血管化、拡張開発、および顕微鏡イメージングの改善のための腎オルガノイドおよびオルガノイド培養の最適化

要約

この研究は、臓器の発達を研究するための2つの方法、培養胚器官およびオルガノイドの血管化を可能にする鳥類胚からの絨毛球膜(CAM)の改善された異種移植セットアップと、新しい固定z方向を説明する。高解像時間経過共焦点イメージングを可能にする改変実験条件を有する臓器培養法。

要約

胚性腎臓の有機的培養、特に多能性幹細胞由来の腎臓オルガノイドは、発達過程および腎臓病のモデリングに優れたツールである。しかし、モデルは血管化と機能性の欠如によって制限されています。これに対処するために、血液の血管化と回復を得るために鳥の胚の絨毛管内膜(CAM)に細胞および組織を異種移植する方法のための改良されたプロトコルが開発された。移植片はCAMにサンプルを固定し、乾燥から移植片を保護する培養媒体とそれらを供給するカスタムメイドのミニ貯蔵所と重ねられる。改善された培養法により、異種移植片は最大9日間増殖する。また、この原稿は、以前に発表された固定Z方向(FiZD)法を用いて、腎オルガノイドおよび有機的培養物の長期的な共焦点イメージングに最適な条件を提供する方法についても説明しています。この方法は、ガラスカバースリップと膜の間の胚器官またはオルガノイドを大量の媒体で穏やかに圧縮し、最大12日間のイメージングに優れた条件を提供します。これらの方法は、共焦点イメージングを改善した腎オルガノイドおよび有機的な腎臓培養物への血管化および血流を可能にする。ここに記載されている方法は、腎臓ex vivoの基本的および応用機能を研究するために非常に有益である。どちらの方法も、様々なタイプの組織やオルガノイドに適用可能です。

概要

胚性腎臓のオルガノーチ培養は、数十年前^2、2、3年前に腎生年月¹日を研究する重要なモデルとなった。^,3腎オルガノイドは、健康で病気の腎臓の発達を研究するための高度なモデルシステムを表す⁴.しかし、両方の方法の主な欠点は、どちらの方法も腎臓の主な機能である血液濾過を再現していないということです。腎血管系と腎血管系は、生体内開発の初期段階と同様に、腎オルガノイドおよび有機的培養で発達する。しかし、体外で形成された糸球体^は血管5のままである。元生体胚性腎臓および腎組織性の血管化は、インビボ条件下でのみ移植実験において以前に実証された。例えば、マウス腎臓カプセルの下でヒト多能性幹細胞由来の腎オルガノイドを移植することにより、機能ステージ6へのオルガノイド中のネフロンの開発が可能^になる。

純粋にインビトロ培養と生体内移植方法の中間的アプローチは、鳥類胚のCAMへの異種移植である。インタクトマウス腎臓原始の血管化は、このシステム^77,88を用いて以前に実証されている。しかしながら、異種移植されたマウス腎臓における腎脈管系は、移植片⁹ではなく宿主内皮由来であったことも示された。この観察は、ドナー由来の内皮細胞の生存のために実験条件が非透過性であったため、胚性腎臓のキメラ(鳥類哺乳類)モデルの可能性を著しく低下させ、腎臓血管系の発達を研究した。

このプロトコルの最初の部分で提示された鳥卵のCAM上のマウス胚性腎臓の培養のための改善された方法である、organotypic培養と異種移植の微小環境条件を組み合わせた。以前の方法の主な改善は、マウスの胚性腎臓と腎オルガノイドをCAMに直接置く代わりに、移植領域が移植された組織を供給する培養培地で満たされた透過性ミニリザーバーで重ね合せることである栄養素を使用し、乾燥から保護します。実験の成功率は大幅に増加し、ドナー由来血管系の発達条件は改善する。この方法を異種移植培養物に適用すると、ドナー腎臓からの内因性内皮細胞から構成される糸球体血管系の発達が生じる。

細胞形態形成の詳細な分析は、腎臓培養モデルのもう一つの重要なアプリケーションです。腎臓培養のタイムラプス画像取得の以前に報告された方法は、胚性腎臓の全体的な形態およびパターニングの分析にのみ十分であるが、個々の細胞¹⁰を追跡するためのものではない。近年、腎オルガノイドとオルガノピック培養物の高解像度共焦点共焦点3Dタイムラプスイメージングを目的とした新規固定Z方向(FiZD)法が¹¹に記載された。この方法では、オルガノイドと胚器官は、サンプルの厚さが70μmに達するまで、カスタム設計プレート内のガラスカバースリップと透過性のトランスウェルインサートの透過膜の間で穏やかに圧縮され、イメージングに最適な光学条件を提供します。方法の第2部では、カスタム設計プレートの製造と長期オルガノイドイメージングのためのFiZD実験の設定のための詳細なプロトコルが記載されている。

プロトコル

動物のケアと手順は、実験動物の使用に関するフィンランドの国内法、実験およびその他の科学的目的のために使用される脊椎動物の保護のための欧州条約(ETS 123)、およびEU指令86/609/EECに従っていました。

1. 鶏CAM上でマウス胚性腎臓及び腎オルガノイドを培養するためのミニリザーバーの製造と異種移植実験の実施

1. 6ウェルまたは12ウェルプレート用に設計されたトランスウェル細胞培養インサートを使用してください。
   注: 特定の実験に応じて、大小のミニ貯蔵所を使用できます。最大8つの胚性腎臓を異種移植したり、同じ鶏の胚に複数のミニ貯蔵所を置いたりする場合(例えば、同じ鶏CAM上の実験および制御サンプル)に小さなミニリザーバーを使用するのが最善です。
2. 円形の鋸刃または手鋸を備えた回転式マルチツールを使用して、挿入物の側面を切り取り、透過性膜が取り付けられた高さ2mmのプラスチックリングを作成します。
3. メスや鋭利なナイフでこれらのミニ貯水池の端を磨きます。
4. ミニ貯蔵器を70%エタノールで少なくとも1時間殺菌する。
5. ミニリザーバーをオートクレーブされた二重蒸留水で洗い、薄層フードで乾燥させます。
6. PBSおよび培養培地(高グルコースDMEM/10%FBS/1%ペニシリンストレプトマイシン)でミニリザーバをリンスします。
7. ペトリ皿にリザーバーを置き、膜を上に向けて培地の滴(600 μL/400 μL)の上に置きます。
8. 解剖された外生体胚性腎臓または腎オルガノイドをピペットまたはガラス毛細管の助けを借りて膜上に均等に配置する。腎臓の周りに多くの液体を残さないようにしてください。
9. サンプルを37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーターで2〜24時間膜に取り付け₂ましょう。
   注:最大8つのE11.5胚性マウス腎臓または腎臓オルガノイドは、小さなインサートに配置することができます。大きなインサートは、異種移植またはCAMのより広い領域上の細胞ヒドロゲル混合物に胚組織のより大きな部分が使用される場合に推奨される。
10. 細胞培養インキュベーター^12,13,13から以前に発表された方法に従って調製された8日間の元ovo培養胚鶏を取る。
11. ミニリザーバをCAMに移して、移植片がCAMに向き、膜がそれらをオーバーレイするようにします。ミニリザーバをCAMの周囲に置き、鶏の胚を覆わないようにします。
    注:トランスウェルインサートから製造された小型ミニリザーバを12ウェルプレートに使用する場合、最大3つのミニ貯蔵所を1つのCAMに置くことができます。
12. 500 μL (6 ウェルインサート) または 300 μL (12 ウェルインサート) の培養液をミニリザーバに加えます。
13. 最大9日間のチキンCAMでサンプルを栽培します。ミニリザーバの培養培地を毎日交換してください。
    注:サンプルの血管の血管は移植後24-48時間で観察できます。

2. カスタムデザインプレートの製作とFiZD文化の設定

1. 6ウェルプレートの底部に直径20mmの穴を開けます。
   注:FiZD 実験では、16 mm の深さ(材料表で指定)を持つ 6 つのウェルプレートを使用してください。
2. カウンターシンクドリルビット、メス、または鋭利なナイフで電気ドリルを使用して穴の縁(特に上側)を磨きます。
3. プレートを70%エタノールで少なくとも1時間殺菌する。
4. プレートをオートクレーブ二重蒸留水で洗い、無菌状態で乾燥させます。
5. 70%エタノールで22mm x 22mmガラスカバーリップを十分に洗浄するか、Saarelaらの公表されたプロトコルに従って^{きれいにしてください。}
6. 無毒なティッシュの接着剤を使用して6つの井戸の版の穴の上側にカバースリップを接着する。穴の周りに接着剤を塗布し、カバースリップをそっと置いてカバーを覆います。接着剤を乾燥させます。
7. プレートを実体顕微鏡で検査し、必要に応じてカバーリップの表面から余分な乾燥接着剤を取り除きます。
   メモ:カバースリップの上に接着剤がないことを確認して、サンプルの圧縮を確実にします。
8. ポリスチレンビーズ(70 μm粒径)を等量のヒドロゲルと混合します。ウェルあたり50~100μLの体積で十分です。
   注:ヒドロゲルとポリスチレンビーズの混合物を氷の上に保管してください。
9. トランスウェルインサートを、膜を上にして解剖顕微鏡の下に置きます。
10. サンプル(例えば、元の生体胚性腎臓または腎オルガノイド)を膜上に均等に配置する。
11. 壊れやすい組織への損傷を避けるために、サンプルの隣にヒドロゲル/ポリスチレンビーズ混合物を慎重に追加します。
12. トランスウェル挿入物を反転して、サンプルを組み立てた膜が下向きになるようにします。
13. 修正された6ウェルプレートのウェルに挿入物をそっと置き、サンプルがビーズのレベルまで圧縮されるようにそっと押し下げます。
    メモ:顕微鏡で圧縮の進行を追従してください。
14. 挿入物を片手でウェルに少し押し付け、挿入物の周囲の3点ではんだ付け鉄でプラスチックを溶かしてプレートに固定します。
15. インサートがプレートに固定されたら、2 mLの培養培地(DMEM/10%FBS/1%ペニシリンストレプトマイシン)をウェルに加え、残りのウェルをプレートに同じように組み立て続けます。
16. 完成したプレートを逆回し顕微鏡のステージ上のインキュベーターに移して、タイムラプスイメージングを行います。
17. 適切な実験設定を使用してサンプルのタイムラプスイメージングを行います。
    注:タイムラプス実験中にプレートのウェル内の培養培地を交換する必要はありませんが、挿入物の側面の穴を通して簡単に行うことができます。

結果

ここで提示されるCAM培養プロトコルは、鶏CAMの異種移植の結果として腎オルガノイドおよび胚性腎臓の高効率な血管形成を可能にした(図1、動画1)。培養培地を含むミニリザーバは、ドナー組織に栄養素を供給し、適切な血管化前の期間中に乾燥から保護した。この方法は、ドナー由来の内皮細胞が増殖するための寛容な条件を提供した。したがって、移植?...

ディスカッション

古典的な腎性素培養法を改良し、血管化、拡張開発、および最適4D(すなわち、3D画像および時間)ex vivo胚性腎臓およびオルガノイドのイメージングを可能にする2つの詳細なプロトコルが提示される。このセクションでは、この方法の重要な手順を説明し、トラブルシューティングについて説明します。

他のCAM培養法とこの改良された鶏CAM培養法との有意な違いは、CAMへの...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610