Otimização da Cultura Organóide Renal e Organotípica para Vascularização, Desenvolvimento Estendido e Imagem Microscopia Aprimorada

Resumo

Este trabalho descreve dois métodos para estudar o desenvolvimento de órgãos, uma melhor configuração de xenotransplante na membrana corioallantoica (CAM) a partir de embriões aviários que permite a vascularização de órgãos e organóides embrionários cultivados e uma nova direção fixa z método de cultura de órgãos com condições experimentais modificadas que permite imagens confocais de lapso de tempo de alta resolução.

Resumo

Culturas organotípicas de rim embrionário, e especialmente organóides renais derivados de células-tronco pluripotentes, são excelentes ferramentas para acompanhar processos de desenvolvimento e modelar doenças renais. No entanto, os modelos são limitados pela falta de vascularização e funcionalidade. Para lidar com isso, foi desenvolvido um protocolo aprimorado para o método de xenoenxerto de células e tecidos para a membrana corioallantoica (CAM) de um embrião aviário para obter vascularização e restauração do fluxo sanguíneo. Os enxertos são sobrepostos com minireservatórios feitos medida que fixam as amostras no CAM e fornecem-lhes meio de cultura que protege os enxertos da secagem. O método de cultura aprimorado permite que os xenoenxertos cresçam por até 9 dias. O manuscrito também descreve como fornecer condições ideais para imagens confocais de longo prazo de organóides renais e culturas organotípicas usando o método Fixa Z-Direction (FiZD) publicado anteriormente. Este método comprime suavemente um órgão embrionário ou organóide entre um deslizamento de vidro e membrana em uma grande quantidade de meio e fornece excelentes condições para a imagem por até 12 dias. Juntos, esses métodos permitem a vascularização e o fluxo sanguíneo para organóides renais e culturas renais organotípicas com melhor imagem confocal. Os métodos descritos aqui são altamente benéficos para o estudo de funções fundamentais e aplicadas de rins ex vivo. Ambos os métodos são aplicáveis a vários tipos de tecidos e organóides.

Introdução

A cultura organotípica dos rins embrionários tornou-se um importante modelo para estudar a nefrogênese décadas atrás^1,2,3. Organóides renais representam um sistema de modelo avançado para estudar o desenvolvimento de rins saudáveis e doentes⁴. A principal desvantagem para ambos os métodos, no entanto, é que nenhum dos métodos recapitula a função principal do rim: filtração sanguínea. Neffros e vasculatura renal desenvolvem-se em organóides renais e culturas organotípicas de forma semelhante ao estágio inicial no desenvolvimento vivo; no entanto, os glomeruli formados in vitro permanecem^{avasculares 5}. A vascularização de rins embrionários ex vivos e organóides renais foi previamente demonstrada em experimentos de transplante apenas em condições in vivo. Por exemplo, o transplante de organóides renais derivados de células-tronco pluripotentes humanas sob uma cápsula de rim de camundongos permite o desenvolvimento dos néfrons no organóide para um estágio funcional⁶.

Uma abordagem intermediária entre culturas puramente in vitro e métodos de transplante in vivo é o xenotransplante para a CAM de embriões aviários. A vascularização da primordia renal do rato intacta foi demonstrada anteriormente usando este sistema^7,8. No entanto, também foi demonstrado que a vasculatura renal no rim murina xenotransplantado foi derivada do endotélio hospedeiro, não do enxerto⁹. Esta observação reduziu significativamente o potencial de modelos quiméricos (aviários-mamíferos) de rim embrionário para estudar o desenvolvimento da vasculatura renal, porque as condições experimentais não eram permissivas para a sobrevivência de células endoteliais derivadas de doadores.

Apresentado na primeira parte deste protocolo é um método aprimorado para o cultivo de rins embrionários de camundongos em CAM de ovos aviários, combinando condições microambientais de cultura organotípica e xenotransplante. A principal melhoria dos métodos anteriores é que, em vez de colocar os rins embrionários do rato e organóides renais diretamente no CAM, a área de implantação é sobreposta com minireservatórios permeáveis cheios de meio de cultura que fornecem o tecido transplantado com nutrientes e protegê-lo da secagem. A taxa de sucesso dos experimentos aumenta significativamente e as condições para o desenvolvimento da vasculatura derivada de doadores melhoram. A aplicação deste método às culturas xenotransplanteresulta no desenvolvimento da vasculatura glomerular composta por células endógenas endógenas dos rins doadores.

A análise detalhada da morfogênese celular é outra importante aplicação de modelos de cultura renal. Os métodos previamente relatados de aquisição de imagens de lapso de tempo de culturas renais são suficientes apenas para análise da morfologia geral e padronização do rim embrionário, mas não para o rastreamento de células individuais¹⁰. Recentemente, foi descrito um novo método Fixo de Direção Z (FiZD) destinado à imagem confocal de lapso de tempo 3D de alta resolução de organóides renais e culturas organotípicas¹¹. Neste método, os organóides e órgãos embrionários são suavemente comprimidos entre uma tampa de vidro e uma membrana permeável de uma inserção transwell em uma placa projetada medida até que a espessura da amostra atinja 70 μm, proporcionando condições ópticas ideais para a imagem. Na segunda parte dos métodos, é descrito um protocolo detalhado para a fabricação de uma placa projetada medida e a configuração de experimentos FiZD para imagens organóides de longo prazo.

Protocolo

Os cuidados e procedimentos dos animais estavam de acordo com a legislação nacional finlandesa para o uso de animais de laboratório, a Convenção Europeia para a proteção de animais vertebrados utilizados para fins experimentais e outros produtos científicos (ETS 123) e a Diretiva 86/609/CEE da UE.

1. Fabricação de minireservatórios para cultivo de rins embrionários de camundongos e organóides renais em CAM de frango e criação de experimentos de xenotransplante

1. Use pastilhas de cultura de células transwell projetadas para 6 placas de poço ou 12 poços.
   NOTA: Dependendo do experimento específico, podem ser utilizados minireservatórios grandes ou pequenos. É melhor usar pequenos minireservatórios para xenoenxertar até oito rins embrionários ou quando vários minireservatórios serão colocados no mesmo embrião de frango (por exemplo, experimentar e controlar amostras no mesmo CAM de frango).
2. Corte as laterais das pastilhas usando uma multiferramenta rotativa com uma lâmina de serra circular ou uma serra de mão para criar um anel plástico de 2 mm de altura com uma membrana permeável presa a ele.
3. Polir as bordas desses minireservatórios com um bisturi ou uma faca afiada.
4. Esterilize os minireservatórios em 70% de etanol por pelo menos 1 h.
5. Lave os minireservatórios em água dupla destilada autoclaved e deixe-os secar em um capô laminar.
6. Enxágüe os minireservatórios em PBS e meio de cultura (DMEM de alta glicose/10% FBS/1% penicilina-estreptomicina).
7. Coloque o reservatório em uma placa de Petri, em cima de uma gota (600 μL/400 μL) de meio de cultura com a membrana voltada para cima.
8. Disponha rins embrionários ex vivos dissecados ou organóides renais uniformemente na membrana com a ajuda de uma pipeta ou de um tubo capilar de vidro. Evite deixar muito líquido ao redor dos rins.
9. Deixe as amostras se prenderem à membrana por 2-24 h em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% CO₂.
   NOTA: Até oito rins embrionários de camundongos e organóides embrionários E11.5 podem ser dispostos na pequena inserção. A grande inserção é recomendada se pedaços maiores de tecido embrionário serão usados para xenotransplante ou uma mistura de hidrogel celular em uma área maior do CAM.
10. Pegue galinhas embrionárias ex ovo de 8 dias preparadas de acordo com métodos publicados anteriormente da incubadora de cultura celular^12,13.
11. Transfira os minireservatórios para o CAM para que os enxertos estejam voltados para a CAM, e a membrana os sobrepõe. Coloque os minireservatórios na periferia da CAM, para que não estejam cobrindo o embrião de frango.
    NOTA: Ao utilizar os minireservatórios menores fabricados a partir de pastilhas transwell para 12 placas de poço, até três minireservatórios podem ser colocados em uma CAM.
12. Adicione 500 μL (6 inserções de poço) ou 300 μL (12 pastilhas de poço) do meio de cultura aos minireservatórios.
13. Cultive as amostras em CAM de frango por um máximo de 9 dias. Substitua o meio de cultura nos minireservatórios diariamente.
    NOTA: A vascularização das amostras pode ser observada a partir das 24 h às 48 h após o transplante.

2. Fabricação de placas personalizadas e criação de culturas FiZD

1. Furos de 20 mm de diâmetro na parte inferior de uma placa de 6 poços.
   NOTA: Para experimentos FiZD, use 6 placas de poço com uma profundidade de poço de 16 mm (especificada em Tabela de Materiais).
2. Polir as bordas dos orifícios (especialmente na parte superior) usando uma broca elétrica com uma broca de contra-pia, um bisturi ou uma faca afiada.
3. Esterilize as placas em 70% de etanol por pelo menos 1 h.
4. Lave as placas em água duplamente destilada e deixe-as secar em condições estéreis.
5. Lave completamente as tampas de vidro de 22 mm x 22 mm com 70% de etanol ou limpe-as de acordo com o protocolo publicado por Saarela et al.¹¹.
6. Cole as tampas para o lado superior dos orifícios em 6 placas de poço usando uma cola de tecido não tóxica. Aplique cola ao redor do orifício e coloque delicadamente o deslizamento de cobertura para cobri-lo. Deixe a cola secar.
7. Inspecione as placas sob um microscópio eretore e remova o excesso de cola seca da superfície das tampas, se necessário.
   NOTA: Verifique se não há cola acima do deslizamento de cobertura para garantir a compressão das amostras.
8. Misture contas de poliestireno (tamanho de partícula de 70 μm) com um volume igual de hidrogel. Um volume de 50-100 μL por poço é suficiente.
   NOTA: Mantenha a mistura de contas de hidrogel e poliestireno no gelo.
9. Coloque uma inserção transwell um microscópio dissecando com a membrana para cima.
10. Organize as amostras (por exemplo, rins embrionários ex vivos ou organóides renais) uniformemente na membrana.
11. Adicione cuidadosamente a mistura de talo hidrogel/poliestireno ao lado das amostras para evitar danos a tecidos frágeis.
12. Gire a inserção transwell para que a membrana com as amostras montadas sobre ela esteja voltada para baixo.
13. Coloque suavemente a inserção em um poço da placa de 6 poços modificada e pressione-a suavemente para baixo para que as amostras sejam compactadas ao nível das contas.
    NOTA: Acompanhe o progresso da compressão usando um microscópio.
14. Mantenha a inserção ligeiramente pressionada para o poço com uma mão e fixe-a na placa derretendo plástico com um ferro de soldar em três pontos na periferia da pastilha.
15. Quando a inserção estiver fixada na placa, adicione 2 mL de meio de cultura (DMEM/10% FBS/1% penicilina-estreptomicina) ao poço e continue montando os poços restantes na placa da mesma forma.
16. Transfira a placa acabada para uma incubadora no estágio de um microscópio invertido para imagens de lapso de tempo.
17. Realize imagens de lapso de tempo das amostras usando configurações experimentais apropriadas.
    NOTA: A mudança do meio de cultura nos poços da placa durante experimentos de lapso de tempo não é necessária, mas pode ser facilmente feita através dos orifícios nas laterais da pastilha.

Resultados

O protocolo de cultura CAM aqui apresentado possibilitou a vascularização altamente eficiente de organóides renais e rins embrionários como resultado do xenotransplante no cam de frango (Figura 1, Filme 1). Minireservatórios contendo meio saqueador forneceram nutrientes ao tecido doador e o protegeram da secagem durante o período anterior à vascularização adequada. Este método forneceu condições permissivas para o crescimento de células endoteliais derivadas de ...

Discussão

Dois protocolos detalhados são apresentados que refinam o método clássico de cultura organotípica renal, e permitem a vascularização, o desenvolvimento prolongado e a imagem 4D ideal (ou seja, imagem 3D e tempo) de imagens ex vivos embrionárias e organóides. Esta seção destaca as etapas críticas nos métodos e discute a solução de problemas.

A diferença significativa entre outros métodos de cultura CAM e este método de cultura cam de frango melhorado é o uso de minireservatór...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610