Eletrocardiografia não invasiva no Rato Perinatal

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo de eletrocardiografia não invasiva (ECG), otimizado para camundongos pós-natais precoces, que não requer o uso de anestésicos.

Resumo

A eletrocardiografia (ECG) tem sido confiada há muito tempo como um método eficaz e confiável de avaliação da função cardiovascular (e cardiopulmonar) em modelos humanos e animais de doença. A frequência cardíaca individual, o ritmo e a regularidade, combinados com parâmetros quantitativos coletados do ECG, servem para avaliar a integridade do sistema de condução cardíaca, bem como a fisiologia integrada do ciclocardíaco. Este artigo fornece uma descrição abrangente dos métodos e técnicas utilizados para a realização de um ECG não invasivo em filhotes de camundongos perinatais e neonatais já no primeiro dia pós-natal, sem exigir o uso de anestésicos. Este protocolo foi projetado para atender diretamente à necessidade de um método padronizado e repetível para a obtenção de ECG em camundongos recém-nascidos. Do ponto de vista translacional, este protocolo se mostra inteiramente eficaz para a caracterização de defeitos cardiopulmonares congênitos gerados usando linhas de camundongos transgênicos, e particularmente para análise de defeitos que causam letalidade nos primeiros dias pós-natal. Este protocolo também visa abordar diretamente uma lacuna na literatura científica para caracterizar e fornecer dados normativos associados à maturação do sistema de condução cardíaca pós-natal precoce. Este método não se limita a um ponto de tempo pós-natal específico, mas permite a coleta de dados de ECG em filhotes de camundongos neonatais desde o nascimento até o pós-natal 10 (P10), uma janela de importância crítica para a modelagem de doenças humanas in vivo, com ênfase especial na doença cardíaca congênita (DSP).

Introdução

A função cardíaca pode ser medida de diferentes formas, sendo a mais comum o uso de eletrocardiografia (ECG) para analisar a condução da corrente elétrica através do coração, bem como seu ciclo cardíaco e função¹. A eletrocardiografia continua sendo uma ferramenta de diagnóstico útil para identificar e caracterizar anomalias cardíacas em modelos humanos e animais da doença^1,2. Irregularidades na leitura de eletrocardiograma podem ser encontradas no desenvolvimento cardíaco anormal (ou seja, doença cardíaca congênita (DP)), e podem incluir arritmias manifestando-se como alterações na frequência cardíaca (por exemplo, bradycardia) e ritmo (por exemplo, "blocos cardíacos"), sugestivos de defeitos na integridade e/ou função do miocárdio subjacente. Alterações como essas podem predispor pacientes a disfunção cardíaca com risco de vida (por exemplo, insuficiência cardíaca congestiva e/ou parada cardíaca) e aumento da mortalidade^3,4_. Dadas as altas taxas de mortalidade com CHD grave e não tratada, desenvolver um método padronizado e repetível para a coleta de ECG durante este período pós-natal inicial é fundamental.

Embora não sejamos os primeiros a resolver esse problema, métodos anteriores de coleta de ECG em filhotes de camundongos tradicionalmente incluíram procedimentos invasivos (agulha subcutânea ou eletrodos de arame) e/ou o uso de anestésicos^5,6,7. As vantagens de realizar análises não invasivas do ECG incluem minimizar a dor e desfazer o estresse no animal. Embora o experimentador ainda deva ser cauteloso sobre a causa do estresse do filhote, o dispositivo foi projetado para evitar estressores comuns, a fim de produzir dados precisos. No contexto de avaliação da função cardíaca, introduzir anestesia em animais que possam ter anormalidades cardiopulmonares poderia potencialmente mascarar ou até mesmo exacerbar as condições subjacentes. Anestésicos podem afetar a condução elétrica alterando a despolarização e/ou a repolarização das células. Finalmente, o uso da anestesia pode colocar o filhote recém-nascido em risco aumentado de hipotermia, o que poderia confundir ainda mais qualquer patologia inerente. O protocolo a seguir não introduz nenhum anestésico, procedimentos invasivos ou desconforto pronunciado ao filhote. Uma vez que a configuração do equipamento é finalizada, a configuração do dispositivo e a coleta de dados envolvendo o animal podem ser concluídas de forma eficiente, após a qual os filhotes podem ser devolvidos à mãe. Além disso, este sistema permite a realização de análises repetitivas e/ou seriais, o que é ideal para experimentos que requerem análise ao longo do tempo, introdução de terapias farmacológicas, etc.

Protocolo

O seguinte protocolo segue as normas do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Nova Inglaterra. A observação atenta do protocolo deve fornecer leituras satisfatórias do ECG em todos os recém-nascidos examinados (n > 70).

1. Preparações do dispositivo

1. Conecte o dispositivo à porta USB de um computador com o software ECG baixado nele. O dispositivo de medição começará automaticamente a aquecer até (37 °C/98.6 °F). A unidade de aquecimento interna está contida dentro da unidade de medição e aquece apenas a superfície plástica. Os eletrodos de fio prateado não são aquecidos.
2. Deixe aproximadamente 15 minutos para que a superfície atinja a temperatura. Use esse tempo para reunir e montar animais.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado neste momento e a plataforma pode permanecer conectada e aquecendo por um longo período de tempo. Na ausência de uma plataforma de eletrodos auto-aquecidos, uma almofada de aquecimento segura para animais também pode ser usada para evitar que mãe e filhotes se tornem hipotérmicos.

2. Preparações para animais

1. Pegue a mãe e os filhotes e mantenha-se dentro da gaiola até ficar pronto para recolher.
2. Uma vez que a unidade de medição tenha aquecido até a temperatura, remova o filhote de rato da gaiola e limpe o tórax com 70% de etanol pulverizado em uma limpeza. Coloque o filhote na superfície aquecida do plástico.
3. Deixe o mouse se aclimatar à superfície no escuro por aproximadamente 2-5 minutos.

3. Configuração da plataforma de mouse e eletrodo (aplicação de eletrodo)

1. Use uma espátula metálica, sonda ou dowel de madeira para coletar uma pequena gota de gel adesivo e de condução elétrica (um gel de eletrodo de alta condutividade de secagem rápida comumente usado para colocação de eletrodos de roedores).
   NOTA: Qualquer objeto sólido não fibrosa pode ser usado para aplicar o gel condutor, desde que o objeto não deixe para trás fibras sintéticas ou material semelhante nos eletrodos que possam interferir na qualidade do sinal elétrico.
2. Usando a espátula/dowel, toque suavemente na parte superior de cada uma das quatro superfícies de eletrodos achatadas pressionando suavemente para baixo e puxando o gel condutor em um ângulo oblíquo para longe do centro da construção do eletrodo. Certifique-se de que cada eletrodo individual está completamente coberto com o gel.
   ATENÇÃO: Esta etapa é extremamente importante para garantir que o gel condutor e eletrodo não adere a mais de um único eletrodo. Os fios adesivos que se formam entre eletrodos podem conduzir a carga e potencialmente interferir ou curto o sinal elétrico desejado. O protocolo não deve ser pausado neste momento, pois o gel começará a se solidificar e se tornar aderente. Certifique-se de configurar o mouse na plataforma dentro de 5-10 minutos após a aplicação de gel condutor (ou substituição de gel de eletrodo condutor equivalente).
3. Coloque a espátula metálica ou o dowel de madeira com o restante do gel ao lado.
4. Coloque o esterno do filhote de rato neonatal para baixo e propenso com a cabeça do filhote de frente para a borda USB de saída da plataforma. Certifique-se de que uma parte do peito do filhote está cobrindo cada um dos quatro eletrodos. Contenha suavemente os antebraços do filhote ao seu lado, mantendo simultaneamente por aproximadamente 1 minuto para permitir que o gel condutor se estafina.
5. Coloque para-choques de silicone de borracha nos lados direito e esquerdo do filhote. Os para-choques devem fixar o filhote em cada lado e fornecer estabilidade para evitar movimentos excessivos do mouse, mas não devem impedir todo o movimento do mouse. Uma vez instalado, observe o mouse por um momento e ajuste a colocação do para-choques conforme necessário.
   ATENÇÃO: Não comprimir o camundongo muito fortemente, pois isso pode interferir com a mecânica respiratória e a taxa respiratória.
6. Use o dowel que foi reservado para aplicar gel condutor restante no eletrodo traseiro de aterramento e coloque na garupa do filhote. Aplique pressão suave para permitir que o gel defina antes de soltar o filhote.
7. Coloque o para-choque de silicone final em cima da garupa do mouse para manter o eletrodo de aterramento no lugar.
   ATENÇÃO: Não aplique força excessiva ao colocar o para-choque final, pois isso pode causar desconforto ao filhote e/ou deslocar o eletrodo de aterramento.
8. Pegue toda a plataforma e coloque suavemente dentro da jaula de Faraday.
   ATENÇÃO: Tenha cuidado e garanta que o para-choque de silicone superior não fique deslocado quando a gaiola faraday estiver no lugar.
9. Antes de gravar, certifique-se de que o filhote do rato não está se movendo excessivamente e certifique-se de que o corpo e a cabeça do mouse pareçam seguros.
   ATENÇÃO: Certifique-se de que a cabeça do filhote de rato é capaz de se mover um pouco livremente dentro dos para-choques e não está completamente focinho para baixo na plataforma. A plataforma levantada foi projetada para elevar ligeiramente o tórax do mouse e evitar sufocamento, mas isso deve ser monitorado de perto.

Resultados

Um ECG ideal teria um sinal claro e proeminente que permite que todas as ondas sejam analisadas em vários períodos de tempo diferentes(Figura 1). O laboratório inicialmente utilizou uma aplicação personalizada de um aparelho de eletromyografia para produzir ECGs de qualidade insatisfatória, o que só nos permitiu analisar parâmetros básicos como a frequência cardíaca(Figura S1). Este trabalho inspirado com uma empresa para desenvolver um novo protótipo de disposit...

Discussão

Os pontos de dados coletados no perinatal dia 1 filhotes de camundongos estão ligeiramente abaixo dos valores médios esperados para camundongos adultos (500-700 batidas por minuto). ⁸ Há um aumento na frequência cardíaca à medida que o mouse envelhece, que cai mais na linha para os valores esperados(Tabela 1). No entanto, é importante ressaltar que os valores neonatais estavam na extremidade inferior dessa faixa, apoiando a ideia de que os valores normativos devem ser docum...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabScribe4	iWorx	LabScribe4	Software used to record ECG	https://www.iworx.com/users/teaching.php
Neonatal Mouse ECG & Respiration System	iWorx	RS-NMECG : Neonatal Mouse ECG	ECG device	https://www.iworx.com/research/cardiac-function/rs-nmecg/
Tensive Conductive Adhesive Gel	Parker Laboratories, Inc	22-60	Tac-gel used as conductive gel for ECG	https://www.parkerlabs.com/tensive.asp