Идентификация нейтрофилов Внеклеточных Ловушек в Параффина-embedded Feartline артериальных тромби с использованием иммунофлюоресценционной микроскопии

Резюме

Мы описываем метод выявления нейтрофилов внеклеточных ловушек (NETs) в формальдегид-фиксированной и парафина встроенных кошачьих кардиогенных артериальных тромбов с использованием тепло-индуцированного антигена поиска и двойной иммуномаркировки протокола.

Аннотация

Нейтрофил внеклеточных ловушек (NETs), состоящий из клеточной ДНК (cfDNA) и белков, как гистоны и нейтрофил эластаза (NE), высвобождаются нейтрофилов в ответ на системное воспаление или патогенов. Хотя ранее было показано, что NETs увеличивают образование тромбов и подавляют фибринолиз у людей и собак, роль NETs у кошек с кардиогенной артериальной тромбоэмболией (CATE), опасным для жизни осложнением, вторичным по отношению к гипертрофической кардиомиопатии , неизвестно. Стандартизированный метод для выявления и количественной оценки NET в кардиогенных артериальных тромбов у кошек будет способствовать нашему пониманию их патологической роли в CATE. Здесь мы описываем метод выявления NETs в формальдегид-фиксированной и парафина встроенных тромбо в аортальной бифуркации, извлеченные во время некропсии. После депарафинизации с ксиленом, аортальные секции прошли непрямой тепло-индуцированного антигена поиска. Разделы были затем заблокированы, permeabilized, и ex vivo NETs были определены путем coлокализации клеточной ДНК (cfDNA), цитруллинированный гистон H3 (citH3), и нейтрофил elastase (NE) с использованием иммунофлюоресценции микроскопии. Для оптимизации иммунообнаружения NETвов в тромби, аутофлуоресценция элементов ткани была ограничена с помощью процесса закалки аутофлюоресценции до микроскопии. Этот метод может быть полезным инструментом для изучения NETs и тромбоза в других видах и предлагает новые идеи в патофизиологии этого сложного состояния.

Введение

Кошки с гипертрофической кардиомиопатией подвергаются риску опасных для жизни тромбоэмболических осложнений^1,,2. Несмотря на высокую заболеваемость и смертность, связанные с кошачьей кардиогенной тромбоэмболией (КАТЭ), лежащая в основе патофизиология CATE у кошек плохо понимается. Есть также ограниченные диагностические и терапевтические инструменты для лечения и выявления кошек, подверженных риску этого разрушительного состояния³.

В дополнение к своей роли в врожденном иммунитете, нейтрофилы, как было показано, играют роль в тромбозе, выпустив нейтрофил внеклеточных ловушек (NETs), которые веб-подобных сетей клеточной ДНК (cfDNA) инкрустированы гистонами и гранулированных белков, как нейтрофил эластазы (NE) и миелопероксиды. Нейтрофилы проходят образование NET в ответ на системное воспаление, прямое столкновение с патогенными микроорганизмами, а также взаимодействие с активированными тромбоцитами^4,,55,6,,7. У собак днк, полученная из нейтрофилов, подавляет лизис тромбов, в то время как протеины NET ускоряют образование тромбов. Способность NETs улавливать циркулирующие клетки и компоненты коагуляции также является ключом к их тромбогенным свойствам^{8,,9,,10,,11,,12.}

NET обнаруживаются путем колокализации внеклеточных нейтрофильных белков, гистонов и cfDNA. Из-за этого, выявление и количественное определение NETs в фиксированных тканях иммунофлуоресценции депарафинизированных тканей превосходит традиционные гематоксилин и эозин (H и E) пятно с использованием яркой микроскопии поля^4,5. Несколько человеческих исследований с использованием иммунофлуоресценционной микроскопии определили NETs как структурные компоненты коронарных артериальных тромбов, тромбов мозгового инсульта, атеротромбоза и венозной тромбы^13,14,16,,17.¹⁷ На сегодняшний день не описан стандартизированный метод выявления и количественной оценки NET в кошачьих тромби. Поскольку выявление NET s в кошачьих кардиогенных артериальных тромбов может облегчить будущие трансляционные исследования в NETs и тромбоз, мы описываем методы net идентификации и оценки в парафинавстроенных артериальных тромбов у кошек.

протокол

Все описанные здесь методы были выполнены в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе. Некропсии и биопсии тканей проводились с согласия владельцев.

1. Фиксация тканей, встраивание и секция

1. Рассекать аортальные бифуркации, в том числе нисходящей аорты, бедренной артерии, и общие подвздошные артерии (Рисунок 1A), вскоре после гуманной эвтаназии или смерти. Блант вскрыть фасции(рисунок 1B) до погружения его полностью в 10% нейтрально-буферизированных формалин для как минимум 24 ч и не более 48 ч.
2. Чтобы обезвоживать образец, сначала погрузите в 10% нейтрально-буферизированный формалин, нагретый до 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч. Затем погружайся в возрастающие концентрации этанола, нагреваемого до 37 градусов по Цельсию (70%, 95%, 100%) 2x на 1 ч каждый. Наконец, без промывки, погрузите 2x в 100% толуол нагретый до 37 градусов по Цельсию на 1 ч каждый.
3. Добавьте парафин с подогревом до 62 градусов по Цельсию и дайте парафину полностью затвердеть на ночь.
4. Раздел 2-3 мкм парафина-встроенных тканей с использованием микротома и место на положительно заряженных стеклянных слайдов. Храните секционные ткани при -80 градусах по Цельсию до дальнейшего анализа.

2. Депараффинизация, регидратация и извлечение антигена, индуцированного в теплом,

1. Для выполнения депарафинизации и регидратации секций на стеклянных слайдах, поместите стеклянные горки в стеллажи и процесс в следующем порядке:
   1. Полностью погрузите в 100% ксилена в течение 3 мин. Повторите этот шаг 2x. Не смягчить между шагами.
   2. Погружение полностью в снижение концентрации этанола (100%, 95%, 70%) при комнатной температуре (RT), 3x на 3 мин каждый. Не смягчить между шагами.
   3. Погрузите полностью в деионизированную воду в течение 2 мин. Повторите.
2. Поместите разделы в Tris-буферированный солен с 0,1% Tween (TBST, рН 7,6) в течение 2-3 мин.
3. Заполните резервуар деионизированной водой, нагретой до 100 градусов по Цельсию. Дайте пароходу уравновесить 20 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тепло-индуцированный антиген поиска лучше всего выполняется с косвенным нагрева, генерируемых пароходом с предустановленной температуры настройки, такие как пищевой пароход.
4. Нагрейте коммерчески доступный раствор извлечения антигена, содержащий Tris и EDTA (pH No 9) до 95-97 градусов по Цельсию на контролируемой температурой горячей пластине с постоянным перемешиванием. Убедитесь, что он не кипит.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен стать облачным, как только он нагревается.
5. Налейте нагретый раствор извлечения антигена в слайд-контейнер и поместите контейнер в камеру парохода. Разрешить антигена извлечения раствор уравновесить до температуры парохода в течение 3-4 мин. Убедитесь, что температура камеры составляет 95 градусов по Цельсию.
6. Погрузите горки полностью в нагретый антиген извлечения раствора и продолжить применение внешнего нагрева через пароход в течение 20 минут.
7. Снимите слайд-контейнер с парохода и дайте слайдам и раствору поиска антигена охладиться до RT. Храните разбавленный антиген поисковый раствор при 4 градусах Цельсия и при необходимости повторно используйте до 2x.
8. Вымойте слайды 3x с TBST в течение 5 минут.

3. Закалка иммуномаркировки и аутофлуоресценции

ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 подробно описывается состав блокирующих буферов, используемых в следующих шагах.

1. Инкубировать разделы в Блокирование буфера 1 для 2 ч на RT под нежным качания (30-50 об /1/ т. д.). Печать с парафина пленки, чтобы избежать сушки.
2. Без мытья, немедленно применять 100 л разбавленного кролика поликлонального античеловеческого цитруллинированного гистонhtone H3 (citH3) антитела (0,03 мг/мл разбавленных в блокирующем буфере 1) непосредственно на слайд.
3. Поместите крышку (24 мм х 40 мм х 0,13-0,17 мм) на каждом участке, чтобы позволить равномерное распределение смеси антител.
4. Инкубировать 12-16 ч при 4 градусах Цельсия с нежным раскачиванием (30-50 об/мин). Печать с парафильмом пленки, чтобы избежать сушки.
5. Вымойте 3x с TBST в течение 5 мин.
6. Применить 100 зл козы анти-кролик антитела спряженные Alexa Fluor 488 (разбавленный до конечной концентрации 0,04 мг/мл или 1:50 в блокирование буфера 1), как описано в шаге 3.3. Инкубировать 1 ч на RT под нежным раскачиванием (30-50 об/мин). Защитите слайды от света.
7. Вымойте tBST 3x в течение 5 мин.
8. Инкубировать разделы в Блокирование буфера 2 ночь на 4 кВ под нежным качания (30-50 об /ч). Защитите от света.
9. Вымойте tBST 3x в течение 5 мин.
10. Блок разделов в Блокирование буфер амп 3, как описано в шаге 3.3 на RT для 2 ч под нежным качания (30-50 об / мин).
11. Инкубировать разделы с биотинилатами поликлональных антитела NE кролика кролика (окончательная концентрация 0,2 мкг/мл в Блокирующий буфер 3) при 4 КК для 12-16 ч, как описано в шагах 3,2-3,4.
12. Вымойте tBST 3x в течение 5 мин.
13. Инкубировать с Alexa Fluor 594 стрептавидин конъюгировать (разбавить до 1:100 или 0,02 мг/мл в блокирующий буфер 3), как описано в шагах 3.2-3.3 для 1 ч на RT. Защитите от света и печать с парафином для предотвращения сушки.
14. Вымойте tBST 1x в течение 5 мин.
15. Нанесите 100 л раствора автофлюоресценции непосредственно на секции в течение 1 мин в соответствии с инструкциями производителя.
16. Немедленно мыть слайды с TBST 6x в течение 10 минут.
17. Обложка каждого слайда с 100 злиц 300 нм DAPI в течение 5 минут в темноте.
18. Вымойте с TBST в течение 3 мин. Повторите это в общей сложности 5x.
19. Нанесите каплю (50 евро) антифадейской среды крепления, часть комплекта самоуточения автофлюоресценции, прямо на стеклянную горку, окружающую секцию. Поместите крышку (24 мм х 40 мм х 0,13-0,17 мм) осторожно на секцию, не создавая пузырьков.
20. Разрешить образцы для лечения на ночь в темноте при 4 градусах Цельсия, пока монтаж наяней не затвердеет для микроскопического анализа с линзами погружения.

4. Идентификация нейтрофилов внеклеточной ловушки

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол использует перевернутый эпифлюоресцентный микроскоп с цифровой камерой CCD 1280 x 960 (см. Таблица материалов).

1. Чтобы найти тромби, скан черепно-сканно каудально по длине аорты, аортальной бифуркации, и каждая бедренная артерия с помощью фазовой контрастной микроскопии с целью 10x. Тромб представляет собой конгломерат тканей, содержащих эритроциты, белые кровяные тельца и тромбоциты, прилегающие к эндотелию на фазовом контрасте и яркой полевой микроскопии(рисунок 2A, Рисунок 2B).
2. Первый изучить разделы для NETs с использованием канала DAPI (возбуждение 357/44 нм) с 10x и 20x целей(рисунок 2C). Обратите внимание, что cfDNA появляется как деконденсированная ДНК, которая не находится в пределах цитоплазмы клетки, когда его видят на фазовом контрасте или яркой полевой микроскопии.
3. Определите внеклеточный NE и citH3 на Техасских красных каналах (возбуждение 585/29 нм, эмиссия 628/32 нм) и зеленый флуоресцентный протеиновый канал (возбуждение 470/22 нм, эмиссия 525/50 нм), соответственно, с 10, 20 и 40x целями.
4. Оценить и проанализировать NET s внутри thrombus используя имеющееся програмное обеспечение, such as Изображение J (NIH). NET образование определяется на основе колокализации cfDNA, внеклеточного citH3, и NE, как ранее описано¹⁸. Поддержание последовательного времени экспозиции и выгоды каждого канала на протяжении всего приобретения изображений, чтобы избежать насыщения в интенсивности пикселей.
5. Карта каждого тромба на основе его близости к нисходящей аорты, разделив его на три равные зоны, с зоной 1 ближе к аорте, Зона 3 дальше от аорты, и Зона 2 между зонами 1 и 3). С оператором ослепленным к медицинскому состоянию каждого предмета, примите по крайней мере 10 случайных полей в каждой зоне. Характеризуйте распределение NET в тромби путем усреднения количества полей с NET в каждой зоне или расчета средней зоны, занимающей NET в каждой зоне.

Результаты

Используя этот протокол для депарафинизации, теплового антигена поиска, и двойной иммуномаркировки парафина встроенных тромбов, мы определили NETs в кошачьих CATE в первый раз. Тромби в аортальной бифуркации были обнаружены флуоресценцией микроскопии и яркой полевой микроскопией с испол...

Обсуждение

Мы описываем протокол для выявления NETs в фиксированной кошачьей кардиогенных тромбов с помощью двойного протокола иммуномаркировки и иммунофлуоресценции микроскопии. Хотя только кардиогенные артериальные тромбы были окрашены, в теории этот протокол может быть использован для други...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate	ThermoFisher Scientific	Catalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
EVOS FL Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific	AMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10x	ThermoFisher Scientific	AMEP4681	NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20x	ThermoFisher Scientific	AMEP4682	NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40x	ThermoFisher Scientific	AMEP4699	NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	ThermoFisher Scientific	Catalog # A32723
Goat serum	Jackson Immuno Research Labs	Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibody	Bioss Antibodies	Bs-6982R-Biotin	Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40	Pierce	Product # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slides	Thomas Scientific	Manufacturer No. 1354W-72
Rabbit serum	Life Technology	Catalog # 10510
Target Retrieval Solution	Agilent Dako	S2367	TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit	Vector Laboratories	SP-8400