Optimización del cultivo organoide renal y organatípico para la vascularización, el desarrollo extendido y la imagen mejorada de microscopía

Resumen

Este trabajo describe dos métodos para estudiar el desarrollo de órganos, una mejor configuración de xenotrasplante en la membrana corioalantoica (CAM) a partir de embriones aviares que permite la vascularización de órganos embrionarios y organoides cultivados y una nueva dirección z fija método de cultivo de órganos con condiciones experimentales modificadas que permite imágenes confocales de lapso de tiempo de alta resolución.

Resumen

Los cultivos organotípicos renales embrionarios, y especialmente los organoides renales derivados de células madre pluripotentes, son excelentes herramientas para seguir los procesos de desarrollo y modelar la enfermedad renal. Sin embargo, los modelos están limitados por la falta de vascularización y funcionalidad. Para abordar esto, se desarrolló un protocolo mejorado para el método de xenografting células y tejidos a la membrana corioalantoica (CAM) de un embrión aviar para obtener vascularización y restauración del flujo sanguíneo. Los injertos están superpuestos con minidepósitos hechos a medida que fijan las muestras al CAM y les suministran un medio de cultivo que protege los injertos del secado. El método de cultivo mejorado permite que los xenoinjertos crezcan hasta 9 días. El manuscrito también describe cómo proporcionar condiciones óptimas para la toma de imágenes confocales a largo plazo de organoides renales y cultivos organotípicos utilizando el método de dirección Z fija (FiZD) publicado anteriormente. Este método comprime suavemente un órgano embrionario o un organoide entre un revestimiento de vidrio y una membrana en una gran cantidad de medio y proporciona excelentes condiciones para la toma de imágenes durante un máximo de 12 días. Juntos, estos métodos permiten la vascularización y el flujo sanguíneo a organoides renales y cultivos renales organotípicos con imágenes confocales mejoradas. Los métodos descritos aquí son altamente beneficiosos para el estudio de las funciones fundamentales y aplicadas de los riñones ex vivo. Ambos métodos son aplicables a varios tipos de tejidos y organoides.

Introducción

El cultivo organotípico de los riñones embrionarios se convirtió en un modelo importante para estudiar la nefrogénesis hace décadas^1,2,3. Los organoides renales representan un sistema modelo avanzado para el desarrollo de riñones sanos y enfermos^4. El principal inconveniente para ambos métodos, sin embargo, es que ninguno de los dos métodos recapitula la función principal del riñón: la filtración de sangre. Las nefronas y la vasculatura renal se desarrollan en organoides renales y cultivos organotípicos de forma similar al desarrollo in vivo en etapa temprana; sin embargo, los glomérulos formados in vitro permanecen avasculares^5. La vascularización de los riñones embrionarios ex vivo y los organoides renales se demostró previamente en experimentos de trasplante solo en condiciones in vivo. Por ejemplo, el trasplante de organoides renales pluripotentes derivados de células madre humanas bajo una cápsula renal de ratón permite el desarrollo de las nefronas en el organoide a una etapa funcional^6.

Un enfoque intermedio entre cultivos puramente in vitro y métodos de trasplante in vivo es el xenotrasplante a la CAM de embriones aviares. La vascularización de la primordia renal intacta se ha demostrado previamente utilizando este sistema^7,8. Sin embargo, también se demostró que la vasculatura renal en el riñón murino xenotransplanted se deriva del endotelio huésped, no del injerto^9. Esta observación redujo significativamente el potencial de los modelos quiméricos (aviares-mamíferos) de riñón embrionario para estudiar el desarrollo de la vasculatura renal, porque las condiciones experimentales no eran permisivas para la supervivencia de las células endoteliales derivadas de donantes.

En la primera parte de este protocolo se presenta un método mejorado para el cultivo de riñones embrionarios de ratón en CAM de huevos aviares, combinando condiciones microambientales de cultivo organotípico y xenotrasplante. La principal mejora de los métodos anteriores es que en lugar de colocar los riñones embrionarios de ratón y los organoides renales directamente en el CAM, el área de implantación se superpone con minidepósitos permeables llenos de medio de cultivo que suministran el tejido trasplantado con nutrientes y protegerlo del secado. La tasa de éxito de los experimentos aumenta significativamente y las condiciones para el desarrollo de la vasculatura derivada de donantes mejoran. La aplicación de este método a los cultivos xenotrasplantes da como resultado el desarrollo de vasculatura glomerular compuesta por células endoteliales endógenas de los riñones de los donantes.

El análisis detallado de la morfogénesis celular es otra aplicación importante de los modelos de cultivo renal. Los métodos notificados anteriormente de adquisición de imágenes de lapso de tiempo de cultivos renales son suficientes sólo para el análisis de la morfología general y el patrón del riñón embrionario, pero no para el seguimiento de células individuales^10. Recientemente, se describió¹¹un nuevo método de Dirección Z Fija (FiZD) destinado a la toma de imágenes de lapso de tiempo 3D confocales de alta resolución de organoides renales y cultivos organotípicos organotípicos. En este método, los organoides y los órganos embrionarios se comprimen suavemente entre un tapón de vidrio y una membrana permeable de un inserto transpoente en una placa diseñada a medida hasta que el espesor de la muestra alcanza los 70 m, proporcionando condiciones ópticas óptimas para la toma de imágenes. En la segunda parte de los métodos, se describe un protocolo detallado para la fabricación de una placa diseñada a medida y la configuración de experimentos FiZD para imágenes organoides a largo plazo.

Protocolo

El cuidado y los procedimientos de los animales se ajustaron a la legislación nacional finlandesa para el uso de animales de laboratorio, al Convenio Europeo para la protección de los animales vertebrados utilizados con fines experimentales y otros fines científicos (ETS 123) y a la Directiva 86/609/CEE de la UE.

1. Fabricación de minidepósitos para el cultivo de riñones embrionarios de ratón y organoides renales en CAM de pollo y la creación de experimentos de xenotrasplante

1. Utilice plaquitas de cultivo de células transwell diseñadas para 6 placas de pozo o 12 pocillos.
   NOTA: Dependiendo del experimento en particular, se pueden utilizar minidepósitos grandes o pequeños. Lo mejor es utilizar pequeños minidepósitos para xenografting hasta ocho riñones embrionarios o cuando se colocarán varios minidepósitos en el mismo embrión de pollo (por ejemplo, muestras de experimento y control en el mismo CAM de pollo).
2. Corte los lados de las plaquitas utilizando una multiherramienta giratoria con una hoja de sierra circular o una sierra de mano para crear un anillo de plástico de 2 mm de alto con una membrana permeable unida a ella.
3. Pulir los bordes de estos minidepósitos con un bisturí o un cuchillo afilado.
4. Esterilice los minidepósitos en etanol al 70% durante al menos 1 h.
5. Lave los minidepósitos en agua autoclave de doble destilación y déjelos secar en una campana laminar.
6. Enjuague los minidepósitos en PBS y medio de cultivo (DMEM de alta glucosa/10% FBS/1% penicilina-estreptomicina).
7. Coloque el depósito en una placa de Petri, encima de una gota (600 l/400 l) de medio de cultivo con la membrana hacia arriba.
8. Organizar los riñones embrionarios ex vivo diseccionados o organoides renales uniformemente en la membrana con la ayuda de una pipeta o un tubo capilar de vidrio. Evite dejar mucho líquido alrededor de los riñones.
9. Dejar que las muestras se adhieran a la membrana durante 2-24 h en una incubadora de cultivo celular a 37 oC y 5% CO₂.
   NOTA: Se pueden organizar hasta ocho riñones de ratón embrionarios E11.5 o organoides renales en el pequeño inserto. El inserto grande se recomienda si se utilizarán trozos más grandes de tejido embrionario para el xenotrasplante o una mezcla de células y hidrogeles en un área más grande de la CAM.
10. Tome pollos embrionarios cultivados ex ovo de 8 días de edad preparados de acuerdo con métodos publicados previamente de la incubadora de cultivo celular^12,13.
11. Transfiera los minidepósitos al CAM para que los injertos estén frente al CAM, y la membrana los superponga. Coloque los minidepósitos en la periferia de la CAM, para que no cubran el embrión de pollo.
    NOTA: Cuando se utilizan los minidepósitos más pequeños fabricados a partir de plaquitas transwell para 12 placas de pozo, se pueden colocar hasta tres minidepósitos en un CAM.
12. Añadir 500 l (6 plaquitas de pozo) o 300 l (12 plaquitas de pozo) de medio de cultivo a los minidepósitos.
13. Cultivar las muestras en pollo CAM durante un máximo de 9 días. Sustituya diariamente el medio de cultivo en los minidepósitos.
    NOTA: La vascularización de las muestras se puede observar tan pronto como 24–48 h después del trasplante.

2. Fabricación de placas diseñadas a medida y configuración de cultivos FiZD

1. Taladre agujeros de 20 mm de diámetro en la parte inferior de una placa de 6 pozos.
   NOTA: Para experimentos FiZD, utilice 6 placas de pozo con una profundidad de pozo de 16 mm (especificada en Tabla de materiales).
2. Pulir las llantas de los agujeros (especialmente en la parte superior) utilizando un taladro eléctrico con una broca de avellanado, un bisturí o un cuchillo afilado.
3. Esterilice las placas en 70% de etanol durante al menos 1 h.
4. Lave las placas en agua autoclave de doble destilación y déjelas secar en condiciones estériles.
5. Lavar a fondo los revestimientos de vidrio de 22 mm x 22 mm con 70% de etanol o limpiarlos de acuerdo con el protocolo publicado por Saarela et al.¹¹.
6. Pegue los cubreobjetos en la parte superior de los agujeros en 6 placas de pozo utilizando un pegamento de tejido no tóxico. Aplique pegamento alrededor del orificio y coloque suavemente el cubreobjetos para cubrirlo. Deje que el pegamento se seque.
7. Inspeccione las placas bajo un estereomicroscopio y retire el exceso de pegamento seco de la superficie de los labios de las cubiertas si es necesario.
   NOTA: Compruebe que no haya pegamento por encima de la cubierta para garantizar una compresión uniforme de las muestras.
8. Mezclar perlas de poliestireno (tamaño de partícula de 70 m) con un volumen igual de hidrogel. Un volumen de 50–100 l por pocto es suficiente.
   NOTA: Mantenga la mezcla de hilagey y perlas de poliestireno en hielo.
9. Coloque un inserto transwell bajo un microscopio de disección con la membrana hacia arriba.
10. Organizar las muestras (p. ej., riñones embrionarios ex vivo o organoides renales) uniformemente en la membrana.
11. Agregue cuidadosamente la mezcla de perlas de hidrogel/poliestireno junto a las muestras para evitar daños en tejidos frágiles.
12. Voltear el inserto transwell para que la membrana con las muestras ensambladas en ella esté mirando hacia abajo.
13. Coloque suavemente el inserto en un pozo de la placa de 6 pocillos modificada y presione suavemente hacia abajo para que las muestras se compriman al nivel de las cuentas.
    NOTA: Siga el progreso de la compresión utilizando un microscopio.
14. Mantenga la plaquita ligeramente prensada al pozo con una mano y fíjela a la placa fundiendo plástico con un soldador en tres puntos en la periferia de la plaquita.
15. Cuando la plaquita esté fijada a la placa, añada 2 ml de medio de cultivo (DMEM/10% FBS/1% penicilina-estreptomicina) al pozo y continúe montando los pozos restantes en la placa de la misma manera.
16. Transfiera la placa terminada a una incubadora en el escenario de un microscopio invertido para obtener imágenes de lapso de tiempo.
17. Realice imágenes de lapso de tiempo de las muestras utilizando los ajustes experimentales adecuados.
    NOTA: No es necesario cambiar el medio de cultivo en los pocillos de la placa durante los experimentos de lapso de tiempo, pero se puede hacer fácilmente a través de los orificios en los lados de la plaquita.

Resultados

El protocolo de cultivo CAM presentado aquí permitió la vascularización altamente eficiente de organoides renales y riñones embrionarios como resultado del xenotrasplante en el pollo CAM(Figura 1, Película 1). Los minidepósitos que contenían un medio de cultivo suministraban nutrientes al tejido del donante y lo protegían del secado durante el período anterior a la vascularización adecuada. Este método proporcionó condiciones permisivas para que las células endo...

Discusión

Se presentan dos protocolos detallados que refinan el método clásico de cultivo organotípico renal y permiten la vascularización, el desarrollo prolongado y la imagen y el tiempo óptimos en 4D (es decir, imagen 3D y tiempo) de riñones embrionarios ex vivo y organoides. Esta sección resalta los pasos críticos en los métodos y discute la solución de problemas.

La diferencia significativa entre otros métodos de cultivo CAM y este método de cultivo CAM de pollo mejorado es el uso de mi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610