ייצור של ברוילרים ללא חיידקים הגדלים במהירות מקו מסחרי ללימודי מיקרוביוטה

Summary

כאן אנו מתארים שיטה ליצירת אפרוחים ללא חיידקים מביצים של קו ברוילר מסחרי, Ross PM3. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לדור של בעלי חיים ללא חיידקים ממיני עופות אחרים.

Abstract

מחקרים על תרומת המיקרוביוטה של המעיים לפיזיולוגיה של המארח ולתכשירות חיסונית מתאפשרים הודות לזמינותם של מודלים של בעלי חיים נטולי חיידקים, הנחשבים לתקן הזהב. ציפורי קינון הן מודלים אידיאליים לייצור בעלי חיים ללא חיידקים, שכן אין צורך לגדל את קרוביהם בתנאים סטריליים. תרנגולות ללא חיידקים מופקות בעיקר מקווי ניסוי ספציפיים-נטולי פתוגנים (SPF), המייצגים בצורה גרועה קווי עוף מסחריים. השיטה שהוצעה כאן אפשרה ייצור של תרנגולות ללא חיידקים מקו הברוילרים הגדל במהירות רוס PM3, המשמש בדרך כלל את תעשיית העופות. הביצים נאספו במהירות לאחר הטלתן בחוות מגדלי תותחים. הם עברו תהליך טיהור קפדני מהאוסף ועד להקדמה בבידוד בקיעת ביצים סטרילי. האפרוחים בקעו ונשמרו במבודדים סטריליים אלה בתקופה הדרושה כדי לשלוט בעקרותם. הפרוטוקול הנוכחי, שפותח במקור עבור קו קרניים לבנים ניסיוני עם SPF, הותאם לא רק לקו ה-Ross PM3 broiler אלא גם לשליו. לפיכך הוא מייצג הליך חזק וניתן להתאמה בקלות למיני עופות אחרים ולציפורים מקננות בעלות רלוונטיות כלכלית, ביולוגית או אקולוגית.

Introduction

חלה עלייה דרמטית בהתעניינות המדעית והפופולרית בנוגע לתרומתה של המיקרוביוטה של המעיים לבריאות בעלי החיים. המיקרוביוטה, המורכבת מחיידקים, וירוסים, פטריות וארכיאה המאכלסים נישות שונות במעי החיה, מעורבת במישרין או בעקיפין בוויסות של מחלות דלקתיות, זיהומיות ומטבוליות המשפיעות לא רק על מיני יונקים אלא גם על בעלי חיים, כגון עופות¹. מספר מודלים של בעלי חיים פותחו כדי לחקור טוב יותר את התרומה של המיקרוביוטה של המעיים לבריאות ולמחלות. לדוגמה, בעלי חיים נטולי חיידקים וגנוטוביוטים מאפשרים לחקור את היעדרם המוחלט של מיקרובים או של מיקרוביוטה ידועה, בהתאמה, על הפיזיופתולוגיה של זיהומים ^2,3. עם זאת, יצירה ותחזוקה של בעלי חיים אלה דורשת טכניקות ומתקנים מיוחדים, והעלויות, העבודה והכישורים הנדרשים כדי לתחזק אותם מגבילים את גישתם לחוקרים רבים. ואכן, בעלי חיים ללא חיידקים חייבים להיות מנוטרים באופן קבוע לאיתור זיהום אפשרי באמצעות שילוב של שיטות גידול חיידקים, מיקרוסקופיה, סרולוגיה, מורפולוגיה גסה וטכניקות זיהוי מבוססות ריצוף. נהלים דומים חלים גם על מינים אחרים, כגון בעלי חיים, שבהם בעלי החיים בדרך כלל גדולים יותר ודורשים מתקנים גדולים יותר לצורך הרבייה והתחזוקה שלהם, מה שעלול לעכב, במידה מסוימת, את המחקר על המיקרוביוטה.

עופות, ליתר דיוק תרנגולות, הם אבן הפינה של ייצור בעלי חיים ברחבי העולם, עם אוכלוסיית להקות שעשויה לעלות על 40 מיליארד ציפורים בשנה. זהו המקור החשוב ביותר של חלבון מן החי בעולם (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). יתר על כן, אין טאבו תרבותי או דתי הקשור לגידול או לצריכה של תרנגולות. המיקרוביוטה של המעיים בעופות מעורבת באופן חשוב בגדילה של בעלי חיים, יחס המרת מזון, חסינות, עמידות בפני פתוגנים, בין תהליכים תזונתיים, פיזיולוגיים או פתולוגיים רבים אחרים⁴. הדור של תרנגולות ללא חיידקים הוא אפוא הכרחי כדי להדגיש את הדיאלוג בין המיקרוביוטה לבין המארח^{שלה 4}. גם אם קהילות מיקרוביאליות מאכלסות את עוף^{oviduct 5}, התוכן של ביצה שהוטלה זה עתה על ידי תרנגולת בריאה נקי ברובו ממיקרואורגניזמים, קליפת הביצה והממברנות בעלות מחסומים מכניים כדי למנוע פלישת מיקרואורגניזמים⁴. בנוסף, אפרוחים גדלים בקלות בהיעדר קרוביהם, אשר, בניגוד ליונקים, מאפשר ייצור של בעלי חיים ללא חיידקים ללא גידול הורי בתנאים סטריליים.

מתקן הניסוי "זיהום של חיות חווה, מודל וחיות בר" (PFIE, UE-1277, מרכז INRAE Val de Loire, Nouzilly, צרפת, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) הוא חלק מרשת התשתיות הלאומית הצרפתית EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE שולטת בייצור תרנגולות ללא חיידקים כדי לבצע מחקרים ניסיוניים שונים במשך יותר מ -40 שנה ^7,8,9,10,11. בעלי חיים אלה הופקו מביצים ספציפיות ללא פתוגנים (SPF) מקו הטלת קרן רגל לבן שגדל ברבייה סגורה מאז שנות ה-70 של המאה ה-20. ציפורים ללא חיידקים, המשמשות בעיקר למחקרים מיקרוביולוגיים ^7,8,9, חוות התעוררות מחודשת של עניין עם שאלות כמו תרומת המיקרוביוטה של המעיים להתנהגות¹³, ניצול מזין¹⁴, התפתחות מערכת החיסון¹⁵ ופעילות אנדוקרינית. גם אם חלק מהמחקרים פורסמו באמצעות קווי ברוילר¹⁶ נטולי חיידקים, מחקרים אלה עדיין אינם מיוצגים כראוי בהשוואה למחקרים המשתמשים בקווי שכבות ניסיוניים. האבולוציה של השאלות המדעיות לקראת ההצלבה בין המיקרוביוטה לבין המארח שלה בבריאות ורווחת העופות הובילה אותנו להתאים את הפרוטוקול ההיסטורי שלנו כדי לייצר ברוילרים נטולי חיידקים של קו Ross PM3, קו העוף הברוילר הנפוץ ביותר בעולם.

Protocol

נהלי הטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית (86/609/EEC) ועל ידי התקנות הצרפתיות בנושא ניסויים בבעלי חיים.

1. הכנת מבודד

1. הכנס את החומרים הדרושים לתוך מבודד קשיח בלחץ חיובי: צינורות 50 מ"ל, 5, 10 ו 25 מ"ל פיפטות פלסטיק, מזון מוקרן, מים אוטוקלאבים ומכלי פלסטיק אטומים סטריליים.
2. מלאו את מלכודת ההעברה עם תמיסת אמוניום רבעונית של 2%.
3. לעקר את המבודד שלוש פעמים עם אדי פורמלדהיד באמצעות 60 מ"ל של פורמלין (24% פורמלדהיד) בתוספת 30 גרם אשלגן פרמנגנט למטר מעוקב (m³). הזז את החומרים בתוך המבודד בין כל עיקור כדי להבטיח עיקור של כל משטחי המגע.
4. הגדר את טמפרטורת המבודד ל -37 מעלות צלזיוס למשך יומיים לפחות לפני החדרת הביצים. הגדר את מד המזמורים ל-65-70% מהלחות היחסית (RH) ביום ההקדמה.

2. איסוף ביצים ודגירה

1. אספו את הביצים מחוות שנבחרו על בסיס קצב בקיעתן הטוב של התרנגולות המטילות (לפחות 80% בשיא ייצור הביצים) ומצבן הסניטרי הטוב (כלומר, היעדר פתוגנים נפוצים של עופות והיעדר מחלות בתוך הצאן). בחר באופן חזותי ביצים נקיות וללא רבב על ההליכון.
2. נטרלו מיד את פני הביצה על ידי טבילתם למשך 5 דקות בתמיסת חומצה פראצטית של 1.5% בטמפרטורת החדר.
3. מעבירים את הביצים למתקן הניסוי באמצעות קופסה עם אדי פורמלדהיד.
4. אחסנו את הביצים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. חזרו על תהליך הפירוק המתואר בשלב 2.2, והניחו אותם בחממת בקיעה (יום 0) למשך 19 יום.

3. בקיעה

1. ביום ה-19, אמתו את הפוריות, את הכדאיות (תנועתיות) ואת התפתחות העובר על ידי תפירתם באמצעות נר ביצית קל בתנאים סטריליים. הכניסו רק ביצים שעברו עובר חי לתוך מבודדי הבקיעה הסטרילית.
2. נטרלו את הביצים שנבחרו על ידי ריסוס תמיסת חומצה פראצטית של 1.5% במשך 30 שניות או עד שכל פני השטח של כל ביצה מכוסים. ביצים ישמרו על קשר עם התרסיס במשך 16 דקות ו -30 שניות במהלך ההעברה למבודדים.
3. מעבירים את הביצים למבודדים הבוקעים הסטריליים ושוטפים אותן במים סטריליים שעברו דה-מינרליזציה לפני שמניחים אותן בחלל הבקיעה.
   הערה: בעלי חיים בוקעים ומגודלים מבודדים סטריליים. הם מוזנים ב-ad libitum בתזונה מסחרית המעוקרת על ידי הקרנת גמא ומושקים במי ברז אוטוקלביים המסופקים על ידי מתקני מים.

4. ניתוח מצב בקטריולוגי

1. יום אחד לאחר הבקיעה, קחו דגימת צואה ישירות מפי הטבעת של אפרוחים שונים ואספו אותם בצינור זכוכית מעוקר כדי להפוך דגימה זו למייצגת את כל בעלי החיים בתוך מבודד נתון.
2. דגימות הצואה הן פחות או יותר נוזליות, מוסיפות שווה ערך של 1 מ"ל של צואה ל -9 מ"ל של ציר thioglycolate עם resazurin. מוסיפים את דגימת הצואה הנותרת ל-9 מ"ל של ציר עירוי לב במוח (BHI) ומדגרים את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד במשך 18 עד 48 שעות. זה יאפשר צמיחה של מגוון רחב של מינים אירוביים אירוביים, אירוביים פקולטטיביים ואנאירוביים שאינם עמידים.
   הערה: ציר Thioglycolate עם resazurin מיועד לזיהוי של חיידקים אנאירוביים שאינם עמידים, אך הוא גם מאפשר זיהוי של חיידקים אירוביים. מדיום זה תואם את הפרמקופיאה האירופית, האמריקאית והיפנית לבדיקת סטריליות 18,19,20.
3. חזותית לראות אם כל שינוי במדיית הצמיחה מתרחשת לאחר 18 שעות של דגירה. לאחר 48 שעות, קחו טיפה ממדיית ציר הצואה של BHI, הניחו אותה על מגלשת זכוכית והתבוננו מתחת למיקרוסקופ (הגדלה של פי 40) להיעדר או נוכחות של חיידקים.
4. אם יש חשד לגבי נוכחותם של חיידקים, קחו דגימה מתרבית BHI וזרעו אותה על צלחות אגר BHI. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 48 שעות.
5. אם קיימות מושבות, בצע טכניקות בתפוקה גבוהה כגון ספקטרומטריית מסות MALDI-TOF לזיהוי מיקרוביאלי מדויק.
   הערה: לאחר 72 שעות, אם הניתוחים הבקטריולוגיים שליליים, בעלי החיים מוכרזים כנקיים מחיידקים.

תוצאות

שש ריצות של דור אפרוחים נטולי חיידקים נערכו עם ביצי רוס PM3 שהגיעו משתי חוות צרפתיות שונות (טבלה 1). בסך הכל נאספו 853 ביצים ולאחר שני שלבים של פירוק ו-19 ימי דגירה, 86.40% היו בני קיימא. 490 מהביצים הקיימות הללו עברו שלב פירוק שלישי והוכנסו לבידודים שונים של הבקיעה, לשיעור בקיעה ממוצע של 79.80%. נתון זה מייצג שיעור בקיעה של 68.94% בהשוואה למספר הביצים ההתחלתי שנאסף.

עם זאת, תוצאות הבקיעה משתנות באופן משמעותי בהתאם לסדרה שבוצעה: מ-41.67% ל-88.16% מהאפרוחים בני הקיימא בהשוואה למספר הביצים שנאספו. וריאציות אלה נצפו גם בין הפתחים השונים במהלך אותו ניסוי. מכיוון שלא כל המבודדים שימשו לכל הריצות, קשה להחריג השפעה התלויה במבודד. עם זאת, אפקט אצווה זה היה בקורלציה ישירה עם גילן של התרנגולות המטילות (איור 1), שם ביצים שהגיעו מתרנגולות מבוגרות יותר היו פחות בנות קיימא.

שש הריצות בוצעו באמצעות ארבעה מבודדי בקיעה שונים. לאחר בקרה בקטריולוגית, אושר כי בעלי החיים מ-14 מתוך 16 המבודדים היו נקיים מחיידקים. זה מתאים לשיעור הצלחה של 87.5%. שני המבודדים הנותרים היו מזוהמים על ידי חיידק סביבתי אחד ולא פתוגני.

כל בעלי החיים ששימשו לניסויים המדעיים נותרו נקיים מחיידקים עד סוף המחקרים, במשך שלושה שבועות לפחות לאחר הבקיעה.

איור 1: השפעת גיל התרנגולת על קצב הבקיעה הנתון הנוכחי מדגיש את שיעורי הבקיעה שנצפו על סמך גילו של עדר התרנגולות המטיל, שבא לידי ביטוי בשבועות של שכבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

	ביצים שנאספו	D19 ביצים בנות קיימא	D19 ביצים בנות קיימא/ביצים שנאספו	ביצים שהוכנסו למבודד 1	ביצים שהועתקו למבודד 2	ביצים שהוכנסו למבודד 3	ביצים שהועתקו למבודד 4	סה"כ הביצים המועברות	אפרוחים בני קיימא בקעו לתוך מבודד 1	אפרוחים בני קיימא בקעו לתוך מבודד 2	אפרוחים בני קיימא בקעו לתוך מבודד 3	אפרוחים בני קיימא בקעו למבודד 4	סה"כ אפרוחים בוקעים בני קיימא	מבודד ביצים בוקעות/מועברות בר קיימא1	מבודד ביצים בוקעות/מועברות בר קיימא2	מבודד ביצים בוקעות/מועברות בר קיימא3	מבודד ביצים בוקעות/מועברות בר קיימא4	ביצים ברות קיימא שבקעו/הועברו ברחבי העולם
ריצה 1	101	93	92.08%	23	24	-	-	47	22	23	-	-	45	95.65%	95.83%			95.74%
ריצה 2	130	117	90.00%	25	25	25		75	20	24	18	-	62	80.00%	96.00%	72.00%		82.67%
ריצה 3	132	97	73.48%	26	-	26	45	97	14	-	13	28*	27	53.85%		50.00%	62.22%	56.70%
ריצה 4	130	116	89.23%	36	35	-	-	71	33	34	-	-	67	91.67%	97.14%			94.37%
ריצה 5	180	148	82.22%	30	30	30	30	120	26*	25	17	24	66	86.67%	83.33%	56.67%	80.00%	76.67%
ריצה 6	180	166	92.22%	-	40	40	-	80	-	35	35	-	70	86.67%	87.50%	87.50%		87.50%
סך	853	737	86.40%	140	154	121	75	490	89	141	83	24	337	82.14%	91.56%	68.60%	69.33%	79.80%

טבלה 1: תוצאות טכניות של ניסויי הבקיעה השונים. הטבלה הנוכחית מדגישה את התוצאות של 6 סדרות של בקיעה ללא חיידקים שבוצעו: מספר הביציות שנאספו, הכדאיות של העובר ב -19 יום וגוזלים בקעו בר קיימא במבודדים השונים.

Discussion

מספר שיטות ליצירת תרנגולות ללא חיידקים תוארו בעבר ^7,21,22. שיטות פשוטות, כמו זו המוצגת כאן, משתמשות בחומרי חיטוי שונים כדי להפחית את עומס החיידקים בפני השטח של הביצה ובמבודדים. חומרי החיטוי הנפוצים ביותר הם כספית כלוריד, אמוניום רבעוני, יודופורם, נתרן היפוכלוריט ותמיסות כלור דו חמצני. התוצאות הן לעתים קרובות משביעות רצון. עם זאת, למרות הנגישות של שיטות אלה, מעטים המבנים שיכולים ליישם את השיטה ולגדל את בעלי החיים בקנה מידה גדול, ובכך להפוך את השימוש בתרנגולות ללא חיידקים לגישה נדירה יחסית, המשמשת רק כדי לענות על שאלות מדעיות ספציפיות מאוד. השיטות, החומרים והציוד המתוארים כאן מאפשרים שיעור בקיעה יעיל ביותר של יצורים ללא נבטים, שנשארים בריאים וסטריליים למשך 3 שבועות לפחות (משך הניסויים המדעיים שאליהם הם יוצרו).

התוצאות מראות כי התאמת הפרוטוקול לייצור אפרוחים ללא חיידקים מביצים שנאספו בחוות עופות מסחריות היא מוצלחת. הניסיון בייצור ביצי SPF מגלה כי יעילות הבקיעה תלויה בעיקר בגיל התרנגולות המטילות ובאיכות הביצים שנאספו. שני הפרמטרים נלקחו בחשבון כאשר נבחרו חוות וביצים נאספו. באותה שיטה, שיעור הבקיעה הממוצע של תרנגולות ללא נבטים הוא הרבה יותר טוב מזה שהושג בייצור האחרון של תרנגולות מינון SPF במתקן שלנו (79% לעומת 35%), מבלי להשפיע על עקרות בעלי החיים (87% לעומת 83%). הבדלים אלה עשויים להיות קשורים לרקע הגנטי של הציפורים (broilers לעומת שכבות) כמו גם לאיכות קליפת הביצה, אשר סביר להניח להיות שברירית יותר בביצים של בעלי החיים SPF, המוחזקים ברבייה סגורה במשך יותר מ -40 שנה. יתר על כן, אנו גם מראים כי הובלה של יותר מ 2 שעות (מן החוות למתקן הניסוי) אינו משפיע על יעילות הבקיעה ואיכות.

אף על פי שתהליך העיקור המשמש לבקיעת מבודדים והפרוטוקול לפירוק ביצים עברו אופטימיזציה, כ-10% מהמבודדים לא היו נקיים מחיידקים. על מנת להבין את מקור הזיהום, חשוב מאוד לבצע בקרת סטריליות שגרתית של מבודדי הבקיעה לפני הכנסת הביצים.

בנוגע למצב הסטריליות של הציפורים, ניסינו ליישם שיטות המאפשרות צמיחה של חיידקים אנאירוביים אירוביים ולא עמידים מדגימות צואה, ובכך להבטיח שאנו מזהים חיידקים חיים בני קיימא. שיטות אלה תואמות את הפרמקופיות הבינלאומיות לבדיקות סטריליות ומייצגות טכניקות מהירות, קלות ומופחתות עלויות לשימוש שגרתי. עם זאת, ניתן ליישם טכניקות ביולוגיה מולקולרית כגון ריצוף גנים של 16S rRNA, אם כי לא נותנות מידע על כדאיות החיידקים, לאישור נוכחותם של חיידקים שאינם ניתנים לעיבוד. ואכן, מחקר שנערך לאחרונה העלה את ההשערה כי חלק מהחיידקים של המיקרוביוטה האימהית אובידוקט מועברים לעובר דרך חלבון הביצית, ובהמשך מהווים את רוב אוכלוסיית חיידקי המעיים העוברית⁵. יתר על כן, מחקר אחר העלה את ההשערה כי חלק מהמתיישבים המיקרוביאליים שהוכנסו לעוברים מוקדמים עברו בתורשה מתרנגולות אימהיות, והשפע והמגוון המיקרוביאליים של המעיים הושפעו מאוחר יותר מגורמים סביבתיים ומגנטיקה של המארחים במהלך התפתחות²³. עם זאת, תוצאות המחקרים האלה מבוססות על ניתוח רצף דנ"א, שבו מספר גדול של חיידקים אלה יכולים להיות מתים או לא ניתנים לשכפול בחלבון הביצה (עמוס מאוד במולקולות אנטי-מיקרוביאליות). תומס ושותפיו¹⁶ ביצעו בדיקות סטריליות באמצעות הערכה של חיידקים אירוביים אירוביים וסיפקטיביים הניתנים לעיבוד באמצעות הטלת צואה על צלחות BHI, ובכך הדגישו את היעילות של שיטות בקטריולוגיות סטנדרטיות לבקרת סטריליות ללא חיידקים. יתר על כן, בפרוטוקול המוצע, השתמשנו בניטור גדילה בציר תיוגליקולאט עם רזאורין כדי להיות מסוגלים לזהות את הצמיחה של חיידקים אנאירוביים שאינם עמידים.

הפרוטוקול, שכבר שימש לייצור שליו ותרנגולות ללא נבטים, ניתן להתאמה לייצור בעלי חיים נטולי חיידקים מרוב הציפורים המקננות ומציע נקודות מבט לחקר תרומת המיקרוביוטה לפיזיולוגיה של בעלי חיים אלה. מלבד השימוש במודל זה כדי לחקור את האינטראקציות ההדדיות בין פונדקאי למיקרוביוטה במעי העופות, הוא עשוי להיות שימושי גם למחקר יישומי. לדוגמה, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את הבטיחות והיעילות של פרוביוטיקה שמקורה במיקרואורגניזמים של המעיים כדי לשפר את בריאותם ועמידותם של בעלי החיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL sterile plastic pipettes	Starsted	86.1252.001
50 mL tubes	Falcon
BHI agar plates	Thermo fisher diagnostic	PO1198A
Brain Heart Infusion broth	Thermo fisher diagnostic	CM1135
Glass tubes with 9 mL BHI broth			home made and sterilized by autoclaving
Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin			home made and sterilized by autoclaving
Hatching incubator	Fieme	MG 576
Incubator	Memmert		for bacteriological culture, 37 °C
Irradiated feed	Safe	U8983G10R	40 kG irradiated
Isolators			home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure
Microbiological safety cabinet	thermon electron corporation		model: Hera Safe
Microscope Visiscope series 300	VWR
Pipette aid	Drummond
Plastic pipettes
Sterile sealed boxes	Tuperware		diameter
Sterilized glass tube			"sovirel"
Thioglycolate Broth with Resazurin	Merck	90404-500G
Water bath	Fisher scientific		model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium