JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים את השיטה כדי לזהות השמנות נויטרופילים מסחטות (רשתות) ב פורמלדהיד-קבוע ו פרפין-מוטבע העורקים בעורק העורקי באמצעות החום המושרה אנטיגן ופרוטוקול immunolabeling כפול.

Abstract

מלכודות מסחטות נויטרופילים (רשתות), מורכב של DNA ללא תא (cfdna) וחלבונים כמו יסטוניים ו נויטרופילים elastase (NE), משתחררים על ידי נויטרופילים בתגובה לדלקת מערכתית או פתוגנים. למרות רשתות הוכחו בעבר להגדיל את היווצרות קריש ולעכב fibrinolysis בבני אדם וכלבים, את התפקיד של רשתות אצל חתולים עם ידע העורקים הקרדיוגנטית (קייט), סיבוך מסכנת חיים משני כדי יפרטרופית מחלת שריר הלב , אינו ידוע. שיטה סטנדרטית לזיהוי ולכמת רשתות בתרובי העורקים הקרדיוגנטית אצל חתולים, תקדם את הבנתנו את תפקידם הפתולוגי בקייט. כאן, אנו מתארים טכניקה כדי לזהות רשתות ב פורמלדהיד-קבוע ו פרפין-מוטבע הטרובי בתוך הבייון אבי העורקים, שחולצו במהלך נקרופסי. בעקבות הסיכום עם קסילן, מקטעים של אבי העורקים עברו לאיחזור אנטיגן עקיף המושרה בחום. מקטעים נחסמו אז, החדיר, ו לשעבר vivo נטס זוהו על ידי לוקליזציה של ה-dna ללא תא (cfdna), מcitH3 היסטון מH3 ה, ו נויטרופילים elastase (NE) באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence. כדי לייעל את גילוי החיסוני של רשתות בתרובי, הקרינה האוטומטית של רכיבי הרקמה הוגבלה באמצעות תהליך מקושה לפני מיקרוסקופ. טכניקה זו עשויה להיות כלי שימושי לחקר רשתות ופקקת במינים אחרים ומציעה תובנות חדשות לתוך הפתופסולוגיה של מצב מורכב זה.

Introduction

חתולים עם יפרטרופית שריר הלב הם בסיכון של מסכנת חיים thromboembolic סיבוכים1,2. למרות התחלואה והתמותה הגבוהים הקשורים לידע העורקים (קייט), הפתופסולוגיה הבסיסית של קייט אצל חתולים מובנת בצורה גרועה. יש גם כלים מוגבלים אבחון וטיפולי לטפל ולזהות חתולים בסיכון זה מצב הרסני3.

בנוסף לתפקידה בחסינות מולדת, נויטרופילים הוכחו לשחק תפקיד פקקת על ידי שחרור מלכודות נויטרופילים מסחטות (רשתות), שהם רשתות כמו רשת של DNA ללא תא (cfDNA) מצופה עם האבנים וחלבונים בעלי כגון נויטרופילים elastase (NE) ו myeloperoxidase. נויטרופילים לעבור רשתות היווצרות בתגובה לדלקת מערכתית, מפגש ישיר עם פתוגנים, אינטראקציה עם טסיות מופעל4,5,6,7. אצל כלבים, נויטרופילים הנגזר DNA הוכח לעכב את הליזה קריש, בעוד חלבונים נטו להאיץ את היווצרות קריש. היכולת של רשתות להשמנה תאים מחזורי ורכיבי קרישת דם הוא גם מפתח למאפייני thrombogenic שלהם8,9,10,11,12.

הרשתות מזוהות על ידי לוקליזציה של חלבונים נויטרופילים, האבנים, ו cfDNA. בשל כך, הזיהוי והקוונפיקציה של רשתות ברקמות קבועות על-ידי immunofluorescence מרקמות של ממחטות הנייר מעולה למטאוקסילין המסורתי ולאאוזין (H & E) באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר4,5. מספר מחקרים אנושיים באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence מזוהה רשתות כרכיבים מבניים של תרובי עורקים בעורק כלילי, שבץ מוחי התרובי, atherothrombosis, ו בורידים ורידים13,14,15,16,17. עד כה, לא תוארה שיטה סטנדרטית לזיהוי ולכמת רשתות בקריבי חתולים. מכיוון שזיהוי רשתות בתרופני העורקים הכאותית של חתולים עשוי להקל על מחקר הטרנסשלאני העתידי ברשתות ובפקקת, אנו מתארים טכניקות של זיהוי נטו והערכה ב-פרפין-התרובי העורקים המוטבעים אצל חתולים.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן בוצעו בהתאם להנחיות של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ולשימוש באוניברסיטת קליפורניה, דיוויס. שמלות וביופסיות של רקמות בוצעו עם הסכמת הבעלים.

1. קיבוע רקמה, הטבעה ושיבוץ

  1. לנתח את הבייון של אבי העורקים, כולל את אבי העורקים היורדים, עורק הירך והעורקים המשותפים (איור 1A), זמן קצר לאחר המתת חסד או מוות. בוטה לנתח את הfascia (איור 1B) לפני מיזוג זה לחלוטין ב 10% ניטרלי באגירה מלאה עבור מינימום של 24 h ולא יותר מ 48 h.
  2. כדי לחמם את הדגימה, הטבול תחילה ב-10% פורמאלין ניטרלי באגירה מחוממת עד 37 ° צ' עבור 1 h. אז, לטבול בריכוזים גוברת של אתנול מחומם ל 37 ° צ' (70%, 95%, 100%) 2x עבור 1 h כל אחד. לבסוף, ללא שטיפה, להטביע 2x ב 100% טולואן מחומם ל 37 ° צ' עבור 1 h כל אחד.
  3. הוסיפו פרפין מחומם ל-62 ° c ואפשרו לפרפין לגבש לילה לחלוטין.
  4. סעיף 2 – 3 יקרומטר של פרפין-רקמה מוטבעת באמצעות מיקרוטום ומקום על מגלשות זכוכית טעונה חיובי. אחסן את הרקמות הסבחנות ב-80 ° צ' עד לניתוח נוסף.

2. מעקב אחר התחדשות, מחדש, והשפעת אנטיגן חום

  1. לביצוע מיון והסבה של קטעים על שקופיות זכוכית, מניחים שקופיות זכוכית בארונות תקשורת ובתהליך בסדר הבא:
    1. לטבול לגמרי ב 100% קסילן עבור 3 דקות. חזור על שלב זה 2x. אין לשטוף בין שלבים.
    2. הטבול לחלוטין בריכוזים הפחתת של אתנול (100%, 95%, 70%) בטמפרטורת החדר (RT), 3x עבור 3 דקות כל אחד. אין לשטוף בין שלבים.
    3. יש לטבול לחלוטין במים מפוהים למשך 2 דקות.. אני חוזר
  2. במקום מקטעים לתוך מלוחים באגירה טריס עם 0.1% רצף (TBST, pH = 7.6) עבור 2 – 3 דקות.
  3. ממלאים את המאגר עם מים מפוהים מחוממים עד 100 ° c. הניחו לחדר הקיטור להיות מוקצב במשך 20 דקות.
    הערה: אחזור אנטיגן המושרה בחום מבוצע באופן הטוב ביותר עם חימום עקיף שנוצר על ידי קיטור עם הגדרת טמפרטורה קבועה מראש, כגון סיר מזון.
  4. מחממים את הפתרון הזמין מסחרית לאחזור אנטיגן המכיל טריס ו EDTA (pH = 9) כדי 95-97 ° צ' על צלחת חמה מבוקרת טמפרטורה עם ערבוב קבוע. ודא שהיא אינה מרתיחה.
    הערה: הפתרון צריך להיות מעונן ברגע שהוא מחומם.
  5. יוצקים את הפתרון לאחזור אנטיגן מחומם לתוך מיכל שקופית והניחו את המיכל בחדר הקיטור. אפשר את הפתרון לאחזור אנטיגן כדי להתמצא בטמפרטורת הקיטור במשך 3 – 4 דקות. ודא שטמפרטורת החדר היא ~ 95 ° c.
  6. הטבול את השקופיות לחלוטין בתמיסה לאחזור אנטיגן מחומם והמשך ביישום של חימום חיצוני דרך מסיר הקיטור במשך 20 דקות.
  7. הסר את המכל שקופית מן הקיטור ולאפשר את השקופיות ואת פתרון אחזור אנטיגן להתקרר ל RT. לאחסן את הפתרון אחזור אנטיגן מדולל ב 4 ° צ' ושימוש חוזר עד 2x אם יש צורך.
  8. שוטפים את השקופיות 3 x עם TBST עבור 5 דקות.

3. אימונוולבלינג ומוקרינה אוטומטית

הערה: טבלה 1 מפרטת את ההרכב של מאגרי החסימה המשמשים בשלבים הבאים.

  1. מקטעים דגירה במאגר חסימת 1 עבור 2 h ב RT תחת נדנדה עדין (30-50 סל ד). חותם עם סרט פרפין כדי להימנע מייבוש.
  2. ללא כביסה, מיד להחיל 100 μL של הארנב מדולל שבטים שבטיים H3 (citH3) הנוגדן (0.03 mg/mL מדולל מאגר חסימת 1) ישירות על השקופית.
  3. המקום coverslip (24 מ"מ x 40 מ"מ x 0.13 – 0.17 mm) על כל קטע כדי לאפשר אפילו הפצה של תערובת הנוגדן.
  4. דגירה של 12 – 16 h ב 4 ° צ' עם נדנדה עדין (30-50 סל ד). חותם עם הסרט parafilm כדי למנוע ייבוש.
  5. כביסה 3x עם TBST עבור 5 דקות.
  6. החל 100 μL של נוגדן אנטי ארנבון עז מצופנים ל אלקסה Fluor 488 (מדולל לריכוז הסופי של 0.04 mg/mL או 1:50 במאגר חסימת 1) כמתואר בשלב 3.3. דגירה עבור 1 h ב RT תחת נדנדה עדין (30-50 סל ד). הגנה על שקופיות מאור.
  7. לשטוף עם TBST 3x עבור 5 דקות.
  8. מקטעי הדגירה של חסימת מאגר 2 לילה ב 4 ° c תחת נדנדה עדין (30-50 סל ד). . הגנה מפני אור
  9. לשטוף עם TBST 3x עבור 5 דקות.
  10. מקטעים לחסום במאגר חסימת 3 כמתואר בשלב 3.3 בשעה RT עבור 2 h תחת נדנדה עדינה (30-50 סל ד).
  11. מקטעים דגירה עם הארנב polytinylated האנטי האדם נוגדן NE (הריכוז הסופי = 0.2 μg/mL בחסימת מאגר 3) ב 4 ° צ' עבור 12 – 16 h כפי שמתואר בשלבים 3.2 – 3.4.
  12. לשטוף עם TBST 3x עבור 5 דקות.
  13. דגירה עם אלקסה Fluor 594 streptavidin המשלים (לדלל 1:100 או 0.02 mg/mL במאגר חסימת 3) כמתואר בשלבים 3.2 – 3.3 עבור 1 h ב RT. להגן מפני אור וחותם עם פרפין כדי למנוע ייבוש.
  14. לשטוף עם TBST 1x עבור 5 דקות.
  15. החל 100 μL של שילוב הפתרון האוטומטי של ברירת הדרך ישירות על המקטעים עבור 1 דקות כפי שהורו על ידי היצרן.
  16. שטוף מיד את השקופיות עם TBST 6x במשך 10 דקות.
  17. לכסות כל שקופית עם 100 μL של 300 ננומטר DAPI עבור 5 דקות בחושך.
  18. לשטוף עם TBST עבור 3 דקות. חזור על הפעולה עבור סכום כולל של 5x.
  19. החל טיפה (~ 50 μL) של אמצעי הרכבה אנטי-לדעוך, חלק מערכת הקוצ'ינג האוטומטית של המערכת, ישירות על שקופית הזכוכית שמקיפה את המקטע. המקום coverslip (24 מ"מ x 40 מ"מ x 0.13 – 0.17 mm) בעדינות על המקטע מבלי ליצור כל בועות.
  20. לאפשר דגימות לרפא לילה בחושך על 4 ° צ' עד המדיום ההרכבה התקשה לניתוח מיקרוסקופי עם עדשות טבילה.

4. מסחטות נויטרופילים זיהוי מלכודת

הערה: הפרוטוקול הבא מנצל מיקרוסקופ אפידלנטית הפוך עם 1,280 x 960 מצלמה דיגיטלית CCD (ראה טבלת חומרים).

  1. כדי לאתר את הקריבי, סרוק את הגולגולת לאורך העורקים, הביקטיון של אבי העורקים, וכל עורק הירך בעזרת מיקרוסקופ בניגוד פאזה עם מטרה 10x. הטרובוס הוא מבנה של רקמה המכילה תאי דם אדומים, כדוריות דם לבנות וטסיות הסמוכות לאנדותל בניגוד לפאזה ומיקרוסקופ שדה בהיר (איור 2A, איור 2a).
  2. ראשית לבחון סעיפים עבור רשתות באמצעות ערוץ DAPI (עירור = 357/44 ננומטר) עם מטרות 10x ו 20x (איור 2C). שימו לב כי cfDNA מופיע כמו לפרק דנ א שאינו בתוך הגבולות של ציטופלסמה תא כאשר רואים על ניגודיות הפאזה או מיקרוסקופ שדה בהיר.
  3. זיהוי NE וcitH3 על ערוצי טקסס אדום (עירור = 585/29 nm, פליטה = 628/32 nm) וערוץ חלבון פלורסנט ירוק (עירור = 470/22 nm, פליטה = 525/50 ננומטר), בהתאמה עם 10, 20, ו 40x יעדים.
  4. הערכה וניתוח רשתות בתוך הטרובוס באמצעות תוכנה זמינה, כגון Image J (NIH). היווצרות NET מזוהה על בסיס לוקליזציה של cfDNA, מcitH3 ו-NE כמתואר בעבר18. לשמור על זמן חשיפה עקבית ורווחי של כל ערוץ במהלך רכישת תמונות כדי למנוע רוויה בעוצמת פיקסל.
  5. מפה כל הטרובוס מבוסס על קרבתו אל העורקים היורדים על ידי חלוקת אותו לשלושה אזורים שווים, עם אזור 1 הקרוב ביותר לעורקים, אזור 3 הרחוק ביותר מן העורקים, ואזור 2 בין אזורים 1 ו-3). כאשר המפעיל עיוור את המצב הרפואי של כל נושא, לקחת לפחות עשרה שדות אקראיים בכל אזור. אפיון התפלגות הרשתות בהטרובי על-ידי ממוצע מספר השדות עם הרשתות בכל אזור או חישוב השטח הממוצע הכובש בכל אזור.

תוצאות

השימוש בפרוטוקול זה לאיתור מיקוד, לאחזור אנטיגן מושרה בחום, והחיסונית כפולה של הטרובי מוטבע, זיהינו רשתות בפעם הראשונה של החתול קייט. התרובי בתוך הבייון אבי העורקים נמצאו על ידי מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית ומיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות כתמים סטנדרטיים של H & E ומיקרוסקופ ניגודיות פאזה. ע?...

Discussion

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי רשתות בתרובי העורקים הדו-קרדיוגנטיים הקבועים באמצעות פרוטוקול חיסוני כפול ומיקרוסקופ אימונולובורנציה. למרות שרק תרובי עורקי העורקים היו מוכתמים, בתאוריה זו ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עבור סוגים אחרים של התרובי ומינים וטרינריים אחרים. זיהוי רשתות בתוך תרופני חת...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

המחקר נתמך על ידי קרנות מאוניברסיטת קליפורניה, דיוויס, המרכז לבריאות בעלי חיים לוויה (CCAH 2018-30-F). המחברים רוצים להכיר בדוקטור קווין וולארד לשימוש במיקרוסקופ הזריחה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)Life Technologies CorporationD1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugateThermoFisher ScientificCatalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibodyAbcamAb5103
EVOS FL Cell Imaging SystemThermoFisher ScientificAMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10xThermoFisher ScientificAMEP4681NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20xThermoFisher ScientificAMEP4682NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40xThermoFisher ScientificAMEP4699NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibodyThermoFisher ScientificCatalog # A32723
Goat serumJackson Immuno Research LabsCatalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibodyBioss AntibodiesBs-6982R-BiotinRabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40PierceProduct # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slidesThomas ScientificManufacturer No. 1354W-72
Rabbit serumLife TechnologyCatalog # 10510
Target Retrieval SolutionAgilent DakoS2367TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching KitVector LaboratoriesSP-8400

References

  1. Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).
  2. Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
  3. Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
  4. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  5. Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
  6. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  7. Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
  8. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  9. Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
  10. Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
  11. Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
  12. Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
  13. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  14. Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
  15. Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
  16. Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
  17. Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
  18. Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
  19. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  20. Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
  21. Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
  22. Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
  23. Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
  24. Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
  25. Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
  26. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  27. Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
  28. Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157H3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved