Herstellung keimfreier, schnell wachsender Masthähnchen aus einer kommerziellen Linie für Mikrobiota-Studien

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erzeugung keimfreier Küken aus Eiern einer kommerziellen Masthähnchenlinie, der Ross PM3. Diese Methode kann für die Erzeugung keimfreier Tiere aus anderen Geflügelarten angepasst werden.

Zusammenfassung

Untersuchungen des Beitrags der Darmmikrobiota zur Wirtsphysiologie und Immunkompetenz werden durch die Verfügbarkeit keimfreier Tiermodelle erleichtert, die als Goldstandard gelten. Nistende Vögel sind ideale Modelle für die Produktion keimfreier Tiere, da ihre Verwandten nicht unter sterilen Bedingungen aufgezogen werden müssen. Keimfreie Hühner werden hauptsächlich aus spezifisch-pathogenfreien (SPF) Versuchslinien erzeugt, die für kommerzielle Hühnerlinien schlecht repräsentativ sind. Die hier vorgeschlagene Methode ermöglichte die Produktion von keimfreien Hühnern aus der schnell wachsenden Masthähnchenlinie Ross PM3, die üblicherweise von der Geflügelindustrie verwendet wird. Die Eier wurden schnell gesammelt, nachdem sie auf einer Masthähnchenzuchtfarm gelegt worden waren. Sie durchliefen einen strengen Dekontaminationsprozess von der Entnahme bis zur Einführung in einen sterilen Eierschlüpfisolator. Die Küken wurden geschlüpft und in diesen sterilen Isolatoren während des Zeitraums gehalten, der zur Kontrolle ihrer Sterilität erforderlich ist. Ursprünglich für eine experimentelle SPF-Linie für weiße Leghorne entwickelt, wurde das vorliegende Protokoll nicht nur an die Ross PM3-Masthähnchenlinie, sondern auch an Wachteln angepasst. Es stellt daher ein robustes und leicht anpassbares Verfahren an andere Geflügelarten und Brutvögel von ökonomischer, biologischer oder ökologischer Relevanz dar.

Einleitung

Das wissenschaftliche und populäre Interesse am Beitrag der Darmmikrobiota zur Tiergesundheit hat dramatisch zugenommen. Die Mikrobiota, bestehend aus Bakterien, Viren, Pilzen und Archaeen, die verschiedene Nischen im Darm des Tieres bewohnen, ist direkt oder indirekt an der Regulation von entzündlichen, infektiösen und metabolischen Erkrankungen beteiligt, die nicht nur Säugetierarten, sondern auch Nutztiere wie Geflügel^{betreffen 1}. Mehrere Tiermodelle wurden entwickelt, um den Beitrag der Darmmikrobiota zu Gesundheit und Krankheit besser untersuchen zu können. Zum Beispiel ermöglichen keimfreie und gnotobiotische Tiere die Untersuchung der vollständigen Abwesenheit von Mikroben bzw. einer bekannten Mikrobiota auf die Physiopathologie von Infektionen ^2,3. Die Erzeugung und Pflege dieser Tiere erfordert jedoch spezielle Techniken und Einrichtungen, und die Kosten, die Arbeit und die Fähigkeiten, die erforderlich sind, um sie zu erhalten, beschränken ihren Zugang zu vielen Forschern. Tatsächlich müssen keimfreie Tiere regelmäßig auf eine mögliche Kontamination mit einer Kombination aus Bakterienkultivierungsmethoden, Mikroskopie, Serologie, grober Morphologie und sequenzierungsbasierten Nachweistechniken überwacht werden. Ähnliche Verfahren gelten auch für andere Arten wie Nutztiere, bei denen Tiere im Allgemeinen größer sind und größere Einrichtungen für ihre Zucht und Pflege benötigen, was die Erforschung der Mikrobiota bis zu einem gewissen Grad behindern kann.

Geflügel, genauer gesagt Hühner, sind der Eckpfeiler der weltweiten Tierproduktion, mit einer Herdenpopulation, die 40 Milliarden Vögel pro Jahr überschreiten kann. Es ist die wichtigste Quelle für tierisches Protein in der Welt (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Darüber hinaus gibt es keine kulturellen oder religiösen Tabus, die mit der Aufzucht oder dem Verzehr von Hühnern verbunden sind. Die Geflügeldarmmikrobiota ist wichtig am Wachstum der Tiere, am Futterverwertungsverhältnis, an der Immunität, an der Resistenz gegen Krankheitserreger und an vielen anderen ernährungsphysiologischen, physiologischen oder pathologischen Prozessen^{beteiligt 4}. Die Erzeugung keimfreier Hühner ist daher unerlässlich, um den Dialog zwischen der Mikrobiota und ihrem Wirt zu unterstreichen⁴. Selbst wenn mikrobielle Gemeinschaften den Huhneileiter⁵ bewohnen, ist der Inhalt eines Eies, das von einer gesunden Henne frisch gelegt wurde, meist frei von Mikroorganismen, wobei die Eierschale und die Membranen mechanische Barrieren besitzen, um eine Invasion von Mikroorganismen zu vermeiden⁴. Darüber hinaus werden Küken in Abwesenheit ihrer Verwandten leicht aufgezogen, was im Gegensatz zu Säugetieren die Produktion keimfreier Tiere ohne elterliche Aufzucht unter sterilen Bedingungen ermöglicht.

Die Versuchsanlage "Infektiologie von Nutztieren, Modellen und Wildtieren" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Frankreich, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) ist Teil des französischen nationalen Infrastrukturnetzes EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE beherrscht die Produktion von keimfreien Hühnern, um seit mehr als 40 Jahren verschiedene experimentelle Studien durchzuführen 7,8,9,10,11. Diese Tiere wurden aus spezifischen pathogenfreien (SPF) Eiern einer weißen Leghorn-Legelinie hergestellt, die seit den 1970er Jahren in geschlossener Zucht gezüchtet wurde. Hauptsächlich für mikrobiologische Studien verwendet ^7,8,9, erleben keimfreie Vögel ein Wiederaufleben des Interesses mit Fragen wie dem Beitrag der Darmmikrobiota zum Verhalten 13, Nährstoffverwertung 14^, Immunentwicklung ¹⁵ und endokriner Aktivität. Auch wenn einige Studien mit keimfreien Masthähnchenlinien¹⁶ veröffentlicht wurden, bleiben diese Studien im Vergleich zu Studien mit experimentellen Schichtlinien unterrepräsentiert. Die Entwicklung wissenschaftlicher Fragen hin zum Crosstalk zwischen der Mikrobiota und ihrem Wirt in Bezug auf Geflügelgesundheit und -wohlergehen hat uns dazu veranlasst, unser historisches Protokoll anzupassen, um keimfreie Masthähnchen der Ross PM3-Linie, der weltweit am häufigsten verwendeten Masthähnchenlinie, herzustellen.

Protokoll

Die Tierpflegeverfahren wurden gemäß den Leitlinien der Richtlinie 86/609/EWG des Rates der Europäischen Gemeinschaften und der französischen Tierversuchsverordnung durchgeführt.

1. Isolator-Vorbereitung

1. Legen Sie die erforderlichen Materialien unter Überdruck in einen starren Isolator ein: 50 ml Röhrchen, 5, 10 und 25 ml Kunststoffpipetten, bestrahltes Futter, autoklaviertes Wasser und steril verschlossene Kunststoffbehälter.
2. Füllen Sie die keimtötende Transferfalle mit einer 2% igen quartären Ammoniumlösung.
3. Sterilisieren Sie den Isolator dreimal mit Formaldehyddampf, indem Sie 60 ml Formalin (24% Formaldehyd) zu 30 g Kaliumpermanganat pro Kubikmeter (m³⁾ hinzufügen. Bewegen Sie die Materialien im Inneren des Isolators zwischen den einzelnen Sterilisationen, um die Sterilisation aller Kontaktflächen sicherzustellen.
4. Stellen Sie die Isolatortemperatur für mindestens 2 Tage auf 37 °C ein, bevor die Eier eingeführt werden. Stellen Sie das Hygrometer am Tag der Einführung auf 65-70% der relativen Luftfeuchtigkeit (RH) ein.

2. Eizellentnahme und -inkubation

1. Sammeln Sie die Eier von Betrieben, die auf der Grundlage einer guten Schlupfrate der Legehennen (mindestens 80% auf dem Höhepunkt der Eierproduktion) und ihres guten Gesundheitszustands (d. h. Fehlen von Geflügelpathogenen und Fehlen von Krankheiten innerhalb der Herde) ausgewählt wurden. Wählen Sie auf dem Laufband optisch saubere und makellose Eier aus.
2. Dekontaminieren Sie sofort die Eioberfläche, indem Sie sie für 5 Minuten in eine 1,5% ige Peressigsäurelösung bei Raumtemperatur tauchen.
3. Transportieren Sie die Eier mit einer mit Formaldehyddampf dekontaminierten Box zur Versuchsanlage.
4. Lagern Sie die Eier 24 Stunden bei 4 °C. Wiederholen Sie den in Schritt 2.2 beschriebenen Dekontaminationsvorgang, und legen Sie sie 19 Tage lang in einen Brutkasten (Tag 0).

3. Schraffur

1. Überprüfen Sie am 19. Tag die Fruchtbarkeit, die Lebensfähigkeit (Motilität) und die Embryonalentwicklung, indem Sie sie mit einem hellen Eierkerzen unter sterilen Bedingungen kandieren. Geben Sie nur lebende embryonierte Eier in die sterilen Brutisolatoren ein.
2. Dekontaminieren Sie die ausgewählten Eier, indem Sie 1,5% ige Peressigsäurelösung für 30 s sprühen oder bis die gesamte Oberfläche jedes Eies bedeckt ist. Die Eier bleiben während des Transfers in Isolatoren 16 Minuten und 30 s in Kontakt mit dem Spray.
3. Übertragen Sie die Eier in die sterilen Schlupfisolatoren und spülen Sie sie mit sterilem demineralisiertem Wasser ab, bevor Sie sie in den Schlupfraum legen.
   HINWEIS: Die Tiere werden in sterilen Isolatoren geschlüpft und aufgezogen. Sie werden ad libitum mit einer kommerziellen Diät gefüttert, die durch Gammabestrahlung sterilisiert und mit autoklaviertem Leitungswasser bewässert wird, das von Wasserspendern bereitgestellt wird.

4. Bakteriologische Zustandsanalyse

1. Nehmen Sie einen Tag nach dem Schlüpfen eine Stuhlprobe direkt aus dem Rektum verschiedener Küken und sammeln Sie sie in einem sterilisierten Glasröhrchen, um diese Probe repräsentativ für alle Tiere in einem bestimmten Isolator zu machen.
2. Da die Stuhlproben mehr oder weniger flüssig sind, fügen Sie ein Äquivalent von 1 ml Stuhl zu 9 ml Thioglycolatbrühe mit Resazurin hinzu. Fügen Sie die verbleibende Stuhlprobe zu 9 ml Hirnherzinfusionsbrühe (BHI) hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C ohne Schütteln für 18 bis 48 h. Dies wird das Wachstum einer breiten Palette von aeroben, fakultativen aeroben und nicht anspruchsvollen anaeroben Arten ermöglichen.
   HINWEIS: Thioglycolatbrühe mit Resazurin ist für den Nachweis von nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien vorgesehen, ermöglicht aber auch den Nachweis von aeroben Bakterien. Dieses Medium entspricht den europäischen, amerikanischen und japanischen Arzneibüchern für Sterilitätstests^18,19,20.
3. Beobachten Sie visuell, ob nach 18 Stunden Inkubation eine Veränderung in den Wachstumsmedien auftritt. Nach 48 h nehmen Sie einen Tropfen aus dem BHI-Stuhlbrühemedium, legen Sie es auf einen Glasobjektträger und beobachten Sie unter einem Mikroskop (40-fache Vergrößerung) die Abwesenheit oder Anwesenheit von Bakterien.
4. Wenn der Verdacht auf das Vorhandensein von Bakterien besteht, nehmen Sie eine Probe aus der BHI-Kultur und säen Sie sie auf BHI-Agarplatten aus. Bei 37 °C für 18 bis 48 h inkubieren.
5. Wenn Kolonien vorhanden sind, führen Sie Hochdurchsatztechniken wie die MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur präzisen mikrobiellen Identifizierung durch.
   HINWEIS: Nach 72 h, wenn die bakteriologischen Analysen negativ sind, werden die Tiere für keimfrei erklärt.

Ergebnisse

Sechs Läufe der keimfreien Kükengeneration wurden mit Ross PM3-Eiern aus zwei verschiedenen französischen Betrieben durchgeführt (Tabelle 1). Insgesamt wurden 853 Eier gesammelt und nach zwei Dekontaminationsschritten und 19 Tagen Inkubation waren 86,40% lebensfähig. 490 dieser lebensfähigen Eier durchliefen einen dritten Dekontaminationsschritt und wurden in verschiedene Schlupfisolatoren eingeführt, was einer durchschnittlichen Schlupfrate von 79,80% entspricht. Dies entspricht einer Schlupfrate von 68,94% im Vergleich zur ursprünglichen Anzahl der gesammelten Eier.

Die Brutergebnisse variieren jedoch je nach durchgeführter Serie erheblich: von 41,67% bis 88,16% der lebensfähigen Küken im Vergleich zur Anzahl der gesammelten Eier. Diese Variationen wurden auch zwischen den verschiedenen Luken während desselben Experiments beobachtet. Da nicht alle Isolatoren für alle Durchläufe verwendet wurden, ist es schwierig, einen isolatorabhängigen Effekt auszuschließen. Dieser Chargeneffekt korrelierte jedoch direkt mit dem Alter der Legehennen (Abbildung 1), wo Eier von älteren Hühnern weniger lebensfähig waren.

Die sechs Läufe wurden mit vier verschiedenen Schraffurisolatoren durchgeführt. Nach bakteriologischer Kontrolle wurde bestätigt, dass die Tiere aus 14 der 16 Isolatoren keimfrei sind. Dies entspricht einer Erfolgsquote von 87,5%. Die beiden verbleibenden Isolatoren waren durch ein einziges umweltbedingtes und nichtpathogenes Bakterium kontaminiert.

Alle Tiere, die für die wissenschaftlichen Experimente verwendet wurden, blieben bis zum Ende der Studien für mindestens drei Wochen nach dem Schlüpfen keimfrei.

Abbildung 1: Einfluss des Hühneralters auf die Schlüpfrate Die vorliegende Abbildung zeigt die beobachteten Schlupfraten auf der Grundlage des Alters der Legehennenherde, ausgedrückt in Wochen des Legens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

	Gesammelte Eier	D19 lebensfähige Eier	D19 lebensfähige Eier/gesammelte Eier	Eier, die in Isolator 1 überführt werden	Eier, die in Isolator 2 überführt werden	Eier, die in Isolator 3 überführt werden	Eier, die in Isolator 4 überführt werden	Gesamtzahl der übertragenen Eier	lebensfähige Küken, die in Isolator 1 geschlüpft sind	lebensfähige Küken, die in Isolator 2 geschlüpft sind	lebensfähige Küken, die in Isolator 3 geschlüpft sind	lebensfähige Küken, die in Isolator 4 geschlüpft sind	Gesamtzahl der lebensfähigen geschlüpften Küken	lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier1	lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier2	lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier3	lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier4	lebensfähige geschlüpfte/transferierte Eier weltweit
Lauf 1	101	93	92.08%	23	24	-	-	47	22	23	-	-	45	95.65%	95.83%			95.74%
Lauf 2	130	117	90.00%	25	25	25		75	20	24	18	-	62	80.00%	96.00%	72.00%		82.67%
Lauf 3	132	97	73.48%	26	-	26	45	97	14	-	13	28*	27	53.85%		50.00%	62.22%	56.70%
Lauf 4	130	116	89.23%	36	35	-	-	71	33	34	-	-	67	91.67%	97.14%			94.37%
Lauf 5	180	148	82.22%	30	30	30	30	120	26*	25	17	24	66	86.67%	83.33%	56.67%	80.00%	76.67%
Lauf 6	180	166	92.22%	-	40	40	-	80	-	35	35	-	70	86.67%	87.50%	87.50%		87.50%
Gesamt	853	737	86.40%	140	154	121	75	490	89	141	83	24	337	82.14%	91.56%	68.60%	69.33%	79.80%

Tabelle 1: Technische Ergebnisse der verschiedenen Schraffurexperimente. Die vorliegende Tabelle zeigt die Ergebnisse der 6 durchgeführten Serien keimfreier Schlupflöcher: Anzahl der gesammelten Eier, Lebensfähigkeit des Embryos nach 19 Tagen und lebensfähige geschlüpfte Küken in den verschiedenen Isolatoren.

Diskussion

Mehrere Methoden zur Erzeugung keimfreier Hühner wurden zuvor beschrieben 7,21,22. Einfache Methoden, wie die hier vorgestellte, verwenden verschiedene Desinfektionsmittel, um die Keimbelastung in der Eioberfläche und in den Isolatoren zu reduzieren. Die am häufigsten verwendeten Desinfektionsmittel sind Quecksilberchlorid, quartäres Ammonium, Jodform, Natriumhypochlorit und Chlordioxidlösungen. Die Ergebnisse sind oft zufriedenstellend. Trotz der Zugänglichkeit dieser Methoden können jedoch nur wenige Strukturen die Methode anwenden und die Tiere in großem Maßstab aufziehen, was die Verwendung keimfreier Hühner zu einem relativ seltenen Ansatz macht, der nur zur Beantwortung sehr spezifischer wissenschaftlicher Fragen verwendet wird. Die hier beschriebenen Methoden, Materialien und Geräte ermöglichen einen hocheffizienten Schlüpfanteil keimfreier Masthähnchen, die mindestens 3 Wochen (die Dauer der wissenschaftlichen Experimente, zu denen sie hergestellt wurden) gesund und steril bleiben.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Anpassung des Protokolls an die Produktion keimfreier Küken aus Eiern, die in kommerziellen Geflügelfarmen gesammelt wurden, erfolgreich ist. Die Erfahrung mit der SPF-Eierproduktion zeigt, dass die Schlupfeffizienz in erster Linie vom Alter der Legehennen und von der Qualität der gesammelten Eier abhängt. Beide Parameter wurden bei der Auswahl der Betriebe und der Sammlung der Eier berücksichtigt. Mit der gleichen Methode ist die durchschnittliche Schlüpfrate von keimfreien Masthähnchen viel besser als bei der letzten Produktion von SPF-Legehennen in unserer Anlage (79% gegenüber 35%), ohne die Tiersterilität zu beeinträchtigen (87% vs. 83%). Diese Unterschiede können mit dem genetischen Hintergrund der Vögel (Masthähnchen versus Schichten) sowie mit der Qualität der Eierschale zusammenhängen, die in den Eiern der SPF-Tiere, die seit mehr als 40 Jahren in geschlossener Zucht gehalten werden, anfälliger ist. Darüber hinaus zeigen wir auch, dass der Transport von mehr als 2 h (von den Farmen zur Versuchsanlage) die Schlupfeffizienz und -qualität nicht beeinträchtigt.

Obwohl der Sterilisationsprozess für Schlüpfisolatoren und das Protokoll für die Eizelldekontamination optimiert wurden, waren rund 10% der Isolatoren nicht keimfrei. Um den Ursprung der Kontamination zu verstehen, ist es sehr wichtig, eine routinemäßige Sterilitätskontrolle der geschlüpften Isolatoren vor der Eieinführung durchzuführen.

In Bezug auf den Sterilitätsstatus der Vögel haben wir versucht, Methoden anzuwenden, die das Wachstum von aeroben und nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien aus Stuhlproben ermöglichen und so sicherstellen, dass wir lebende, lebensfähige Bakterien nachweisen. Diese Methoden entsprechen den internationalen Arzneibüchern für Sterilitätstests und stellen schnelle, einfache und kostenreduzierte Techniken dar, die routinemäßig angewendet werden können. Molekularbiologische Techniken wie die 16S rRNA-Gensequenzierung geben zwar keine Informationen über die Lebensfähigkeit von Bakterien, können jedoch zur Bestätigung des Vorhandenseins nicht kultivierbarer Bakterien eingesetzt werden. Tatsächlich deutete eine kürzlich durchgeführte Studie darauf hin, dass einige Bakterien der mütterlichen Eileitermikrobiota durch das Eiweiß auf den Embryo übertragen zu werden scheinen und später den größten Teil der embryonalen Darmbakterienpopulation^{ausmachen 5}. Darüber hinaus deutete eine andere Studie darauf hin, dass ein Teil der mikrobiellen Kolonisatoren, die in frühen Embryonen untergebracht waren, von mütterlichen Hühnern vererbt wurden und die mikrobielle Häufigkeit und Vielfalt des Darms später durch Umweltfaktoren und Wirtsgenetik während der Entwicklung^{beeinflusst wurden 23}. Die Ergebnisse dieser Studien basieren jedoch auf DNA-Sequenzanalysen, bei denen eine große Anzahl dieser Bakterien im Eiweiß (stark mit antimikrobiellen Molekülen beladen) tot oder nicht replizierbar sein könnte. Thomas und seine Mitarbeiter¹⁶ führten Sterilitätstests durch die Bewertung kultivierbarer aerober und fakultativer aerober Bakterien durch fäkales Abtropfen auf BHI-Platten durch und hoben so die Effizienz der bakteriologischen Standardmethoden zur keimfreien Sterilitätskontrolle hervor. Darüber hinaus haben wir in dem vorgeschlagenen Protokoll die Wachstumsüberwachung in Thioglycolatbrühe mit Resazurin verwendet, um das Wachstum von nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien nachweisen zu können.

Das Protokoll, das bereits für die Produktion von keimfreien Wachteln und Hühnern verwendet wird, ist an die Produktion von keimfreien Tieren aus den meisten Brutvögeln anpassbar und bietet Perspektiven für die Untersuchung des Beitrags der Mikrobiota zur Physiologie dieser Tiere. Neben der Verwendung dieses Modells zur Untersuchung gegenseitiger Interaktionen zwischen Wirt und Mikrobiota im Geflügeldarm könnte es auch für die angewandte Forschung nützlich sein. Zum Beispiel könnte es verwendet werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit von Probiotika aus Hühnerdarm-kommensalen Mikroorganismen zu bewerten, um die Gesundheit und Robustheit der Tiere zu verbessern.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL sterile plastic pipettes	Starsted	86.1252.001
50 mL tubes	Falcon
BHI agar plates	Thermo fisher diagnostic	PO1198A
Brain Heart Infusion broth	Thermo fisher diagnostic	CM1135
Glass tubes with 9 mL BHI broth			home made and sterilized by autoclaving
Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin			home made and sterilized by autoclaving
Hatching incubator	Fieme	MG 576
Incubator	Memmert		for bacteriological culture, 37 °C
Irradiated feed	Safe	U8983G10R	40 kG irradiated
Isolators			home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure
Microbiological safety cabinet	thermon electron corporation		model: Hera Safe
Microscope Visiscope series 300	VWR
Pipette aid	Drummond
Plastic pipettes
Sterile sealed boxes	Tuperware		diameter
Sterilized glass tube			"sovirel"
Thioglycolate Broth with Resazurin	Merck	90404-500G
Water bath	Fisher scientific		model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium