Electrocardiografía no invasiva en el ratón perinatal

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de electrocardiografía no invasiva (ECG), optimizado para ratones postnatales tempranos, que no requiere el uso de anestésicos.

Resumen

La electrocardiografía (ECG) se ha considerado durante mucho tiempo como un método eficaz y fiable para evaluar la función cardiovascular (y cardiopulmonar) tanto en modelos humanos como animales de enfermedad. La frecuencia cardíaca individual, el ritmo y la regularidad, combinados con parámetros cuantitativos recogidos del ECG, sirven para evaluar la integridad del sistema de conducción cardíaca, así como la fisiología integrada del ciclocardíaco. Este artículo proporciona una descripción completa de los métodos y técnicas utilizados para realizar un ECG no invasivo en cachorros de ratón perinatal y neonatal tan pronto como el primer día postnatal, sin necesidad de usar anestésicos. Este protocolo fue diseñado para abordar directamente la necesidad de un método estandarizado y repetible para obtener ECG en ratones recién nacidos. Desde una perspectiva traslacional, este protocolo resulta ser totalmente eficaz para la caracterización de defectos cardiopulmonares congénitos generados utilizando líneas transgénicas de ratón, y particularmente para el análisis de defectos que causan letalidad en o durante los primeros días postnatales. Este protocolo también tiene como objetivo abordar directamente una brecha en la literatura científica para caracterizar y proporcionar datos normativos asociados con la maduración del sistema de conducción cardíaca postnatal temprana. Este método no se limita a un punto de tiempo postnatal específico, sino que permite la recopilación de datos de ECG en cachorros de ratón neonatal desde el nacimiento hasta el día 10 postnatal (P10), una ventana que es de importancia crítica para modelar enfermedades humanas in vivo, con especial énfasis en la cardiopatía congénita (CHD).

Introducción

La función cardíaca se puede medir de diferentes maneras, la más común de las cuales incluye el uso de electrocardiografía (ECG) para analizar la conducción de corriente eléctrica a través del corazón, así como su ciclo cardíaco general y la función^1. La electrocardiografía sigue siendo una herramienta de diagnóstico útil para identificar y caracterizar anomalías cardíacas tanto en modelos humanos como animales de enfermedad^1,2. Las irregularidades en la lectura de un electrocardiograma se pueden encontrar en el desarrollo cardíaco anormal (es decir, enfermedad cardíaca congénita (CHD)), y pueden incluir arritmias que se manifiestan como cambios en la frecuencia cardíaca (por ejemplo, bradicardia) y el ritmo (por ejemplo, "bloqueos cardíacos"), que sugieren defectos en la integridad y/o función del miocardio subyacente. Cambios como estos pueden predisponer a los pacientes a una disfunción cardíaca potencialmente mortal (p. ej., insuficiencia cardíaca congestiva y/o paro cardíaco) y aumento de la mortalidad^3,4_. Dadas las altas tasas de mortalidad con enfermedad coronas coronarias graves y no tratadas, es fundamental desarrollar un método estandarizado y repetible para recolectar ECG durante este período posnatal temprano.

Aunque no somos los primeros en abordar este problema, los métodos previos de recogida de ECG en un cachorro de ratón han incluido tradicionalmente procedimientos invasivos (aguja subcutánea o electrodos de alambre) y /o el uso de anestésicos^5,6,7. Las ventajas de realizar análisis de ECG no invasivo incluyen minimizar el dolor y deshacer el estrés en el animal. Mientras que el experimentador todavía debe ser cauteloso acerca de causar el estrés del cachorro, el dispositivo está diseñado para evitar factores de estrés comunes con el fin de producir datos precisos. En el contexto de la evaluación de la función cardíaca, la introducción de anestesia en animales que pueden tener anomalías cardiopulmonarias podría potencialmente enmascarar o incluso exacerbar las condiciones subyacentes. Los anestésicos pueden afectar la conducción eléctrica alterando la despolarización y/o la repolarización de las células. Finalmente, el uso de anestesia puede poner al cachorro recién nacido en un mayor riesgo de hipotermia, lo que podría confundir aún más cualquier patología inherente. El siguiente protocolo no introduce anestésicos, procedimientos invasivos ni molestias pronunciadas al cachorro. Una vez finalizada la configuración del equipo, la configuración del dispositivo y la recopilación de datos que involucran al animal se pueden completar de manera eficiente, después de lo cual los cachorros pueden ser devueltos a su madre. Además, este sistema permite realizar análisis repetidos y/o en serie, lo que es ideal para experimentos que requieren análisis a lo largo del tiempo, introducción de terapias farmacológicas, etc.

Protocolo

El siguiente protocolo sigue los estándares del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nueva Inglaterra. La observación estrecha del protocolo debe proporcionar lecturas de ECG satisfactorias en todos los neonatos examinados (n > 70).

1. Preparaciones del dispositivo

1. Conecte el dispositivo al puerto USB de un ordenador con el software ECG descargado en él. El dispositivo de medición comenzará automáticamente a calentarse hasta (37 oC/98,6 oF). La unidad de calefacción interna se encuentra dentro de la unidad de medida y calienta sólo la superficie de plástico. Los electrodos de alambre de plata no se calientan.
2. Permita aproximadamente 15 minutos para que la superficie alcance la temperatura. Utilice este tiempo para reunir y configurar animales.
   NOTA: El protocolo puede estar en pausa en este punto y la plataforma puede permanecer enchufada y calentada durante un período prolongado de tiempo. En ausencia de una plataforma de electrodo autocalentamiento, también se puede utilizar una almohadilla de calentamiento segura para animales para evitar que la madre y los cachorros se vuelvan hipotérmicos.

2. Preparaciones para animales

1. Recoger la madre y los cachorros y mantener dentro de la jaula de la casa hasta que esté listo para recoger.
2. Una vez que la unidad de medición se haya calentado a la temperatura, retire el cachorro del ratón de la jaula y limpie el tórax con un 70% de etanol pulverizado en una toallita. Coloque el cachorro sobre la superficie calentada del plástico.
3. Deje que el ratón se aclimate a la superficie en la oscuridad durante aproximadamente 2-5 minutos.

3. Configuración de la plataforma del ratón y del electrodo (aplicación del electrodo)

1. Utilice una espátula de metal, sonda o espiga de madera para recoger una pequeña gota de adhesivo, gel de conducción eléctrica (un gel de electrodo de alta conductividad de secado rápido comúnmente utilizado para la colocación de electrodos de roedores).
   NOTA: Cualquier objeto sólido no sólido se puede utilizar para aplicar el gel conductor, siempre y cuando el objeto no deje fibras sintéticas o material similar en los electrodos que puedan interferir con la calidad de la señal eléctrica.
2. Usando la espátula/espiga, toque suavemente la parte superior de cada una de las cuatro superficies de electrodos aplanadas presionando suavemente hacia abajo y tirando del gel conductor en un ángulo oblicuo lejos del centro de la construcción del electrodo. Asegúrese de que cada electrodo individual esté completamente cubierto con el gel.
   ADVERTENCIA: Este paso es extremadamente importante para asegurar que el gel de electrodo conductor no se adhiera a más de un solo electrodo. Las hebras adhesivas que se forman entre electrodos pueden realizar la carga y potencialmente interferir con o acortar la señal eléctrica deseada. El protocolo no debe pausarse en este momento, ya que el gel comenzará a solidificarse y a ser adherente. Asegúrese de instalar el ratón en la plataforma dentro de 5-10 minutos después de aplicar gel conductor (o sustitución de gel de electrodo conductor equivalente).
3. Coloque la espátula de metal o la espiga de madera con el resto del gel al costado.
4. Coloque el esternón del cachorro del ratón neonatal hacia abajo y propenso con la cabeza del cachorro mirando hacia el borde USB saliente de la plataforma. Asegúrese de que una parte del pecho del cachorro esté cubriendo cada uno de los cuatro electrodos. Sujete suavemente los antebrazos del cachorro a su lado mientras mantiene pulsados simultáneamente durante aproximadamente 1 min para permitir que el gel conductor se ajuste.
5. Coloque parachoques de silicona de goma en los lados derecho e izquierdo del cachorro. Los parachoques deben asegurar el cachorro en cada lado y proporcionar estabilidad para evitar movimientos excesivos del ratón, pero NO deben impedir todo movimiento del ratón. Una vez instalado, observe el ratón por un momento y ajuste la colocación del parachoques según sea necesario.
   ADVERTENCIA: No comprima el ratón demasiado apretadamente, ya que esto puede interferir con la mecánica respiratoria y la frecuencia respiratoria.
6. Utilice la espiga que se dejó a un lado para aplicar el gel conductor restante en el electrodo de cola de puesta a tierra y colocar en la grupa del cachorro. Aplique una presión suave para permitir que el gel se ajuste antes de liberar el cachorro.
7. Coloque el parachoques de silicio final en la parte superior de la grupa del ratón para mantener el electrodo de puesta a tierra en su lugar.
   ADVERTENCIA: No aplique fuerza excesiva mientras coloca el parachoques final, ya que esto podría causar molestias al cachorro y/o desplazar el electrodo de puesta a tierra.
8. Agarra toda la plataforma y coloca suavemente dentro de la jaula de Faraday.
   ADVERTENCIA: Tenga cuidado y asegúrese de que el parachoques de silicona superior no se desplace una vez que la jaula de Faraday esté en su lugar.
9. Antes de grabar, asegúrese de que el cachorro del ratón no se está moviendo excesivamente y asegúrese de que el cuerpo y la cabeza del ratón parezcan seguros.
   ADVERTENCIA: Asegúrese de que la cabeza del cachorro del ratón es capaz de moverse un poco libremente dentro de los parachoques y no está completamente hocico hacia abajo en la plataforma. La plataforma elevada está diseñada para elevar ligeramente el tórax del ratón y evitar la asfixia, pero esto debe ser monitoreado de cerca.

Resultados

Un ECG ideal tendría una señal clara y prominente que permite analizar todas las ondas en varios marcos de tiempo diferentes (Figura 1). El laboratorio empleó inicialmente una aplicación personalizada de un aparato de electromiografía para producir ECGs de una calidad insatisfactoria, lo que sólo nos permitió analizar parámetros básicos como la frecuencia cardíaca (Figura S1). Esto inspiró el trabajo con una empresa para desarrollar un prototipo novedoso dispositi...

Discusión

Los puntos de datos recogidos en cachorros perinatales de 1 ratón de día 1 están ligeramente por debajo de los valores medios esperados para ratones adultos (500-700 latidos por minuto). ⁸ Hay un aumento en la frecuencia cardíaca a medida que el ratón envejece, que cae más en línea para los valores esperados (Tabla 1). Sin embargo, es importante destacar que los valores neonatales estaban en el extremo inferior de este rango, apoyando la idea de que los valores normativos d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabScribe4	iWorx	LabScribe4	Software used to record ECG	https://www.iworx.com/users/teaching.php
Neonatal Mouse ECG & Respiration System	iWorx	RS-NMECG : Neonatal Mouse ECG	ECG device	https://www.iworx.com/research/cardiac-function/rs-nmecg/
Tensive Conductive Adhesive Gel	Parker Laboratories, Inc	22-60	Tac-gel used as conductive gel for ECG	https://www.parkerlabs.com/tensive.asp