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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí se describe un protocolo para estudiar cómo el extracto de humo de cigarrillo afecta la colonización bacteriana en las células epiteliales pulmonares.

Resumen

El tabaquismo es la principal causa etiológica para el enfisema pulmonar y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Fumar cigarrillos también promueve la susceptibilidad a las infecciones bacterianas en el sistema respiratorio. Sin embargo, los efectos del tabaquismo en infecciones bacterianas en células epiteliales pulmonares humanas aún no se han estudiado a fondo. Aquí se describe un protocolo detallado para la preparación de extractos para fumar cigarrillos (CSE), tratamiento de células epiteliales pulmonares humanas con EEB, y la determinación de infecciones bacterianas e infecciones. CSE se preparó con un método convencional. Las células epiteliales pulmonares fueron tratadas con 4% de EEB durante 3 h. Las células tratadas con CSE fueron, entonces, infectadas con Pseudomonas a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las cargas bacterianas de las células fueron determinadas por tres métodos diferentes. Los resultados mostraron que la EEB aumentó la carga de Pseudomonas en las células epiteliales pulmonares. Este protocolo, por lo tanto, proporciona un enfoque simple y reproducible para estudiar el efecto del humo del cigarrillo en las infecciones bacterianas en las células epiteliales pulmonares.

Introducción

El tabaquismo afecta la salud pública de millones de personas en todo el mundo. Muchas enfermedades notorias, incluyendo el cáncer de pulmón y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), se han notificado relacionadas con el tabaquismo1,2. Fumar cigarrillos aumenta la susceptibilidad a las infecciones microbianas agudas en el sistema respiratorio3,4,5. Además, la creciente evidencia demuestra que fumar cigarrillos mejora la patogénesis de muchos trastornos crónicos6,,7,,8. Por ejemplo, fumar cigarrillos puede aumentar las infecciones virales o bacterianas que causan exacerbación de la EPOC9. Entre los patógenos bacterianos que contribuyen etiológicamente a la exacerbación aguda de la EPOC, un patógeno del bacilo gramnegativo oportunista, Pseudomonas aeruginosa,provoca infecciones que se correlacionan con los malos pronósticos y las mayores mortalidades10,11. La exacerbación de la EPOC empeora la enfermedad al acelerar la progresión patológica. No existen terapias eficaces contra la exacerbación de la EPOC, excepto para el manejo antisintomático12. La exacerbación de la EPOC promueve la mortalidad de los pacientes, disminuye la calidad de vida y aumenta la carga económica para la sociedad13.

Las vías respiratorias son un sistema abierto, sometido continuamente a diversos patógenos microbianos presentes externamente. Los patógenos bacterianos oportunistas se detectan generalmente en las vías respiratorias superiores, pero a veces se observan en las vías respiratorias inferiores14,15. En los modelos animales P. aeruginosa se puede detectar en sacos alveolares tan pronto como 1 h después de la infección16. Como un mecanismo de defensa importante, las células inmunitarias como los macrófagos o los neutrófilos eliminan las bacterias de las vías respiratorias. Las células epiteliales pulmonares, como la primera barrera fisiológica, desempeñan un papel único en la defensa del huésped contra las infecciones microbianas. Las células epiteliales pulmonares pueden regular la invasión microbiana, la colonización o la replicación independientemente de las células inmunitarias17. Algunas moléculas encontradas en las células epiteliales, incluyendo PPARg, ejercen funciones antibacterianas, regulando así la colonización bacteriana y la replicación en las células epiteliales pulmonares18. Fumar cigarrillos puede alterar las moléculas y afectar la función normal de defensa en las células epiteliales pulmonares19,20. Estudios recientes informaron de la exposición directa del humo del cigarrillo a las células epiteliales pulmonares utilizando el aparato robótico de fumar21,22. Sin embargo, la exposición al humo se puede realizar de otras maneras, incluida la aplicación de la EEB. La preparación de la EEB es un enfoque reproducible con posibles aplicaciones en otros tipos de células, incluidas las células endoteliales vasculares que están indirectamente expuestas al humo del cigarrillo.

Este informe describe un protocolo para generar extracto de humo de cigarrillo para alterar la carga bacteriana en las células epiteliales pulmonares. La EEB aumenta la carga bacteriana de P. aeruginosa,y puede contribuir a la recurrencia de infecciones bacterianas generalmente observadas en la exacerbación de la EPOC. Se utiliza un método convencional para la preparación de la EEB. Las células epiteliales pulmonares, en su etapa de crecimiento exponencial, se tratan con 4% de EEB durante 3 h. Alternativamente, las células epiteliales pulmonares cultivadas en monocapa pueden exponerse directamente al humo del cigarrillo en una interfaz aire-líquido. Las células tratadas con CSE se enfrentan a los desafíos con Pseudomonas en una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las bacterias se propagan a una velocidad de agitación particular para asegurar que la morfología de su flagela permanezca intacta para conservar toda su capacidad invasiva. La gentamicina se emplea para matar las bacterias que quedan en el medio de cultivo, reduciendo así la contaminación potencial durante la posterior determinación de la carga bacteriana. El protocolo también utiliza Pseudomonasetiquetada por GFP, que ha sido utilizado como una poderosa herramienta en el estudio de la infección por Pseudomonas en diferentes modelos. Una cepa representativa es Migula23de P. fluorescen. El grado de infección o carga bacteriana después del tratamiento de la CSE se determina de tres maneras: el método de placa de caída con recuento de colonias, PCR cuantitativo utilizando imprimaciones específicas de Pseudomonas 16S rRNA, o citometría de flujo en células infectadas con Pseudomonasfluorescentes. Este protocolo es un enfoque simple y reproducible para estudiar el efecto del humo del cigarrillo en las infecciones bacterianas en las células epiteliales pulmonares.

Protocolo

1. Preparación 100% CSE

  1. Dibuje 10 ml de medios de cultivo celulares libres de suero (DMEM/F12 para células BEAS-2B; medio basal de células epiteliales de las vías respiratorias para células HSAEC) en una jeringa de 60 ml.
  2. Fi reversely attach an appropriately trimmed 1 mL pipette tip to the nozzle of the syringe as an adapter to hold the cigarette (3R4F).
  3. Retire el filtro del cigarrillo. Coloque un cigarrillo en el adaptador de punta y peina el cigarrillo.
  4. Dibuje 40 ml de aire que contenga humo en 10 ml de medios libres de suero. Mezclar el humo con el medio agitando vigorosamente (30 s por dibujo).
  5. Repita el paso 1.4 aproximadamente 11x en 7 min hasta que el cigarrillo se queme por completo.
  6. Filtrar los 10 ml de medios ahumados con un filtro de 0,22 m para excluir cualquier microorganismo y partículas insolubles. Transfiera a un tubo estéril cerrado. Preparar el 100% CSE no más de 30 min antes del ensayo posterior.

2. Cultura Pseudomonas

  1. Inocular congelado P. aeruginosa (deformación PAO1) o P. fluorescens Migula (desgasitar PAO143) en una placa de agar de caldo de soja tríptico (TSB) para cultivo nocturno a 37oC.
    NOTA: Para obtener suficientes bacterias para el cultivo, esparza tantas bacterias en la placa de agar TSB como sea posible.
  2. Recoger un frotis bacteriano e incubar en 20 ml de TSB con 5% de glicerol como fuente de carbono.
  3. Agitar la suspensión bacteriana en una incubadora de 37oC a 200 rpm durante 1 h hasta que el OD600 valor sea 0,6.
    ADVERTENCIA: No deje que la velocidad de agitación supere las 200 rpm. Las velocidades de agitación más altas pueden dañar la morfología de la flagela bacteriana e impactar la invasión bacteriana en la epitelia pulmonar. Del mismo modo, limitar el tiempo de agitación a 1 h para obtener bacterias altamente invasivas. Mida el valor deOD 600 para estimar el número de bacterias. Un OD600 a 1 corresponde a 10unidades formadoras de colonias (CFU)/ml.

3. Cultivo celular epitelial pulmonar humano y tratamiento con EEB

  1. Cultivo de células BEAS-2B humanas en medio HITES (500 mL de DMEM/F12, 2,5 mg de insulina, 2,5 mg de transferrina, 2,5 mg de selenita sódica, 2,5 mg de transferrina, 10 m de hidrocortisona, 10 m β-estradiol, 10 mM HEPES y 2 mM de L-glutamina) complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) descrito anteriormente24.
  2. Cultivo de células epiteliales de vías respiratorias primarias humanas (HSAEC) en el medio de cultivo de células epiteliales de las vías respiratorias (500 ml de medio basal de células de las vías respiratorias, 500 g/ml de HSA, ácido linoleico de 0,6 m, Lecitina de 0,6 g/ml, 6 mM de L-glutamina, 0,4% de extracto P, 1,0 m de epinefrina, 5 g/ml de transferrina, 10 nM T3, hidrocortisona de 1 g/ml, ng ng/ml de rh/ mL y insulina de 5 g/ml). Incubar las células a 37oC en un 5% de CO2.
  3. Disociar las células con 1 ml de 0,25% de trippsina durante 5 min hasta que las células se desprenden completamente de la parte inferior de la placa.
  4. Añadir 10 ml de medio HITES completo para neutralizar la trippsina y recoger las células en un tubo de 15 ml. Centrifugar a 4oC a 300 x g durante 5 min.
    ADVERTENCIA: Controle cuidadosamente el tiempo para la digestión de la trippsina por microscopía, ya que la sobredigestión puede causar la muerte celular.
  5. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 2 ml de medio HITES con 10% de FBS.
  6. Pipetear 10 l de la suspensión celular anterior sobre la placa e insertarla en un contador de células automatizado para obtener la concentración en células/ml.
  7. Placa BEAS-2B células a una concentración de 3 × 105 células/ml en 6 placas de pozo en un volumen total de 2 ml en medio HITES complementado con 10% de FBS para cultivo nocturno.
  8. Tratar las células a aproximadamente 80% de confluencia, o 5 x 105 células/ml, con 4% CSE durante 3 h. Antes del tratamiento con CSE, cambie el medio con el medio HITES con el 1% de FBS.

4. Infección bacteriana

  1. Añadir P. aeruginosa o P. fluorescens Migula (1 ×10 7 CFU/mL) a cada pozo de las células tratadas con CSE e incubar durante 1 h a 37oC en 5% co2.
  2. Aspirar los sobrenadantes y reemplazarlos con 2 ml de medio HITES fresco para tratar con 4% de CSE y 100 g/ml de gentamicina.
    NOTA: La gentamicina se utiliza porque no puede penetrar las membranas celulares epiteliales pulmonares humanas. Por lo tanto, puede matar todas las bacterias en el medio, pero no las que invadieron las células epiteliales pulmonares.
  3. Después de 1 h de tratamiento con CSE/gentamicina a 37oC en 5% de CO2,aspirar los sobrenadantes y lavar las células 3x con PBS para la posterior determinación de la concentración bacteriana.
    NOTA: Para confirmar las bacterias internalizadas, se observaron células infectadas con P. fluorescens Migula con etiqueta GFP bajo microscopía fluorescente.

5. Determinación de la concentración bacteriana utilizando el método de placa de caída

  1. Para determinar la carga bacteriana en las células infectadas con el método de placa de gota, lave las células tratadas con gentamicina 2x con 2 ml de PBS frío.
  2. Agregue 1 ml de búfer de lelisis de celda (0,5% tritón X-100 en PBS) a cada pozo.
  3. Diluir los lysates celulares que contienen las bacterias internalizadas en un gradiente (1:10, 1:100, 1:1,000 y 1:10,000) para la siguiente inoculación a la placa de agar TSB.
  4. Después de 16 h de incubación, obtener los resultados de la CFU mediante el conteo de las colonias bacterianas.

6. Detección RT-qPCR de rRNA bacteriana 16S

  1. Tratar las células epiteliales pulmonares infectadas por Pseudomonas(1 x 106 células/ml) con gentamicina como se ha descrito anteriormente. Aspirar el medio y lavar las células 2x con 2 ml de PBS frío.
  2. Añadir 0,35 ml del tampón de lelisis de tiocianato de guanidiodium por pozo de una placa de 6 pozos. Recoger las células con un rascador de células. Pipetear el licate en un tubo de microcentrífuga y mezclar suavemente con la pipeta.
  3. Añadir el mismo volumen (0,35 ml) de etanol recién preparado al 70% de etanol en el izado y mezclar bien. Transfiera todas las muestras a una columna de centrifugado colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Centrifugar a 10.000 g para 30 s a 20–25 oC. A continuación, deseche el búfer en el tubo de recogida.
  4. Lave la columna con 0,7 ml de tampón de lavado 1. Centrifugar la columna a 10.000 x g durante 30 s. Lavar la columna 2x con 0,5 ml de tampón para lavar el ARN ligado a la membrana. Repita la centrifugación a 10.000 x g durante 2 min.
  5. Coloque la columna en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml. Añadir de 30 a 50 l de agua libre de RNase. Centrífuga a 10.000 g g durante 1 min. Recoger el flujo a través y medir la concentración de ARN.
  6. Realizar una reacción de transcripción inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante. Mezclar 1 g de ARN total con 10 ml de tampón de reacción, 1 ml de transcriptasa inversa y agua libre de RNase para una reacción de 20 ml. Llevar a cabo la reacción de transcripción inversa a 37 oC durante 1 h y luego 95 oC durante 5 min.
  7. Mezclar las plantillas de ADNc (1 l de cada reacción de transcripción inversa anterior), 5 l de la mezcla maestra que contiene tinte SYBR, 1 l de cada imprimación específica de 200 nM y agua en una mezcla de 20 ml para el siguiente análisis de PCR, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
    NOTA: Las siguientes son las imprimaciones dirigidas al rRNA 16S de P. aeruginosa:adelante 5o-CAAAACTACTGATATAGAGTACG-3o; reverso 5o-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3o. GAPDH se utilizó como control de carga con los siguientes imprimadores: adelante: 5o-GGCATGGACTGGTCATGA-3o; reverso: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3o.
  8. Utilice el método de TC comparativo para determinar la expresión.

7. Detección de Pseudomonas fluorescentes con citometría de flujo

  1. Tratar las células epiteliales pulmonares infectadas por Pseudomonasfluorescentes anteriores (1 x 106 células/ml) con gentamicina como se describió anteriormente. Aspirar el medio y lavar las células 2x con 2 ml de PBS frío.
  2. Analice las muestras con un citómetro de flujo a una longitud de onda de 509 nm para la detección de GFP. Termine cada lectura en 100.000 recuentos. Analizar los datos adquiridos con software relacionado.

Resultados

Un diagrama se utiliza para ilustrar el protocolo en la figura 1. Las células EPIteliales pulmonares BEAS-2B fueron tratadas con CSE y desafiadas con Pseudomonas. Pseudomonas en el medio de cultivo fueron asesinados por la gentamicina añadida y las células fueron sometidas al ensayo de placa de caída, la detección RT-qPCR de Pseudomonas ribosoma 16S ARN, y la citometría de flujo. En comparación con el control, el tratamiento con EEB aumentó sustancialmente ...

Discusión

La invasión bacteriana en células epiteliales pulmonares es un paso crucial en la patogénesis de las infecciones bacterianas. El proceso de invasión bacteriana en las células se puede dividir en los tres pasos siguientes: En primer lugar, las bacterias entran en contacto y se adhieren a la superficie de la célula epitelial utilizando su flagelo. En segundo lugar, las bacterias se someten a interiorización o penetran en la membrana celular. Finalmente, las bacterias replican y colonizan las células si escapan con ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de los Institutos Nacionales de Salud R01 HL125435 y HL142997 (a CZ).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
50mL syringeBD Biosciences
airway epithelial cell basal mediumATCCPCS-300-030
Bacteria shakerThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kitATCCPCS-300-040
Cell CounterBio-Rad
CFX96 Real-Time PCR SystemBio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KITThermoFisher Scientific4387406
HITES mediumATCCATCC 30-2004
human BEAS-2B cellsATCCATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cellsATCCATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometerBD Biosciences
Nikkon confocal microscopeNikkon
OD readerUSA Scientific
PCR primersITD
Pseudomonas aeruginosaATCCATCC 47085PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens MigulaATCCATCC 27853P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F)University of KentuckyTP-7-VA
RNeasy Mini KitQiagen74106
Transprent PET Transwell InsertCorning Costar
Tryptic Soy BrothBD Biosciences

Referencias

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