Producción de pollos de engorde de rápido crecimiento libres de gérmenes a partir de una línea comercial para estudios de microbiota

Resumen

Aquí describimos un método para la generación de pollitos libres de gérmenes a partir de huevos de una línea comercial de pollos de engorde, el Ross PM3. Este método se puede adaptar para la generación de animales libres de gérmenes de otras especies de aves de corral.

Resumen

Los estudios de la contribución de la microbiota intestinal a la fisiología e inmunocompetencia del huésped se ven facilitados por la disponibilidad de modelos animales libres de gérmenes, que se consideran el estándar de oro. Las aves que anidan son modelos ideales para la producción de animales libres de gérmenes, ya que no hay necesidad de criar a sus familiares en condiciones estériles. Los pollos libres de gérmenes se generan principalmente a partir de líneas experimentales libres de patógenos específicos (SPF), que son poco representativas de las líneas comerciales de pollos. El método propuesto aquí permitió la producción de pollos libres de gérmenes de la línea de pollos de engorde de rápido crecimiento Ross PM3, comúnmente utilizada por la industria avícola. Los huevos se recolectaron rápidamente después de poner en una granja de reproductores de pollos de engorde. Se sometieron a un estricto proceso de descontaminación desde la recolección hasta la introducción en un aislador estéril para incubar huevos. Los polluelos han sido incubados y mantenidos en estos aisladores estériles durante el período necesario para controlar su esterilidad. Originalmente desarrollado para una línea experimental de cuernos de pata blanca SPF, el protocolo actual se ha adaptado no solo a la línea de pollos de engorde Ross PM3, sino también a las codornices. Por lo tanto, representa un procedimiento robusto y fácilmente adaptable a otras especies de aves de corral y aves de anidación de relevancia económica, biológica o ecológica.

Introducción

Ha habido un aumento dramático en el interés científico y popular sobre la contribución de la microbiota intestinal a la salud animal. La microbiota, formada por bacterias, virus, hongos y arqueas que habitan diferentes nichos en el intestino del animal, está implicada directa o indirectamente en la regulación de enfermedades inflamatorias, infecciosas y metabólicas que afectan no solo a las especies de mamíferos sino también al ganado, como las aves^{de corral 1}. Se desarrollaron varios modelos animales para estudiar mejor la contribución de la microbiota intestinal a la salud y la enfermedad. Por ejemplo, los animales libres de gérmenes y gnotobióticos permiten estudiar la ausencia completa de microbios o de una microbiota conocida, respectivamente, sobre la fisiopatología de las infecciones ^2,3. Sin embargo, generar y mantener estos animales requiere técnicas e instalaciones especializadas, y los costos, la mano de obra y las habilidades requeridas para mantenerlos limitan su acceso a muchos investigadores. De hecho, los animales libres de gérmenes deben ser monitoreados regularmente para detectar una posible contaminación utilizando una combinación de métodos de cultivo de bacterias, microscopía, serología, morfología gruesa y técnicas de detección basadas en secuenciación. Procedimientos similares también se aplican a otras especies, como el ganado, donde los animales son generalmente más grandes y requieren instalaciones más grandes para su cría y mantenimiento, lo que puede obstaculizar, en cierta medida, la investigación sobre la microbiota.

Las aves de corral, más específicamente los pollos, son la piedra angular de la producción ganadera en todo el mundo, con una población de bandadas que puede superar los 40 mil millones de aves por año. Es la fuente más importante de proteína animal en el mundo (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Además, no hay tabúes culturales o religiosos asociados a la cría o el consumo de pollos. La microbiota intestinal de las aves de corral está involucrada de manera importante en el crecimiento de los animales, la relación de conversión alimenticia, la inmunidad, la resistencia a los patógenos, entre muchos otros procesos nutricionales, fisiológicos o patológicos⁴. Por lo tanto, la generación de pollos libres de gérmenes es indispensable para subrayar el diálogo entre la microbiota y su huésped⁴. Incluso si las comunidades microbianas habitan en el oviducto del pollo⁵, el contenido de un huevo recién puesto por una gallina sana está en su mayoría libre de microorganismos, la cáscara del huevo y las membranas poseen barreras mecánicas para evitar la invasión de microorganismos⁴. Además, los polluelos se crían fácilmente en ausencia de sus parientes, lo que, a diferencia de los mamíferos, permite la producción de animales libres de gérmenes sin la crianza de los padres en condiciones estériles.

La instalación experimental "Infectiology of Farm, Model and Wild Animals" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Francia, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) forma parte de la Red Nacional de Infraestructuras de Francia EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE ha dominado la producción de pollos libres de gérmenes para realizar diversos estudios experimentales durante más de 40 años 7,8,9,10,11. Estos animales se produjeron a partir de huevos específicos libres de patógenos (SPF) a partir de una línea de puesta de leghorn blanco criada en cría cerrada desde la década de 1970. Utilizadas principalmente para estudios microbiológicos ^7,8,9, las aves libres de gérmenes están experimentando un resurgimiento de interés con preguntas como la contribución de la microbiota intestinal al comportamiento¹³, la utilización de nutrientes¹⁴, el desarrollo inmunológico¹⁵ y la actividad endocrina. Incluso si algunos estudios se han publicado utilizando líneas de pollos de engorde libres de gérmenes¹⁶, estos estudios siguen estando subrepresentados en comparación con los estudios que utilizan líneas de capas experimentales. La evolución de las cuestiones científicas hacia la diafonía entre la microbiota y su huésped en la salud y el bienestar de las aves de corral nos ha llevado a adaptar nuestro protocolo histórico para producir pollos de engorde libres de gérmenes de la línea Ross PM3, la línea de pollos de engorde más utilizada del mundo.

Protocolo

Los procedimientos de cuidado de los animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas (86/609/CEE) y por la normativa francesa sobre experimentación animal.

1. Preparación del aislador

1. Inserte los materiales necesarios en un aislador rígido bajo presión positiva: tubos de 50 ml, pipetas de plástico de 5, 10 y 25 ml, alimentación irradiada, agua en autoclave y recipientes de plástico sellados estériles.
2. Llene la trampa germicida de transferencia con una solución de amonio cuaternario al 2%.
3. Esterilizar el aislador tres veces con vapor de formaldehído utilizando 60 ml de formalina (24% de formaldehído) añadidos a 30 g de permanganato de potasio por metro cúbico (m³). Mueva los materiales dentro del aislador entre cada esterilización para garantizar la esterilización de todas las superficies de contacto.
4. Ajuste la temperatura del aislador a 37 °C durante al menos 2 días antes de introducir los huevos. Ajuste el higrómetro al 65-70% de humedad relativa (HR) el día de la introducción.

2. Recolección e incubación de huevos

1. Recoger los huevos de las explotaciones seleccionadas sobre la base de una buena tasa de eclosión de las gallinas ponedoras (al menos el 80 % en el pico de producción de huevos) y su buen estado sanitario (es decir, ausencia de patógenos comunes de las aves de corral y ausencia de enfermedades dentro de la manada). Seleccione visualmente huevos limpios e impecables en la cinta de correr.
2. Descontamine inmediatamente la superficie del huevo sumergiéndolos durante 5 minutos en una solución de ácido peracético al 1,5% a temperatura ambiente.
3. Transportar los huevos a la instalación experimental utilizando una caja descontaminada con vapor de formaldehído.
4. Conservar los huevos durante 24 horas a 4 °C. Repita el proceso de descontaminación descrito en el paso 2.2 y colóquelos en una incubadora de incubación (Día 0) durante 19 días.

3. Eclosión

1. El día 19, verifique la fertilidad, la viabilidad (motilidad) y el desarrollo embrionario candándolos utilizando un candler de huevos ligeros en condiciones estériles. Introduzca solo huevos vivos embrionados en los aisladores estériles para incubar.
2. Descontaminar los huevos seleccionados rociando una solución de ácido peracético al 1,5% durante 30 s o hasta que se cubra toda la superficie de cada huevo. Los huevos permanecerán en contacto con el aerosol durante 16 min y 30 s durante la transferencia a aisladores.
3. Transfiera los huevos a los aisladores de eclosión estériles y enjuáguelos con agua desmineralizada estéril antes de colocarlos en el espacio de eclosión.
   NOTA: Los animales nacen y se crían en aisladores estériles. Se alimentan ad libitum con una dieta comercial esterilizada por irradiación gamma y regada con agua del grifo en autoclave proporcionada por dispensadores de agua.

4. Análisis del estado bacteriológico

1. Un día después de la eclosión, tome una muestra fecal directamente del recto de diferentes polluelos y colóquelos en un tubo de vidrio esterilizado para que esta muestra sea representativa de todos los animales dentro de un aislador determinado.
2. Las muestras fecales al ser más o menos líquidas, añadir un equivalente de 1 mL de heces a 9 mL de caldo de tioglicolato con resazurina. Agregue la muestra fecal restante a 9 ml de caldo de infusión de corazón cerebral (BHI) e incube los tubos a 37 ° C sin agitar durante 18 a 48 h. Esto permitirá el crecimiento de una amplia gama de especies aeróbicas, aeróbicas facultativas y anaeróbicas no exigentes.
   NOTA: El caldo de tioglicolato con resazurina está destinado a la detección de bacterias anaeróbicas no fastidiosas, pero también permite la detección de bacterias aeróbicas. Este medio cumple con las farmacopeas europeas, americanas y japonesas para pruebas de esterilidad 18,19,20.
3. Observe visualmente si se produce alguna modificación en el medio de crecimiento después de 18 horas de incubación. Después de 48 h, tome una gota del medio de caldo fecal BHI, colóquela en un portaobjetos de vidrio y observe bajo un microscopio (aumento de 40X) la ausencia o presencia de bacterias.
4. Si hay una sospecha sobre la presencia de bacterias, tome una muestra del cultivo de BHI y sembrarla en placas de agar BHI. Incubar a 37 °C durante 18 a 48 h.
5. Si hay colonias presentes, lleve a cabo técnicas de alto rendimiento como la espectrometría de masas MALDI-TOF para una identificación microbiana precisa.
   NOTA: Pasadas las 72 h, si los análisis bacteriológicos son negativos, los animales son declarados libres de gérmenes.

Resultados

Se realizaron seis series de generación de pollitos libres de gérmenes con huevos Ross PM3 procedentes de dos granjas francesas diferentes (Tabla 1). Se recogieron un total de 853 huevos y tras dos etapas de descontaminación y 19 días de incubación, el 86,40% fueron viables. 490 de estos huevos viables se sometieron a una tercera etapa de descontaminación y se introdujeron en varios aisladores de eclosión, para una tasa de eclosión promedio del 79,80%. Esto representa una tasa de eclosión del 68,94% en comparación con el número inicial de huevos recolectados.

Sin embargo, los resultados de eclosión varían sustancialmente según la serie realizada: del 41,67% al 88,16% de los pollitos viables en comparación con el número de huevos recolectados. Estas variaciones también se observaron entre las diferentes escotillas durante el mismo experimento. Dado que no todos los aisladores se han utilizado para todas las ejecuciones, es difícil excluir un efecto dependiente del aislador. Sin embargo, este efecto de lote se correlacionó directamente con la edad de las gallinas ponedoras (Figura 1), donde los huevos procedentes de gallinas más viejas eran menos viables.

Las seis tandas se llevaron a cabo utilizando cuatro aisladores de eclosión diferentes. Después del control bacteriológico, se confirmó que los animales de 14 de los 16 aisladores estaban libres de gérmenes. Esto corresponde a una tasa de éxito del 87,5%. Los dos aisladores restantes estaban contaminados por una sola bacteria ambiental y no patógena.

Todos los animales utilizados para los experimentos científicos permanecieron libres de gérmenes hasta el final de los estudios, durante al menos tres semanas después de la eclosión.

Figura 1: Efecto de la edad de la gallina en la tasa de eclosión La presente figura destaca las tasas de eclosión observadas en función de la edad de la manada de gallinas ponedoras, expresadas en semanas de puesta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	Huevos recolectados	Huevos viables D19	D19 huevos viables/huevos recolectados	Huevos transferidos al aislador 1	Huevos transferidos al aislador 2	Huevos transferidos al aislador 3	Huevos transferidos al aislador 4	total de huevos transferidos	pollitos viables eclosionados en el aislador 1	pollitos viables eclosionados en el aislador 2	pollitos viables eclosionados en el aislador 3	pollitos viables eclosionados en el aislador 4	total de pollitos eclosionados viables	aislador viable de huevos eclosionados/transferidos1	aislador viable de huevos eclosionados/transferidos2	aislador viable de huevos eclosionados/transferidos3	aislador viable de huevos eclosionados/transferidos4	huevos viables eclosionados/transferidos a nivel mundial
Ejecutar 1	Años 30	93	92.08%	23	24	-	-	47	22	23	-	-	45	95.65%	95.83%			95.74%
Ejecutar 2	130	117	90.00%	25	25	25		75	20	24	18	-	62	80.00%	96.00%	72.00%		82.67%
Ejecutar 3	132	97	73.48%	26	-	26	45	97	14	-	13	28*	27	53.85%		50.00%	62.22%	56.70%
Carrera 4	130	116	89.23%	36	35	-	-	71	33	34	-	-	67	91.67%	97.14%			94.37%
Ejecutar 5	180	148	82.22%	30	30	30	30	120	26*	25	17	24	66	86.67%	83.33%	56.67%	80.00%	76.67%
Ejecutar 6	180	166	92.22%	-	40	40	-	80	-	35	35	-	70	86.67%	87.50%	87.50%		87.50%
Total	853	737	86.40%	140	154	121	75	490	89	141	83	24	337	82.14%	91.56%	68.60%	69.33%	79.80%

Tabla 1: Resultados técnicos de los diferentes experimentos de eclosión. La presente tabla destaca los resultados de las 6 series de eclosión libre de gérmenes realizadas: número de huevos recogidos, viabilidad del embrión a los 19 días y pollitos eclosionados viables en los distintos aisladores.

Discusión

Se han descrito previamente varios métodos para generar pollos libres de gérmenes ^7,21,22. Los métodos simples, como el que se presenta aquí, utilizan diferentes desinfectantes para reducir la carga bacteriana en la superficie del huevo y en los aisladores. Los desinfectantes más utilizados son el cloruro mercúrico, el amonio cuaternario, el yodoformo, el hipoclorito de sodio y las soluciones de dióxido de cloro. Los resultados suelen ser satisfactorios. Sin embargo, a pesar de la accesibilidad de estos métodos, pocas estructuras pueden aplicar el método y criar a los animales a gran escala, lo que hace que la utilización de pollos libres de gérmenes sea un enfoque relativamente raro, solo utilizado para abordar cuestiones científicas muy específicas. Los métodos, materiales y equipos descritos aquí permiten una proporción de eclosión altamente eficiente de pollos de engorde libres de gérmenes, que permanecen sanos y estériles durante al menos 3 semanas (la duración de los experimentos científicos para los que se produjeron).

Los resultados muestran que la adaptación del protocolo a la producción de pollitos libres de gérmenes a partir de huevos recolectados en granjas avícolas comerciales es exitosa. La experiencia con la producción de huevos SPF revela que la eficiencia de la eclosión depende principalmente de la edad de las gallinas ponedoras y de la calidad de los huevos recolectados. Ambos parámetros se tuvieron en cuenta cuando se eligieron las granjas y se recolectaron los huevos. Utilizando el mismo método, la tasa media de eclosión de pollos de engorde libres de gérmenes es mucho mejor que la obtenida en la última producción de gallinas ponedoras SPF en nuestras instalaciones (79% vs 35%), sin afectar la esterilidad animal (87% vs 83%). Estas diferencias pueden estar asociadas a los antecedentes genéticos de las aves (pollos de engorde frente a ponedoras), así como a la calidad de la cáscara del huevo, que es probable que sea más frágil en los huevos de los animales SPF, mantenidos en reproducción cerrada durante más de 40 años. Además, también mostramos que el transporte de más de 2 h (desde las granjas hasta la instalación experimental) no afecta la eficiencia y la calidad de la eclosión.

Aunque se optimizó el proceso de esterilización utilizado para los aisladores de eclosión y el protocolo para la descontaminación de huevos, alrededor del 10% de los aisladores no estaban libres de gérmenes. Para comprender el origen de la contaminación, es muy importante llevar a cabo un control rutinario de la esterilidad de los aisladores eclosionados antes de la introducción del huevo.

En cuanto al estado de esterilidad de las aves, intentamos aplicar métodos que permitan el crecimiento de bacterias anaeróbicas aeróbicas y no fastidiosas a partir de muestras fecales, asegurando así que estamos detectando bacterias vivas y viables. Estos métodos cumplen con las farmacopeas internacionales para las pruebas de esterilidad y representan técnicas rápidas, fáciles y de costo reducido para ser utilizadas rutinariamente. Sin embargo, técnicas de biología molecular como la secuenciación del gen 16S rRNA, aunque no dan información sobre la viabilidad de las bacterias, se pueden aplicar para la confirmación de la presencia de bacterias no cultivables. De hecho, un estudio reciente sugirió que algunas bacterias de la microbiota del oviducto materno parecen transferirse al embrión a través de la clara de huevo, constituyendo más tarde la mayor parte de la población bacteriana intestinal del embrión⁵. Además, otro estudio sugirió que parte de los colonizadores microbianos albergados en embriones tempranos fueron heredados de gallinas maternas, y la abundancia y diversidad microbiana intestinal fueron influenciadas más tarde por factores ambientales y genética del huésped durante el desarrollo²³. Sin embargo, los resultados de estos estudios se basan en el análisis de secuencia de ADN, donde un gran número de esas bacterias podrían estar muertas o no replicables en la clara de huevo (muy cargadas de moléculas antimicrobianas). Thomas y sus colaboradores¹⁶ realizaron pruebas de esterilidad a través de la evaluación de bacterias aeróbicas y aeróbicas facultativas cultivables a través de la caída fecal en placas BHI, destacando así la eficiencia de los métodos bacteriológicos estándar para el control de la esterilidad libre de gérmenes. Además, en el protocolo propuesto, utilizamos la monitorización del crecimiento en caldo tioglicolato con resazurina para poder detectar el crecimiento de bacterias anaeróbicas no fastidiosas.

Ya utilizado para la producción de codornices y pollos libres de gérmenes, el protocolo es adaptable a la producción de animales libres de gérmenes de la mayoría de las aves que anidan y ofrece perspectivas para el estudio de la contribución de la microbiota a la fisiología de estos animales. Además del uso de este modelo para investigar las interacciones mutuas huésped-microbiota en el intestino de las aves de corral, también podría ser útil para la investigación aplicada. Por ejemplo, podría usarse para evaluar la seguridad y eficacia de los probióticos derivados de microorganismos comensales intestinales de pollo para mejorar la salud y la robustez de los animales.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL sterile plastic pipettes	Starsted	86.1252.001
50 mL tubes	Falcon
BHI agar plates	Thermo fisher diagnostic	PO1198A
Brain Heart Infusion broth	Thermo fisher diagnostic	CM1135
Glass tubes with 9 mL BHI broth			home made and sterilized by autoclaving
Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin			home made and sterilized by autoclaving
Hatching incubator	Fieme	MG 576
Incubator	Memmert		for bacteriological culture, 37 °C
Irradiated feed	Safe	U8983G10R	40 kG irradiated
Isolators			home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure
Microbiological safety cabinet	thermon electron corporation		model: Hera Safe
Microscope Visiscope series 300	VWR
Pipette aid	Drummond
Plastic pipettes
Sterile sealed boxes	Tuperware		diameter
Sterilized glass tube			"sovirel"
Thioglycolate Broth with Resazurin	Merck	90404-500G
Water bath	Fisher scientific		model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium