
  6. ステップ3.3に記載されているように、アレクサFluor 488(0.04 mg/mLまたはブロッキングバッファ1で1:50の最終濃度に希釈)に結合したヤギ抗ウサギ抗体の100 μLを適用します。RTで1時間インキュベートして、穏やかな揺れ(30~50 rpm)で行います。スライドを光から保護します。
  7. TBST 3xで5分間洗います。
  8. 緩やかな揺動(30~50 rpm)の下で4°Cでブロッキングバッファ2のセクションをインキュベートします。光から守る。
  9. TBST 3xで5分間洗います。
  10. ブロッキングバッファ3のブロックセクションは、ステップ3.3でRTで2時間(30〜50 rpm)でブロックします。
  11. ステップ3.2-3.4に記載されているように、ビオチン化ポリクローナルウサギ抗ヒトNE抗体(最終濃度=ブロッキングバッファ3の0.2 μg/mL)を4°Cで12〜16時間インキュベートしたセクション。
  12. TBST 3xで5分間洗います。
  13. ALEXA Fluor 594ストレプトアビジンコンジュゲート(ブロッキングバッファ3では1:100または0.02 mg/mLに希釈)を用いてインキュベートし、RTで1時間のステップ3.2-3.3に記載されているように、乾燥を防ぐためにパラフィンで保護します。
  14. TBST 1xで5分間洗います。
  15. 100 μLの自家蛍光焼入れ液混合物を、製造業者の指示に従って1分間、セクションに直接塗布します。
  16. すぐに10分間、TBST 6xでスライドを洗います。
  17. 各スライドに300 nM DAPIの100 μLを覆い、暗闇の中で5分間おります。
  18. TBSTで3分間洗います。
  19. 自己蛍光消光キットの一部であるアンチフェード実装媒体のドロップ(約50μL)を、セクションを囲むガラススライドに直接塗布します。カバースリップ(24 mm x 40 mm x 0.13~0.17 mm)を、泡を作成せずに、セクションにそっと置きます。
  20. 浸漬レンズによる顕微鏡分析のために取り付け媒体が硬化するまで、サンプルを4°Cの暗闇の中で一晩治すことができます。

4. 好中球細胞外トラップの同定

注:次のプロトコルは、1,280 x 960デジタルCCDカメラを搭載した反転性蛍光顕微鏡を利用しています(材料表を参照)。

  1. 血栓を見つけるには、大動脈の長さに沿って、大動脈分岐、および10倍の目的を有する位相対視による各大腿動脈に沿って、目を通してスキャンする。血栓は、赤血球、白血球、および内皮に隣接する血小板を含む組織の集まりであり、位相コントラストおよび明視野顕微鏡で(図2A、図2B)。
  2. 最初に、10x および 20x の目標を持つ DAPI チャネル (励起 = 357/44 nm) を使用して NET のセクションを調べます (図 2C)。cfDNAは位相コントラストや明るい視野顕微鏡で見ると細胞の細胞質の範囲内にない縮合DNAとして現れる。
  3. テキサス赤チャネル(励起= 585/29 nm、発光= 628/32 nm)および緑色蛍光タンパク質チャネル(励起= 470/22 nm、放出量= 525/50nm)上の細胞外NEおよびcitH3をそれぞれ10、20、および40xの目標で同定する。
  4. イメージ J (NIH) などの利用可能なソフトウェアを使用して、血栓内の NET を評価および分析します。NET形成は、cfDNA、細胞外citH3、およびNEの共局在化に基づいて、前述の18に基づいて同定される。ピクセルの輝度の飽和を避けるために、画像の取得を通じて各チャンネルの一貫した露出時間とゲインを維持します。
  5. 各血栓を降りる大間への近接度に基づいて、大間に最も近いゾーン1、大間から最も遠いゾーン3、ゾーン1と3の間のゾーン2を3つの等しいゾーンに分割してマッピングします。オペレータが各被験者の病状に目がくらんだ状態で、各ゾーンで少なくとも10個のランダムフィールドを取る。各ゾーンの NET を使用してフィールド数を平均化するか、ゾーンあたりの平均 NET 占有面積を計算することにより、血栓中の NET の分布を特徴付けます。

結果

このプロトコルを用いて、パラフィン埋め込み血栓の脱パラフィン化、熱誘導抗原検索、および二重免疫標識を行い、ネコのCATE中のNETを初めて同定した。大動脈分岐内のトロンビは、標準的なH&E染色および位相コントラスト顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡と明視野顕微鏡検査によって位置付けられていた。明るいフィールド顕微鏡では、ネコ動脈血栓は赤血球、白血球、フィブリン、および血小...

ディスカッション

我々は、二重免疫標識プロトコルおよび免疫蛍光顕微鏡を用いて、固定ネコ心原性動脈血栓におけるNETを同定するためのプロトコルを記述する。心原性動脈血栓のみが染色されたが、理論的には、このプロトコルは他のタイプの血栓および他の獣医種に使用することができる。ネコの動脈血栓内のNETの同定は、NETが猫の血栓症に役割を果たす可能性があることを示唆している。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、カリフォルニア大学デービスコンパニオンアニマルヘルスセンター(CCAH 2018-30-F)からの資金によって支えられました。著者らは、ケビン・ウーラード博士が蛍光顕微鏡を使用することを認めたい。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)Life Technologies CorporationD1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugateThermoFisher ScientificCatalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibodyAbcamAb5103
EVOS FL Cell Imaging SystemThermoFisher ScientificAMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10xThermoFisher ScientificAMEP4681NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20xThermoFisher ScientificAMEP4682NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40xThermoFisher ScientificAMEP4699NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibodyThermoFisher ScientificCatalog # A32723
Goat serumJackson Immuno Research LabsCatalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibodyBioss AntibodiesBs-6982R-BiotinRabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40PierceProduct # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slidesThomas ScientificManufacturer No. 1354W-72
Rabbit serumLife TechnologyCatalog # 10510
Target Retrieval SolutionAgilent DakoS2367TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching KitVector LaboratoriesSP-8400

参考文献

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