Elettrocardiografia non invasiva nel topo perinatale

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo di elettrocardiografia non invasiva (ECG), ottimizzato per i primi topi postnatali, che non richiede l'uso di anestetici.

Abstract

L'elettrocardiografia (ECG) è stata a lungo invocata come metodo efficace e affidabile per valutare la funzione cardiovascolare (e cardiopolmonare) sia nei modelli di malattia umani che animali. La frequenza cardiaca individuale, il ritmo e la regolarità, combinati con i parametri quantitativi raccolti dall'ECG, servono a valutare l'integrità del sistema di conduzione cardiaca e la fisiologia integrata del ciclocardiaco. Questo articolo fornisce una descrizione completa dei metodi e delle tecniche utilizzati per eseguire un ECG non invasivo sui cuccioli di topo perinatale e neonatale già il primo giorno postnatale, senza richiedere l'uso di anestetici. Questo protocollo è stato progettato per rispondere direttamente alla necessità di un metodo standardizzato e ripetibile per ottenere L'ECG nei topi appena nati. Da un punto di vista traslazionale, questo protocollo si rivela del tutto efficace per la caratterizzazione di difetti cardiopolmonari congeniti generati utilizzando linee transgeniche di topo, e in particolare per l'analisi di difetti che causano letalità nei primi giorni postnatali o durante i primi giorni postnatali. Questo protocollo mira anche ad affrontare direttamente una lacuna nella letteratura scientifica per caratterizzare e fornire dati normativi associati alla maturazione del sistema di conduzione cardiaca postnatale precoce. Questo metodo non si limita a uno specifico punto di tempo postnatale, ma consente piuttosto la raccolta di dati ECG nei cuccioli di topo neonatale dalla nascita al giorno postnatale 10 (P10), una finestra che è di importanza critica per modellare le malattie umane in vivo, con particolare attenzione alle malattie cardiache congenite (CHD).

Introduzione

La funzione cardiaca può essere misurata in diversi modi, il più comune dei quali include l'uso dell'elettrocardiografia (ECG) per analizzare la conduzione della corrente elettrica attraverso il cuore, nonché il suo ciclo cardiaco complessivo e la^{funzione 1}. L'elettrocardiografia continua ad essere un utile strumento diagnostico per identificare e caratterizzare anomalie cardiache sia nei modelli umani che in quello^{animale della malattia 1,2}. Irregolarità nella lettura di un elettrocardiogramma possono essere riscontrate nello sviluppo cardiaco anomalo (ad esempio, malattie cardiache congenite (CHD)), e possono includere aritmie che si manifestano come cambiamenti nella frequenza cardiaca (ad esempio, bradicardia) e nel ritmo (ad esempio, "blocchi cardiaci"), che indicano difetti nell'integrità e / o nella funzione del miocardio sottostante. Cambiamenti come questi possono predisporre i pazienti a disfunzioni cardiache potenzialmente letali (ad esempio, insufficienza cardiaca congestiva e / o arresto cardiaco) e aumento della^{mortalità 3,4}_. Dati gli alti tassi di mortalità con CHD grave e non trattato, è fondamentale sviluppare un metodo standardizzato e ripetibile per la raccolta dell'ECG durante questo primo periodo postnatale.

Anche se non siamo i primi ad affrontare questo problema, i precedenti metodi di raccolta dell'ECG su un cucciolo di topo hanno tradizionalmente incluso procedure invasive (elettrodi di aghi sottocutanei o fili) e / o l'uso di anestetici^5,6,7. I vantaggi dell'esecuzione di analisi ECG non invasiva includono la riduzione al minimo del dolore e l'annullamento dello stress sull'animale. Mentre lo sperimentatore deve ancora essere cauto nel causare lo stress del cucciolo, il dispositivo è progettato per evitare stressanti comuni al fine di produrre dati accurati. Nel contesto della valutazione della funzione cardiaca, l'introduzione dell'anestesia agli animali che possono avere anomalie cardiopolmonari potrebbe potenzialmente mascherare o addirittura esacerbare le condizioni sottostanti. Gli anestetici possono influenzare la conduzione elettrica alterando la depolarizzazione e/o la ripolarizzazione delle cellule. Infine, l'uso dell'anestesia può mettere il cucciolo appena nato a un rischio maggiore di ipotermia, che potrebbe ulteriormente confondere qualsiasi patologia intrinseca. Il seguente protocollo non introduce anestetici, procedure invasive o disagio pronunciato al cucciolo. Una volta completata la configurazione dell'apparecchiatura, la configurazione del dispositivo e la raccolta dei dati che coinvolgono l'animale possono essere completate in modo efficiente, dopo di che i cuccioli possono essere restituiti alla madre. Inoltre, questo sistema consente di eseguire analisi ripetute e/o seriali, ideali per esperimenti che richiedono analisi nel tempo, introduzione di terapie farmacologiche, ecc.

Protocollo

Il seguente protocollo segue gli standard dell'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del New England. Una stretta osservazione del protocollo dovrebbe fornire letture ECG soddisfacenti in tutti i neonati esaminati (n > 70).

1. Preparazioni per dispositivi

1. Collegare il dispositivo alla porta USB di un computer con il software ECG scaricato su di esso. Il dispositivo di misura inizierà automaticamente il riscaldamento fino a (37 °C/ 98,6 ° F). L'unità di riscaldamento interna è contenuta all'interno dell'unità di misura e riscalda solo la superficie plastica. Gli elettrodi metallici d'argento non vengono riscaldati.
2. Lasciare circa 15 minuti affinché la superficie raggiunga la temperatura. Usa questo tempo per raccogliere e impostare gli animali.
   NOTA: Il protocollo potrebbe essere messo in pausa a questo punto e la piattaforma può rimanere collegata e riscaldarsi per un lungo periodo di tempo. In assenza di una piattaforma di elettrodi autoriscaldamento, un riscaldante sicuro per animali può anche essere utilizzato per impedire a madre e cuccioli di diventare ipotermici.

2. Preparazioni animali

1. Raccogli la madre e i cuccioli e tieniti all'interno della gabbia abitativa fino a quando non è pronto per la raccolta.
2. Una volta che l'unità di misura si è riscaldata alla temperatura, rimuovere il cucciolo di topo dalla gabbia e pulire il torace con il 70% di etanolo spruzzato su una salvietta. Posizionare il cucciolo sulla superficie riscaldata della plastica.
3. Lasciare che il mouse si acclimati alla superficie al buio per circa 2-5 minuti.

3. Configurazione della piattaforma di mouse ed elettrodi (applicazione degli elettrodi)

1. Utilizzare una spatola metallica, una sonda o un tassello di legno per raccogliere una piccola goccia di adesivo, gel conduttore elettrico (un gel per elettrodi ad alta conducibilità ad asciugatura rapida comunemente usato per il posizionamento di elettrodi per roditori).
   NOTA: Qualsiasi oggetto solido non solido può essere utilizzato per applicare il gel conduttore, purché l'oggetto non lasci fibre sintetiche o materiale simile sugli elettrodi che potrebbero interferire con la qualità del segnale elettrico.
2. Utilizzando la spatola/tassello, toccare delicatamente la parte superiore di ciascuna delle quattro superfici degli elettrodi appiattite premendo delicatamente verso il basso e tirando il gel conduttore ad un angolo obliquo lontano dal centro del costrutto dell'elettrodo. Assicurarsi che ogni singolo elettrodo sia completamente coperto con il gel.
   ATTENZIONE: Questo passaggio è estremamente importante per garantire che il gel conduttivo dell'elettrodo non aderisca a più di un singolo elettrodo. I fili adesivi che si formano tra gli elettrodi possono condurre la carica e potenzialmente interferire o cortocircuitare il segnale elettrico desiderato. Il protocollo non deve essere messo in pausa in questo momento poiché il gel inizierà a solidificarsi e diventare aderente. Assicurarsi di impostare il mouse sulla piattaforma entro 5-10 minuti dall'applicazione del gel conduttore (o sostituzione equivalente del gel per elettrodi conduttivi).
3. Posizionare la spatola metallica o il tassello di legno con il resto del gel di lato.
4. Posizionare lo sterno neonatale del cucciolo di topo verso il basso e incline con la testa del cucciolo rivolto verso il bordo USB in uscita della piattaforma. Assicurarsi che una parte del torace del cucciolo copra ciascuno dei quattro elettrodi. Trattenere delicatamente gli adesmi del cucciolo al loro fianco tenendo premuto contemporaneamente per circa 1 minuto per consentire al gel conduttore di impostare.
5. Posizionare paraurti in silicone di gomma sui lati destro e sinistro del cucciolo. I paraurti dovrebbero fissare il cucciolo su ciascun lato e fornire stabilità per prevenire movimenti eccessivi del mouse, ma NON dovrebbero impedire qualsiasi movimento del mouse. Una volta installato, guardare il mouse per un momento e regolare il posizionamento del paraurti in base alle esigenze.
   ATTENZIONE: Non comprimere troppo strettamente il mouse in quanto ciò può interferire con la meccanica respiratoria e la frequenza respiratoria.
6. Utilizzare il tassello che è stato messo da parte per applicare il gel conduttore rimanente all'elettrodo della coda di messa a terra e posizionare sulla groppa del cucciolo. Applicare una pressione delicata per consentire al gel di impostare prima di rilasciare il cucciolo.
7. Posizionare il paraurti in silicio finale sopra la groppa del mouse per mantenere l'elettrodo di messa a terra in posizione.
   ATTENZIONE: Non applicare una forza eccessiva durante il posizionamento del paraurti finale in quanto ciò potrebbe causare disagio al cucciolo e / o spostare l'elettrodo di messa a terra.
8. Afferra l'intera piattaforma e posiziona delicatamente all'interno della gabbia di Faraday.
   ATTENZIONE: Prestare attenzione e assicurarsi che il paraurti superiore in silicone non si sposti una volta che la gabbia di Faraday è in posizione.
9. Prima di registrare, assicurarsi che il cucciolo di mouse non si muova eccessivamente e assicurarsi che il corpo e la testa del mouse appaia sicuro.
   ATTENZIONE: Assicurarsi che la testa del cucciolo di topo sia in grado di muoversi un po 'liberamente all'interno dei paraurti e non sia completamente muso verso il basso nella piattaforma. La piattaforma rialzato è progettata per elevare leggermente il torace del topo e prevenire il soffocamento, ma questo dovrebbe essere monitorato da vicino.

Risultati

Un ECG ideale avrebbe un segnale chiaro e prominente che consente di analizzare tutte le onde in diversi tempi (Figura 1). Il laboratorio ha inizialmente utilizzato un'applicazione personalizzata di un apparato elettromiografico per produrre ECG di qualità insoddisfacente, che ci ha permesso solo di analizzare parametri di base come la frequenza cardiaca (Figura S1). Questo ha ispirato il lavoro con un'azienda per sviluppare un nuovo prototipo di dispositivo ECG specifico p...

Discussione

I punti dati raccolti nel giorno perinatale 1 cuccioli di topo sono leggermente al di sotto dei valori medi previsti per i topi adulti (500-700 battiti al minuto). ⁸ Si è registrato un aumento della frequenza cardiaca con l'invecchiamento del mouse, che si allinea maggiormente ai valori previsti (tabella 1). Tuttavia, è importante sottolineare che i valori neonatale si trovavano nella fascia inferiore di questo intervallo, sostenendo l'idea che i valori normativi dovrebbero esse...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabScribe4	iWorx	LabScribe4	Software used to record ECG	https://www.iworx.com/users/teaching.php
Neonatal Mouse ECG & Respiration System	iWorx	RS-NMECG : Neonatal Mouse ECG	ECG device	https://www.iworx.com/research/cardiac-function/rs-nmecg/
Tensive Conductive Adhesive Gel	Parker Laboratories, Inc	22-60	Tac-gel used as conductive gel for ECG	https://www.parkerlabs.com/tensive.asp