Mikrobiyota Çalışmaları için Ticari Bir Hattan Mikropsuz Hızlı Büyüyen Piliçlerin Üretimi

Özet

Burada, ticari bir piliç hattı olan Ross PM3'ün yumurtalarından mikropsuz civcivlerin üretilmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, diğer kanatlı hayvan türlerinden mikropsuz hayvanların üretimi için uyarlanabilir.

Özet

Bağırsak mikrobiyotasının konakçı fizyolojisine ve immün yeterliliğine katkısı üzerine yapılan çalışmalar, altın standart olarak kabul edilen mikropsuz hayvan modellerinin mevcudiyeti ile kolaylaştırılmaktadır. Yuvalama kuşları, mikropsuz hayvanların üretimi için ideal modellerdir, çünkü akrabalarını steril koşullar altında yetiştirmeye gerek yoktur. Mikropsuz tavuklar esas olarak, ticari tavuk hatlarını zayıf bir şekilde temsil eden spesifik patojensiz (SPF) deney hatlarından üretilir. Burada önerilen yöntem, kanatlı hayvan endüstrisi tarafından yaygın olarak kullanılan hızlı büyüyen piliç hattı Ross PM3'ten mikropsuz tavukların üretilmesine izin verdi. Bir piliç yetiştiricisi çiftliğine döşendikten sonra yumurtalar hızla toplandı. Toplamadan steril bir yumurtadan çıkma izolatörüne girmeye kadar sıkı bir dekontaminasyon işlemine tabi tutuldular. Civcivler yumurtadan çıkmış ve sterilitelerini kontrol etmek için gerekli olan süre boyunca bu steril izolatörlerde tutulmuştur. Başlangıçta deneysel bir SPF beyaz bacak boynuzu hattı için geliştirilen mevcut protokol sadece Ross PM3 piliç hattına değil, aynı zamanda bıldırcınlara da uyarlanmıştır. Bu nedenle, diğer kanatlı hayvan türlerine ve ekonomik, biyolojik veya ekolojik açıdan yuva yapan kuşlara karşı sağlam ve kolayca uyarlanabilir bir prosedürü temsil eder.

Giriş

Bağırsak mikrobiyotasının hayvan sağlığına katkısı ile ilgili bilimsel ve popüler ilgide çarpıcı bir artış olmuştur. Hayvanın bağırsağında farklı nişlerde yaşayan bakteri, virüs, mantar ve arkelerden oluşan mikrobiyota, sadece memeli türlerini değil, aynı zamanda kümes hayvanları gibi hayvancılığı da etkileyen enflamatuar, bulaşıcı ve metabolik hastalıkların düzenlenmesinde doğrudan veya dolaylı olarak rol oynar¹. Bağırsak mikrobiyotasının sağlık ve hastalığa katkısını daha iyi incelemek için çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir. Örneğin, mikropsuz ve gnotobiyotik hayvanlar, sırasıyla mikropların veya bilinen bir mikrobiyotanın tamamen yokluğunun, enfeksiyonların fizyopatolojisi üzerinde incelenmesine izin verir ^2,3. Bununla birlikte, bu hayvanları üretmek ve sürdürmek, özel teknikler ve tesisler gerektirir ve onları korumak için gereken maliyetler, emek ve beceriler birçok araştırmacıya erişimlerini sınırlar. Gerçekten de, mikropsuz hayvanlar, bakteri yetiştirme yöntemleri, mikroskopi, seroloji, brüt morfoloji ve dizileme tabanlı tespit tekniklerinin bir kombinasyonu kullanılarak olası kontaminasyon için düzenli olarak izlenmelidir. Benzer prosedürler, hayvanların genellikle daha büyük olduğu ve üreme ve bakımları için daha büyük tesisler gerektirdiği hayvancılık gibi diğer türler için de geçerlidir, bu da mikrobiyota üzerine araştırmaları bir dereceye kadar engelleyebilir.

Kümes hayvanları, daha spesifik olarak tavuklar, yılda 40 milyar kuşu aşabilen bir sürü nüfusu ile dünya çapında hayvancılık üretiminin temel taşıdır. Dünyadaki en önemli hayvansal protein kaynağıdır (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Dahası, tavukların yetiştirilmesi veya tüketilmesiyle ilgili kültürel veya dini tabular yoktur. Kanatlı hayvan bağırsak mikrobiyotası, diğer birçok besinsel, fizyolojik veya patolojik sürecin yanı sıra hayvanın büyümesinde, yem dönüşüm oranında, bağışıklığında, patojen direncinde önemli rol oynar⁴. Bu nedenle, mikrobiyota ve ev sahibi⁴ arasındaki diyaloğun altını çizmek için mikropsuz tavukların nesli vazgeçilmezdir. Mikrobiyal topluluklar tavuk yumurta kanalı^5'te yaşıyor olsa bile, sağlıklı bir tavuk tarafından taze olarak serilmiş bir yumurtanın içeriği çoğunlukla mikroorganizmalardan arındırılmıştır, yumurta kabuğu ve mikroorganizma istilasını önlemek için mekanik bariyerlere sahip zarlar⁴. Ek olarak, civcivler, memelilerin aksine, steril koşullar altında ebeveyn yetiştiriciliği olmadan mikropsuz hayvanların üretilmesine izin veren akrabalarının yokluğunda kolayca yetiştirilir.

"Çiftlik, Model ve Vahşi Hayvanların Enfeksiyonu" deneysel tesisi (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Fransa, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12), Fransız Ulusal Altyapı Ağı EMERG'IN'in (https://www.emergin.fr/) bir parçasıdır. PFIE, 40 yıldan fazla bir süredir çeşitli deneysel çalışmalar yapmak için mikropsuz tavukların üretiminde ustalaşmıştır 7,8,9,10,11. Bu hayvanlar, 1970'lerden beri kapalı ıslahta yetiştirilen beyaz bir bacak boynuzu döşeme hattından spesifik patojensiz (SPF) yumurtalardan üretilmiştir. Esas olarak mikrobiyolojik çalışmalar için kullanılan ^7,8,9 mikropsuz kuşlar, bağırsak mikrobiyotasının davranışa katkısı 13, besin kullanımı 14^, bağışıklık gelişimi¹⁵ ve endokrin aktivite gibi sorularla ilginin yeniden canlandığını yaşamaktadır. Mikropsuz piliç hatları¹⁶ kullanılarak bazı çalışmalar yayınlanmış olsa bile, bu çalışmalar deneysel katman çizgileri kullanan çalışmalara kıyasla yeterince temsil edilmemektedir. Mikrobiyota ile kümes hayvanı sağlığı ve refahındaki ev sahibi arasındaki çapraz konuşmaya yönelik bilimsel soruların evrimi, tarihsel protokolümüzü, dünyanın en çok kullanılan piliç tavuğu hattı olan Ross PM3 hattının mikropsuz piliçlerini üretmek için uyarlamamıza yol açtı.

Protokol

Hayvan bakım prosedürleri, Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi (86/609/EEC) ve hayvan deneylerine ilişkin Fransız yönetmelikleri tarafından belirlenen kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. İzolatör preparatı

1. Gerekli malzemeleri pozitif basınç altında sert bir izolatöre yerleştirin: 50 mL tüpler, 5, 10 ve 25 mL plastik pipetler, ışınlanmış besleme, otoklavlanmış su ve steril sızdırmaz plastik kaplar.
2. Transfer mikrop öldürücü tuzağı% 2'lik bir kuaterner amonyum çözeltisi ile doldurun.
3. Metreküp^(m3) başına 30 g potasyum permanganata ilave edilen 60 mL formalin (% 24 formaldehit) kullanarak izolatörün formaldehit buharı ile üç kez sterilize edilmesi. Tüm temas yüzeylerinin sterilizasyonunu sağlamak için izolatör içindeki malzemeleri her sterilizasyon arasında hareket ettirin.
4. Yumurtaları sokmadan önce izolatör sıcaklığını en az 2 gün boyunca 37 ° C'ye ayarlayın. Higrometreyi, giriş gününde bağıl nemin% 65-70'ine (RH) ayarlayın.

2. Yumurta toplama ve kuluçka

1. Yumurtaları, yumurtlayan tavukların iyi bir kuluçka oranına (yumurta üretiminin zirvesinde en az% 80) ve iyi sıhhi durumlarına (yani, yaygın kümes hayvanı patojenlerinin yokluğu ve sürü içinde hastalıkların yokluğu) dayanarak seçilen çiftliklerden toplayın. Koşu bandında görsel olarak temiz ve kusursuz yumurtalar seçin.
2. Yumurta yüzeyini, oda sıcaklığında% 1.5'lik bir perasetik asit çözeltisine 5 dakika batırarak derhal dekontamine edin.
3. Formaldehit buharı ile dekontamine edilmiş bir kutu kullanarak yumurtaları deney tesisine taşıyın.
4. Yumurtaları 4 °C'de 24 saat saklayın. Adım 2.2'de açıklanan dekontaminasyon işlemini tekrarlayın ve 19 gün boyunca kuluçkalık bir inkübatöre (Gün 0) yerleştirin.

3. Kuluçka

1. 19. Günde, doğurganlığı, canlılığı (hareketliliği) ve embriyo gelişimini, steril koşullar altında hafif bir yumurta mum makinesi kullanarak konserve ederek doğrulayın. Steril kuluçkalık izolatörlere sadece canlı embriyonlanmış yumurtaları sürün.
2. Seçilen yumurtaları, 30 s boyunca% 1.5 perasetik asit çözeltisi püskürterek veya her yumurtanın tüm yüzeyi kaplanana kadar dekontamine edin. Yumurtalar, izolatörlere transfer sırasında 16 dakika ve 30 s boyunca spreyle temas halinde kalacaktır.
3. Yumurtaları steril kuluçka izolatörlerine aktarın ve kuluçka boşluğuna yerleştirmeden önce steril demineralize su ile durulayın.
   NOT: Hayvanlar yumurtadan çıkar ve steril izolatörlerde yetiştirilir. Gama ışınlaması ile sterilize edilmiş ticari bir diyetle ad libitum ile beslenirler ve su dağıtıcıları tarafından sağlanan otoklavlanmış musluk suyuyla sulanırlar.

4. Bakteriyolojik durum analizi

1. Yumurtadan çıktıktan bir gün sonra, doğrudan farklı civcivlerin rektumundan bir dışkı örneği alın ve bu numuneyi belirli bir izolatör içindeki tüm hayvanları temsil etmek için sterilize edilmiş bir cam tüp içinde toplayın.
2. Dışkı örnekleri az ya da çok sıvı olduğundan, resazurin ile 9 mL tiyoglikolat et suyuna 1 mL dışkı eşdeğeri ekleyin. Kalan dışkı örneğini 9 mL beyin kalp infüzyonu suyuna (BHI) ekleyin ve tüpleri 18 ila 48 saat boyunca sallamadan 37 ° C'de inkübe edin. Bu, çok çeşitli aerobik, fakültatif aerobik ve titiz olmayan anaerobik türlerin büyümesine izin verecektir.
   NOT: Resizmarinli tioglikolat et suyu, titiz olmayan anaerobik bakterilerin tespiti için tasarlanmıştır, ancak aynı zamanda aerobik bakterilerin tespitini de sağlar. Bu ortam, sterilite testi için Avrupa, Amerika ve Japon farmakopelerine uygundur^18,19,20.
3. Büyüme ortamındaki herhangi bir değişikliğin 18 saatlik inkübasyondan sonra meydana gelip gelmediğini görsel olarak gözlemleyin. 48 saat sonra, BHI dışkı-et suyu ortamından bir damla alın, bir cam slayta yerleştirin ve bakterilerin yokluğu veya varlığı için mikroskop altında (40X büyütme) gözlemleyin.
4. Bakterilerin varlığına dair bir şüphe varsa, BHI kültüründen bir örnek alın ve BHI agar plakalarına tohumlayın. 18 ila 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
5. Koloniler varsa, hassas mikrobiyal tanımlama için MALDI-TOF kütle spektrometresi gibi yüksek verimli teknikler uygulayın.
   NOT: 72 saat sonra, bakteriyolojik analizler negatifse, hayvanlar mikropsuz ilan edilir.

Sonuçlar

İki farklı Fransız çiftliğinden gelen Ross PM3 yumurtaları ile altı adet mikropsuz civciv üretimi gerçekleştirilmiştir (Tablo 1). Toplam 853 yumurta toplandı ve iki dekontaminasyon adımından ve 19 günlük inkübasyondan sonra% 86.40'ı yaşayabilirdi. Bu canlı yumurtaların 490'ı üçüncü bir dekontaminasyon adımına tabi tutuldu ve ortalama% 79.80'lik bir kuluçka oranı için çeşitli kuluçka izolatörlerine sokuldu. Bu, toplanan ilk yumurta sayısına kıyasla% 68.94'lük bir kuluçka oranını temsil eder.

Bununla birlikte, kuluçka sonuçları, gerçekleştirilen seriye göre önemli ölçüde değişmektedir: toplanan yumurta sayısına kıyasla canlı civcivlerin% 41.67 ila% 88.16'sı. Bu varyasyonlar, aynı deney sırasında farklı kapaklar arasında da gözlendi. Tüm izolatörler tüm koşular için kullanılmadığından, izolatöre bağımlı bir etkiyi dışlamak zordur. Bununla birlikte, bu parti etkisi, yaşlı tavuklardan gelen yumurtaların daha az canlı olduğu yumurtlayan tavukların yaşı ile doğrudan ilişkiliydi (Şekil 1).

Altı çalışma, dört farklı kuluçkalık izolatör kullanılarak gerçekleştirildi. Bakteriyolojik kontrolden sonra, 16 izolatörün 14'ünden gelen hayvanların mikropsuz olduğu doğrulandı. Bu da %87,5'lik bir başarı oranına tekabül etmektedir. Kalan iki izolatör, tek bir çevresel ve patojenik olmayan bakteri tarafından kontamine edildi.

Bilimsel deneyler için kullanılan tüm hayvanlar, çalışmaların sonuna kadar, yumurtadan çıktıktan sonra en az üç hafta boyunca mikropsuz kaldı.

Resim 1: Tavuk yaşının kuluçka hızına etkisi Mevcut rakam, yumurtlama haftalarıyla ifade edilen yumurtlayan tavuk sürüsünün yaşına göre gözlemlenen kuluçka oranlarını vurgulamaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

	Toplanan yumurtalar	D19 canlı yumurta	D19 canlı yumurta/toplanan yumurtalar	İzolatöre aktarılan yumurtalar 1	İzolatöre aktarılan yumurtalar 2	İzolatöre aktarılan yumurtalar 3	İzolatöre aktarılan yumurtalar 4	transfer edilen yumurtaların toplamı	İzolatöre yumurtadan çıkan canlı civcivler 1	İzolatöre yumurtadan çıkan canlı civcivler 2	İzolatöre yumurtadan çıkan canlı civcivler 3	İzolatöre yumurtadan çıkan canlı civcivler 4	canlı yumurtadan çıkmış civcivlerin toplamı	canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurta izolatör1	canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurta izolatör2	canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurta izolatör3	canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurta izolatör4	küresel olarak canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurtalar
Koşu 1	101	93	92.08%	23	24	-	-	47	22	23	-	-	45	95.65%	95.83%			95.74%
Koşu 2	130	117	90.00%	25	25	25		75	20	24	18	-	62	80.00%	96.00%	72.00%		82.67%
Koşu 3	132	97	73.48%	26	-	26	45	97	14	-	13	28*	27	53.85%		50.00%	62.22%	56.70%
Koşu 4	130	116	89.23%	36	35	-	-	71	33	34	-	-	67	91.67%	97.14%			94.37%
Koş 5	180	148	82.22%	30	30	30	30	120	26*	25	17	24	66	86.67%	83.33%	56.67%	80.00%	76.67%
Koşu 6	180	166	92.22%	-	40	40	-	80	-	35	35	-	70	86.67%	87.50%	87.50%		87.50%
Toplam	853	737	86.40%	140	154	121	75	490	89	141	83	24	337	82.14%	91.56%	68.60%	69.33%	79.80%

Tablo 1: Farklı kuluçka deneylerinin teknik sonuçları. Bu tablo, gerçekleştirilen 6 seri mikropsuz kuluçkalamanın sonuçlarını vurgulamaktadır: toplanan yumurta sayısı, embriyonun 19 günde yaşayabilirliği ve çeşitli izolatörlerde canlı yumurtadan çıkmış civcivler.

Tartışmalar

Mikropsuz tavuklar üretmek için çeşitli yöntemler daha önce tanımlanmıştır 7,21,22. Burada sunulanlar gibi basit yöntemler, yumurta yüzeyindeki ve izolatörlerdeki bakteri yükünü azaltmak için farklı dezenfektanlar kullanır. En sık kullanılan dezenfektanlar merkürik klorür, kuaterner amonyum, iyodoform, sodyum hipoklorit ve klor dioksit çözeltileridir. Sonuçlar genellikle tatmin edicidir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin erişilebilirliğine rağmen, az sayıda yapı yöntemi uygulayabilir ve hayvanları büyük ölçekte yetiştirebilir, böylece mikropsuz tavukların kullanımını, yalnızca çok özel bilimsel soruları ele almak için kullanılan, nispeten nadir bir yaklaşım haline getirir. Burada açıklanan yöntemler, malzemeler ve ekipmanlar, en az 3 hafta boyunca sağlıklı ve steril kalan mikropsuz piliçlerin yüksek verimli bir kuluçka oranına izin verir (üretildikleri bilimsel deneylerin süresi).

Sonuçlar, protokolün ticari kanatlı hayvan çiftliklerinde toplanan yumurtalardan mikropsuz civcivlerin üretimine uyarlanmasının başarılı olduğunu göstermektedir. SPF yumurta üretimi ile ilgili deneyimler, kuluçka verimliliğinin öncelikle yumurtlayan tavukların yaşına ve toplanan yumurtaların kalitesine bağlı olduğunu ortaya koymaktadır. Çiftlikler seçildiğinde ve yumurtalar toplanırken her iki parametre de dikkate alınmıştır. Aynı yöntemi kullanarak, mikropsuz piliçlerin ortalama kuluçka oranı, tesisimizdeki SPF yumurtlayan tavukların son üretiminde elde edilenden (% 79'a karşı% 35), hayvan sterilitesini etkilemeden (% 87'ye karşı% 83) elde edilenden çok daha iyidir. Bu farklılıklar, kuşların genetik arka planıyla (piliçlere karşı katmanlar) ve SPF hayvanlarının yumurtalarında daha kırılgan olması muhtemel olan yumurta kabuğunun kalitesiyle ilişkili olabilir. Ayrıca, 2 saatten fazla (çiftliklerden deney tesisine) taşımanın kuluçka verimliliğini ve kalitesini etkilemediğini de gösteriyoruz.

Kuluçkalık izolatörler için kullanılan sterilizasyon işlemi ve yumurta dekontaminasyonu protokolü optimize edilmiş olmasına rağmen, izolatörlerin yaklaşık% 10'u mikropsuz değildi. Kontaminasyonun kökenini anlamak için, yumurtadan çıkan izolatörlerin yumurta girişinden önce rutin sterilite kontrolünün yapılması çok önemlidir.

Kuşların sterilite durumu ile ilgili olarak, dışkı örneklerinden aerobik ve titiz olmayan anaerobik bakterilerin büyümesine izin veren yöntemleri uygulamaya çalıştık, böylece canlı, canlı bakterileri tespit ettiğimizi sağladık. Bu yöntemler, sterilite testi için uluslararası farmakopelerle uyumludur ve rutin olarak kullanılacak hızlı, kolay ve maliyeti düşük teknikleri temsil eder. Bununla birlikte, 16S rRNA gen dizilimi gibi moleküler biyoloji teknikleri, bakteri canlılığı hakkında bilgi vermemekle birlikte, yetiştirilemeyen bakterilerin varlığının doğrulanması için uygulanabilir. Nitekim, yakın zamanda yapılan bir çalışma, maternal yumurta kanalı mikrobiyotasının bazı bakterilerinin yumurta akı yoluyla embriyoya aktarıldığını ve daha sonra embriyo bağırsak bakteri popülasyonunun çoğunu oluşturduğunu ileri sürmüştür⁵. Dahası, başka bir çalışma, erken embriyolarda barındırılan mikrobiyal kolonizatörlerin bir kısmının maternal tavuklardan miras alındığını ve bağırsak mikrobiyal bolluğunun ve çeşitliliğinin daha sonra gelişim sırasında çevresel faktörlerden ve konakçı genetiğinden etkilendiğini ileri sürdü²³. Bununla birlikte, bu çalışmaların sonuçları, bu bakterilerin büyük bir kısmının yumurta akında (büyük ölçüde antimikrobiyal moleküllerle yüklü) ölü olabileceği veya çoğalamayacağı DNA dizi analizine dayanmaktadır. Thomas ve işbirlikçileri¹⁶ , BHI plakalarına dışkı damlatma yoluyla yetiştirilebilir aerobik ve fakültatif aerobik bakterilerin değerlendirilmesi yoluyla sterilite testi gerçekleştirdi ve böylece mikropsuz sterilite kontrolü için standart bakteriyolojik yöntemlerin verimliliğini vurguladı. Ayrıca, önerilen protokolde, titiz olmayan anaerobik bakterilerin büyümesini tespit edebilmek için resazurin ile tiyoglikolat et suyunda büyüme izlemeyi kullandık.

Mikropsuz bıldırcınların ve tavukların üretimi için zaten kullanılan protokol, çoğu yuva yapan kuştan mikropsuz hayvanların üretimine uyarlanabilir ve bu hayvanların fizyolojisine mikrobiyota katkısının incelenmesi için perspektifler sunar. Bu modelin kümes hayvanı bağırsağındaki konakçı-mikrobiyota karşılıklı etkileşimlerini araştırmak için kullanılmasının yanı sıra, uygulamalı araştırmalar için de yararlı olabilir. Örneğin, hayvan sağlığını ve sağlamlığını iyileştirmek için tavuk bağırsağı komensal mikroorganizmalarından türetilen probiyotiklerin güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL sterile plastic pipettes	Starsted	86.1252.001
50 mL tubes	Falcon
BHI agar plates	Thermo fisher diagnostic	PO1198A
Brain Heart Infusion broth	Thermo fisher diagnostic	CM1135
Glass tubes with 9 mL BHI broth			home made and sterilized by autoclaving
Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin			home made and sterilized by autoclaving
Hatching incubator	Fieme	MG 576
Incubator	Memmert		for bacteriological culture, 37 °C
Irradiated feed	Safe	U8983G10R	40 kG irradiated
Isolators			home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure
Microbiological safety cabinet	thermon electron corporation		model: Hera Safe
Microscope Visiscope series 300	VWR
Pipette aid	Drummond
Plastic pipettes
Sterile sealed boxes	Tuperware		diameter
Sterilized glass tube			"sovirel"
Thioglycolate Broth with Resazurin	Merck	90404-500G
Water bath	Fisher scientific		model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium