Optimisation de la culture rénale organoïde et organotypique pour la vascularisation, le développement prolongé et l’imagerie améliorée de microscopie

Résumé

Ce travail décrit deux méthodes pour étudier le développement d’organes, une configuration améliorée de xénotransplantation sur la membrane chorioallantoïque (CAM) des embryons aviaires qui permet la vascularisation des organes embryonnaires et des organoïdes cultivés et une nouvelle z-direction fixe méthode de culture d’organe avec des conditions expérimentales modifiées qui permet l’imagerie confocale de time-lapse à haute résolution.

Résumé

Les cultures organotypiques rénales embryonnaires, et en particulier les organoïdes rénaux pluripotents dérivés de cellules souches, sont d’excellents outils pour suivre les processus développementaux et modéliser les maladies rénales. Cependant, les modèles sont limités par un manque de vascularisation et de fonctionnalité. Pour remédier à cela, un protocole amélioré pour la méthode des cellules et des tissus de xenografting à la membrane chorioallantoïque (CAM) d’un embryon aviaire pour gagner la vascularisation et la restauration du flux sanguin a été développé. Les greffes sont recouvertes de minireservoirs sur mesure qui réparent les échantillons à la CAM et leur fournissent un milieu de culture qui protège les greffes du séchage. La méthode de culture améliorée permet aux xénogreffes de croître jusqu’à 9 jours. Le manuscrit décrit également comment fournir des conditions optimales pour l’imagerie confocale à long terme des organoïdes rénaux et des cultures organotypiques en utilisant la méthode précédemment publiée Fixed Z-Direction (FiZD). Cette méthode comprime doucement un organe embryonnaire ou un organoïde entre un housse de verre et une membrane dans une grande quantité de milieu et fournit d’excellentes conditions pour l’imagerie pendant jusqu’à 12 jours. Ensemble, ces méthodes permettent la vascularisation et le flux sanguin vers les organoïdes rénaux et les cultures rénales organotypiques avec l’imagerie confocale améliorée. Les méthodes décrites ici sont très bénéfiques pour étudier les fonctions fondamentales et appliquées des reins ex vivo. Les deux méthodes s’appliquent à divers types de tissus et d’organoïdes.

Introduction

La culture organotypique des reins embryonnaires est devenue un modèle important pour étudier la néphrogenèse il y a des décennies^1,2,3. Les organoïdes rénaux représentent un système modèle avancé pour étudier le développement des reins sains et malades⁴. Le principal inconvénient pour les deux méthodes, cependant, est que ni l’une ni l’autre méthode ne récapitule la fonction principale du rein: la filtration sanguine. Les néphrons et la vascularisation rénale se développent dans les organoïdes rénaux et les cultures organotypiques de la même façon qu’au développement in vivo à un stade précoce; cependant, le glomeruli formé in vitro restent avascular⁵. La vascularisation des reins embryonnaires ex vivo et des organoïdes rénaux a été précédemment démontrée dans des expériences de transplantation seulement dans des conditions in vivo. Par exemple, la transplantation d’organoïdes rénals pluripotents humains dérivés de cellules souches sous une capsule rénale de souris permet le développement des néphrons dans l’organoïde à un stade fonctionnel^6.

Une approche intermédiaire entre les cultures purement in vitro et les méthodes de transplantation in vivo est la xénotransplantation à l’ACM des embryons aviaires. La vascularisation de la primordia rénale de souris intacte a été démontrée précédemment utilisant ce système^7,8. Cependant, il a également été démontré que la vascularisation rénale dans le rein murin xénotransplanted a été dérivée de l’endothélium hôte, et non de la greffe⁹. Cette observation a réduit de manière significative le potentiel des modèles chimériques (mammifères aviaires) du rein embryonnaire pour étudier le développement de la vascularisation rénale, parce que les conditions expérimentales étaient non permémissives pour la survie des cellules endothéliales de donneur-dérivé.

Présenté dans la première partie de ce protocole est une méthode améliorée pour la culture des reins embryonnaires de souris sur CAM des oeufs aviaires, combinant des conditions microenvironmentales de la culture organotypic et la xénotransplantation. La principale amélioration des méthodes précédentes est qu’au lieu de placer les reins embryonnaires de souris et les organoïdes rénaux directement sur le CAM, la zone d’implantation est recouverte de minireservoirs perméables remplis de milieu de culture qui fournissent le tissu transplanté avec des nutriments et le protéger contre le séchage. Le taux de réussite des expériences augmente considérablement et les conditions de développement de la vascularisation dérivée du donateur s’améliorent. L’application de cette méthode aux cultures xénotransplantes entraîne le développement de la vascularisation glomerulaire composée des cellules endogènes endothéliales des reins de donneur.

L’analyse détaillée de la morphogenèse cellulaire est une autre application importante des modèles de culture rénale. Les méthodes précédemment rapportées d’acquisition d’image en time-lapse des cultures rénales ne sont suffisantes que pour l’analyse de la morphologie globale et le modelage des reins embryonnaires, mais pas pour le suivi des cellules individuelles¹⁰. Récemment, une nouvelle méthode fixe Z-Direction (FiZD) visant à la formation à temps 3D confocale haute résolution des organoïdes rénaux et des cultures organotypiques a été décrite¹¹. Dans cette méthode, les organoïdes et les organes embryonnaires sont doucement comprimés entre un housse en verre et une membrane perméable d’un insert transwell dans une plaque conçue sur mesure jusqu’à ce que l’épaisseur de l’échantillon atteigne 70 m, offrant des conditions optiques optimales pour l’imagerie. Dans la deuxième partie des méthodes, un protocole détaillé pour la fabrication d’une plaque conçue sur mesure et la configuration d’expériences FiZD pour l’imagerie organoïde à long terme est décrit.

Protocole

Les soins et procédures des animaux étaient conformes à la législation nationale finlandaise pour l’utilisation d’animaux de laboratoire, à la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et autres scientifiques (ETS 123) et à la directive 86/609/CEE de l’UE.

1. Fabrication de minireservoirs pour la culture de reins embryonnaires de souris et d’organoïdes rénaux sur le poulet CAM et mise en place d’expériences de xénotransplantation

1. Utilisez des inserts de culture cellulaire transwell conçus pour 6 plaques de puits ou 12.
   REMARQUE : Selon l’expérience particulière, de grands ou de petits minireservoirs peuvent être utilisés. Il est préférable d’utiliser de petits minireservoirs pour le xenografting jusqu’à huit reins embryonnaires ou lorsque plusieurs minireservoirs seront placés sur le même embryon de poulet (p. ex., des échantillons d’expérience et de contrôle sur le même MCA de poulet).
2. Couper les côtés des inserts à l’aide d’un multi-courant rotatif avec une lame de scie circulaire ou une scie à main pour créer un anneau en plastique de 2 mm de haut avec une membrane perméable attachée à elle.
3. Polonais les bords de ces minireservoirs avec un scalpel ou un couteau pointu.
4. Stériliser les minireservoirs dans 70% d’éthanol pour au moins 1 h.
5. Laver les minireservoirs dans de l’eau autoclaved à double distillation et les laisser sécher dans une hotte laminar.
6. Rincez les minireservoirs en PBS et milieu de culture (haute teneur en glucose DMEM/10% FBS/1% pénicilline-streptomycine).
7. Placer le réservoir dans un plat Petri, au-dessus d’une goutte (600 L/400 l) de milieu de culture avec la membrane face vers le haut.
8. Disposer les reins embryonnaires ex vivo disséqués ou les organoïdes rénaux uniformément sur la membrane à l’aide d’une pipette ou d’un tube capillaire en verre. Évitez de laisser beaucoup de liquide autour des reins.
9. Laissez les échantillons se fixer à la membrane pendant 2 à 24 h dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5% de CO₂.
   REMARQUE : Jusqu’à huit reins de souris embryonnaires ou organoïdes de rein d’E11.5 peuvent être disposés sur le petit insert. Le grand insert est recommandé si soit de plus gros morceaux de tissu embryonnaire seront utilisés pour le xénotransplant ou un mélange de cellules-hydrogel sur une plus grande surface de la CAM.
10. Prenez 8-day-old ex ovo cultivé poulets embryonnaires préparés selon les méthodes publiées précédemment de l’incubateur de culture cellulaire^12,13.
11. Transférer les minireservoirs au CAM afin que les greffes soient face au CAM, et la membrane les recouvre. Placez les minireservoirs à la périphérie de l’ACM, afin qu’ils ne couvrent pas l’embryon de poulet.
    REMARQUE : Lors de l’utilisation des minireservoirs plus petits fabriqués à partir d’inserts transwell pour 12 plaques de puits, jusqu’à trois minireservoirs peuvent être placés sur un CAM.
12. Ajouter 500 L (6 insert de puits) ou 300 L (12 insert de puits) de milieu de culture aux minireservoirs.
13. Cultiver les échantillons sur le poulet CAM pendant un maximum de 9 jours. Remplacer le milieu de culture dans les minireservoirs tous les jours.
    REMARQUE : La vascularisation des échantillons peut être observée dès 24-48 h après la transplantation.

2. Fabrication de plaques conçues sur mesure et mise en place de cultures FiZD

1. Percer des trous de 20 mm de diamètre dans le fond d’une plaque de 6 puits.
   REMARQUE : Pour les expériences FiZD, utilisez 6 plaques de puits avec une profondeur de puits de 16 mm (spécifiée dans le tableau des matériaux).
2. Polonais les jantes des trous (en particulier sur le côté supérieur) à l’aide d’une perceuse électrique avec un bit de perceuse à vis- à effet de compteur, d’un scalpel ou d’un couteau tranchant.
3. Stériliser les plaques dans 70% d’éthanol pendant au moins 1 h.
4. Laver les assiettes dans de l’eau autoclaved à double distillation et les laisser sécher dans des conditions stériles.
5. Laver complètement les couvertures en verre de 22 mm x 22 mm avec 70 % d’éthanol ou les nettoyer selon le protocole publié par Saarela et al.¹¹.
6. Collez les couvertures sur le côté supérieur des trous dans 6 plaques de puits à l’aide d’une colle de tissu non toxique. Appliquer de la colle autour du trou et placer délicatement le coverlip pour le couvrir. Laisser sécher la colle.
7. Inspectez les plaques sous un stéréomicroscope et retirez l’excès de colle séchée de la surface des coverlips si nécessaire.
   REMARQUE : Vérifiez qu’il n’y a pas de colle au-dessus du coverlip pour assurer même la compression des échantillons.
8. Mélanger les perles de polystyrène (70 m de taille de particules) avec un volume égal d’hydrogel. Un volume de 50 à 100 ll par puits est suffisant.
   REMARQUE : Gardez le mélange de perles d’hydrogel et de polystyrène sur la glace.
9. Placer un insert transwell sous un microscope disséquant avec la membrane vers le haut.
10. Disposer les échantillons (p. ex., reins embryonnaires ex vivo ou organoïdes rénaux) uniformément sur la membrane.
11. Ajouter le mélange de perles d’hydrogel/polystyrène à côté des échantillons soigneusement pour éviter des dommages aux tissus fragiles.
12. Retourner l’insert transwell de sorte que la membrane avec les échantillons assemblés sur elle est orientée vers le bas.
13. Placez doucement l’insert dans un puits de la plaque de puits modifiée de 6 et appuyez doucement vers le bas afin que les échantillons soient comprimés au niveau des perles.
    REMARQUE : Suivez l’évolution de la compression à l’aide d’un microscope.
14. Gardez l’insert légèrement pressé au puits avec une main et fixez-le à la plaque en faisant fondre le plastique avec un fer à souder à trois points à la périphérie de l’insert.
15. Lorsque l’insert est fixé à la plaque, ajouter 2 ml de milieu de culture (DMEM/10% FBS/1% pénicilline-streptomycine) au puits et continuer à assembler les puits restants dans la plaque de la même manière.
16. Transférer la plaque finie dans un incubateur sur scène d’un microscope inversé pour l’imagerie par time-lapse.
17. Effectuez l’imagerie en accéléré des échantillons à l’aide de paramètres expérimentaux appropriés.
    REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de changer le milieu de culture dans les puits de la plaque pendant les expériences en time-lapse, mais il peut être facilement fait à travers les trous sur les côtés de l’insert.

Résultats

Le protocole de culture CAM présenté ici a permis une vascularisation très efficace des organoïdes rénaux et des reins embryonnaires à la suite de la xénotransplantation sur le poulet CAM(figure 1, Film 1). Les minireservoirs contenant le milieu de culture fournissaient des éléments nutritifs au tissu de distributeur et les protégeaient du séchage pendant la période précédant la vascularisation appropriée. Cette méthode a fourni des conditions permissives pou...

Discussion

Deux protocoles détaillés sont présentés qui affinent la méthode classique de culture organotypique rénale, et permettent la vascularisation, le développement prolongé, et l’imagerie optimale 4D (c.-à-d. image et temps 3D) des reins embryonnaires ex vivo et des organoïdes. Cette section met en évidence les étapes critiques des méthodes et traite du dépannage.

La différence significative entre d’autres méthodes de culture DE CAM et cette méthode améliorée de culture de CA...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610