Estudando efeitos da fumaça do cigarro na infecção por pseudomonas em células epiteliais pulmonares

Resumo

Descrito aqui é um protocolo para estudar como o extrato de fumaça de cigarro afeta a colonização bacteriana em células epiteliais pulmonares.

Resumo

O tabagismo é a principal causa etiológica para enfisema pulmonar e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). O tabagismo também promove a suscetibilidade a infecções bacterianas no sistema respiratório. No entanto, os efeitos do tabagismo em infecções bacterianas em células epiteliais pulmonares humanas ainda não foram estudados minuciosamente. Descrito aqui é um protocolo detalhado para a preparação de extratos de tabagismo de cigarro (ECA), tratamento de células epiteliais pulmonares humanas com ESC, e determinação de infecção bacteriana e infecção. O CSE foi preparado com um método convencional. As células epiteliais pulmonares foram tratadas com 4% de CSE para 3 h. As células tratadas com CSE foram, então, infectadas com Pseudomonas em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. As cargas bacterianas das células foram determinadas por três métodos diferentes. Os resultados mostraram que a CSE aumentou a carga de Pseudomonas em células epiteliais pulmonares. Este protocolo, portanto, fornece uma abordagem simples e reprodutível para estudar o efeito da fumaça de cigarro em infecções bacterianas em células epiteliais pulmonares.

Introdução

O tabagismo afeta a saúde pública de milhões de pessoas em todo o mundo. Muitas doenças deletérios, incluindo câncer de pulmão e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), estão relacionadas ao tabagismo^1,,2. O tabagismo aumenta a suscetibilidade a infecções microbianas agudas no sistema respiratório^3,,4,5. Além disso, evidências crescentes comprovam que o tabagismo aumenta a patogênese de muitas doenças crônicas^6,,7,8. Por exemplo, o tabagismo pode aumentar as infecções virais ou bacterianas que causam a exacerbação da DPOC⁹. Entre os patógenos bacterianos que contribuem etiologicamente para a exacerbação aguda da DPOC, um patógeno de bacilo gram-negativo oportunista, Pseudomonas aeruginosa,causa infecções que se correlacionam com prognósticos ruins e maiores mortalidades^10,11. A exacerbação da DPOC piora a doença acelerando a progressão patológica. Não há terapias eficazes contra a exacerbação da DPOC, exceto para a gestão antissintomática¹². A exacerbação da DPOC promove a mortalidade do paciente, diminui a qualidade de vida e aumenta a carga econômica sobre a sociedade¹³.

As vias respiratórias são um sistema aberto, continuamente submetido a vários patógenos microbianos presentes externamente. Patógenos bacterianos oportunistas são geralmente detectados nas vias aéreas superiores, mas às vezes são observados nas vias aéreas inferiores^14,15. Nos modelos animais P. aeruginosa pode ser detectado em sacos alveolares logo 1h após a infecção¹⁶. Como um grande mecanismo de defesa, células imunes como macrófagos ou neutrófilos eliminam as bactérias nas vias aéreas. As células epiteliais pulmonares, como a primeira barreira fisiológica, desempenham um papel único na defesa do hospedeiro contra infecções microbianas. As células epiteliais pulmonares podem regular a invasão microbiana, colonização ou replicação independente das células imunes¹⁷. Algumas moléculas encontradas em células epiteliais, incluindo PPARg, exercem funções antibacterianas, regulando assim a colonização bacteriana e a replicação nas células epiteliais pulmonares¹⁸. O tabagismo pode alterar as moléculas e prejudicar a função normal de defesa nas células epiteliais pulmonares^19,20. Estudos recentes relataram exposição direta da fumaça do cigarro às células epiteliais pulmonares usando o aparelho de fumo robô^21,22. A exposição à fumaça pode ser realizada de outras formas, incluindo a aplicação de CSE. A preparação do CSE é uma abordagem reprodutível com aplicações potenciais em outros tipos de células, incluindo células endoteliais vasculares que são indiretamente expostas à fumaça de cigarro.

Este relatório descreve um protocolo para gerar extrato de fumaça de cigarro para alterar a carga bacteriana em células epiteliais pulmonares. O CSE aumenta a carga bacteriana de P. aeruginosa,e pode contribuir para a recidiva de infecções bacterianas geralmente vistas na exacerbação da DPOC. Um método convencional é usado para a preparação de CSE. As células epiteliais pulmonares, em seu estágio de crescimento exponencial, são tratadas com 4% de ESC por 3 h. Alternativamente, as células epiteliais pulmonares cultivadas por monocamadas podem ser diretamente expostas à fumaça do cigarro em uma interface ar-líquido. As células tratadas com CSE são então desafiadas com Pseudomonas em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. As bactérias são propagadas a uma velocidade de agitação particular para garantir que a morfologia de sua flagela permaneça intacta para manter sua capacidade invasiva total. A gentamicina é empregada para matar as bactérias deixadas no meio da cultura, reduzindo assim a contaminação potencial durante a subsequente determinação da carga bacteriana. O protocolo também usa Pseudomonascom a etiqueta GFP, que tem sido utilizada como uma poderosa ferramenta para estudar a infecção por Pseudomonas em diferentes modelos. Uma cepa representativa é P. fluorescens Migula²³. O grau de infecção ou carga bacteriana após o tratamento de ESE é determinado de três maneiras: o método de placa de gota com contagem de colônias, PCR quantitativo usando primers pseudomonas 16S rRNA ou citometria de fluxo em células infectadas com Pseudomonasfluorescentes . Este protocolo é uma abordagem simples e reprodutível para estudar o efeito da fumaça de cigarro em infecções bacterianas em células epiteliais pulmonares.

Protocolo

1. Preparação 100% CSE

1. Desenhe 10 mL de mídia de cultura celular livre de soro (DMEM/F12 para células BEAS-2B; meio basal de célula epitelial das vias aéreas para células HSAEC) em uma seringa de 60 mL.
2. Anexar inversamente uma ponta de pipeta de 1 mL apropriadamente aparada ao bocal da seringa como adaptador para segurar o cigarro (3R4F).
3. Remova o filtro do cigarro. Coloque um cigarro no adaptador de ponta e que combustão o cigarro.
4. Desenhe 40 mL de ar contendo fumaça em 10 mL de mídia sem soro. Misture a fumaça com o meio tremendo vigorosamente (30 s por sorteio).
5. Repita o passo 1.4 cerca de 11x em ~7 min até que o cigarro esteja completamente queimado.
6. Filtre os 10 mL de mídia defumada com um filtro de 0,22 μm para excluir quaisquer microrganismos e partículas insolúveis. Transfira para um tubo estéril fechado. Prepare o CSE 100% não mais do que 30 minutos antes do ensaio subsequente.

2. Cultura pseudomonas

1. Inoculado congelado P. aeruginosa (cepa PAO1) ou P. fluorescens Migula (cepa PAO143) em uma placa de ágar de caldo de soja tripptic (TSB) para cultura durante a noite a 37 °C.
   NOTA: Para obter bactérias suficientes para o cultivo, espalhe o máximo de bactérias na placa de ágar TSB possível.
2. Colete uma mancha bacteriana e incubar em 20 mL de TSB com 5% de glicerol como fonte de carbono.
3. Agite a suspensão bacteriana em uma incubadora de 37 °C a 200 rpm por 1h até o valor OD₆₀₀ = 0,6.
   ATENÇÃO: Não deixe que a velocidade de agitação exceda 200 rpm. Velocidades de agitação mais altas podem danificar a morfologia da flagela bacteriana e impactar a invasão bacteriana na epitélia pulmonar. Da mesma forma, limitar o tempo de agitação a 1h para obter bactérias altamente invasivas. Meça o valor de₆₀₀ OD para estimar o número de bactérias. Um OD₆₀₀ = 1 corresponde a ~10⁹ unidades formadoras de colônias (CFU)/mL.

3. Cultura de células epiteliais pulmonares humanas e tratamento de ESC

1. Cultura células BEAS-2B humanas em meio HITES (500 mL de DMEM/F12, 2,5 mg de insulina, 2,5 mg de transferrina, 2,5 mg de selenita de sódio, 2,5 mg de transferrina, 10 μM de hidrocortisona, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES e 2 mM L-glutamina) suplementadas com 10% de soro bovino fetal (FBS) como descrito anteriormente²⁴.
2. Cultura células epiteliais primárias das pequenas vias aéreas humanas (HSAEC) no meio de cultura de células epiteliais das vias aéreas (500 mL de Airway Cell Basal Medium, 500 μg/mL HSA, 0,6 μM ácido linoleico, 0,6 μg/mL lecitina, 6 mM L-glutamina, extrato de 0,4% P, 1,0 μM de epinefrina, 5 μg/mL transferrina, 10 nM T3, 1 μg/mL hidrocortisona, rh EGF 5 ng/mL e 5 μg/mL rh insulina rh). Incubar as células a 37 °C em 5% de CO₂.
3. Dissociar as células com 1 mL de 0,25% de trippsina por 5 minutos até que as células se desprendem completamente do fundo da placa.
4. Adicione 10 mL de meio HITES completo para neutralizar a trippsina e colete as células em um tubo de 15 mL. Centrifugar a 4 °C a 300 x g por 5 min.
   ATENÇÃO: Monitore cuidadosamente o tempo para digestão de trippsina por microscopia, pois a superdigestão pode causar morte celular.
5. Descarte o supernascer e resuspenque as células em 2 mL de meio HITES com 10% de FBS.
6. Pipeta 10 μL da suspensão celular acima na placa e inseri-la em um contador celular automatizado para obter a concentração em células/mL.
7. Placas BEAS-2B a uma concentração de 3 × 10⁵ células/mL em 6 placas de poço em um volume total de 2 mL em meio HITES suplementado com 10% de FBS para cultura noturna.
8. Trate as células com aproximadamente 80% de confluência, ou 5 x 10⁵ células/mL, com 4% de CSE por 3 h. Antes do tratamento CSE, altere o meio com meio HITES com 1% de FBS.

4. Infecção bacteriana

1. Adicione P. aeruginosa ou P. fluorescens Migula (~1 × 10⁷ UFC/mL) a cada poço das células tratadas com CSE e incubar por 1 h a 37 °C em 5% DE CO₂.
2. Aspire os supernantes e substitua por 2 mL de meio HITES fresco para tratar com 4% de CSE e 100 μg/mL de gentamicina.
   NOTA: A gentamicina é usada porque é incapaz de penetrar membranas celulares epiteliais pulmonares humanas. Assim, pode matar todas as bactérias do meio, mas não aquelas que invadiram as células epiteliais pulmonares.
3. Após 1h de tratamento de CSE/gentamicina a 37 °C em 5% de CO_2,aspire os supernacantes e lave as células 3x com PBS para a subsequente determinação de concentração bacteriana.
   NOTA: Para confirmar as bactérias internalizadas, as células infectadas com P. fluorescens Migula, com a rotulagem GFP, foram observadas sob microscopia fluorescente.

5. Determinação da concentração bacteriana utilizando o método da placa de gota

1. Para determinar a carga bacteriana em células infectadas com o método de placa de gota, lave as células tratadas com gentamicina 2x com 2 mL de PBS frio.
2. Adicione 1 mL de tampão de lise celular (0,5% tritão X-100 em PBS) a cada poço.
3. Diluir as células contendo as bactérias internalizadas em um gradiente (1:10, 1:100, 1:1.000 e 1:10.000) para a seguinte inoculação na placa de ágar TSB.
4. Após 16 h de incubação, obtenha os resultados da UFC contando as colônias bacterianas.

6. Detecção RT-qPCR de rRNA bacteriana 16S

1. Trate as células epiteliais pulmonares infectadas por Pseudomonas(~1 x 10⁶ células/mL) com gentamicina conforme descrito acima. Aspire o meio e lave as células 2x com 2 mL de PBS frio.
2. Adicione 0,35 mL do tampão de lise de tiocianato guanidium por poço de uma placa de 6 poços. Colete as células com um raspador de células. Pipete o lise em um tubo de microcentrifutura e misture suavemente com a pipeta.
3. Adicione o mesmo volume (0,35 mL) de 70% de etanol recém-preparado no lise e misture bem. Transfira todas as amostras para uma coluna de spin colocada em um tubo de coleta de 2 mL. Centrifugar a 10.000 x g para 30 s a 20-25 °C. Em seguida, descarte o tampão no tubo de coleta.
4. Lave a coluna com 0,7 mL de tampão de lavagem 1. Centrifugar a coluna a 10.000 x g para 30 s. Lave a coluna 2x com 0,5 mL de tampão para lavar o RNA ligado à membrana. Repita a centrifugação a 10.000 x g por 2 min.
5. Coloque a coluna em um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Adicione 30-50 μL de água sem RNase. Centrifugar a 10.000 x g por 1 min. Colete o fluxo e meça a concentração de RNA.
6. Realize uma reação de transcrição reversa de acordo com o protocolo do fabricante. Misture 1 μg de RNA total com 10 mL de tampão de reação, 1 μL de transcriptase reversa e água sem RNase para uma reação de 20 μL. Conduza a reação de transcrição reversa a 37 °C por 1h e depois 95 °C por 5 min.
7. Misture os modelos cDNA (1 μL de cada reação de transcrição reversa acima), 5 μL do Mix Mestre contendo corante SYBR, 1 μL de cada primers específicos de 200 nM e água em uma mistura de 20 μL para a análise de PCR a seguir, de acordo com as recomendações do fabricante.
   NOTA: Os seguintes são os primers direcionados ao rRNA 16S de P. aeruginosa: forward 5'-CAAAACTGAGAGCTAGAGTACG-3′; reverter 5'-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH foi usado como um controle de carregamento com os seguintes primers: para a frente: 5'-GGGGGGACTGGTCATGA-3′; reverso: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.
8. Use o método de tomografia comparativa para determinar a expressão.

7. Detecção de Pseudomonas fluorescentes com citometria de fluxo

1. Trate as células epiteliais pulmonares infectadas por Pseudomonas(~1 x 10⁶ células/mL) com gentamicina como descrito anteriormente. Aspire o meio e lave as células 2x com 2 mL de PBS frio.
2. Analise as amostras com um citômetro de fluxo a um comprimento de onda de 509 nm para detecção de GFP. Termine cada leitura em 100.000 contagens. Analisar os dados adquiridos com softwares relacionados.

Resultados

Um diagrama é usado para ilustrar o protocolo na Figura 1. As células BEAS-2B epiteliais pulmonares foram tratadas com ETE e desafiadas com Pseudomonas. Pseudomonas no meio de cultura foram mortas pela gentamicina adicionada e as células foram submetidas ao ensaio da placa de gota, detecção RT-qPCR de Pseudomonas ribossomo 16S RNA, e citometria de fluxo. Em comparação com o controle, o tratamento de ECs aumentou substancialmente a infecção bacteriana nos m...

Discussão

A invasão bacteriana em células epiteliais pulmonares é um passo crucial na patogênese das infecções bacterianas. O processo de invasão bacteriana nas células pode ser dividido nas seguintes três etapas: Primeiro, as bactérias entram em contato e aderem à superfície da célula epitelial usando sua flagela. Em segundo lugar, as bactérias são submetidas à internalização ou penetram na membrana celular. Finalmente, as bactérias se replicam e colonizam as células se escapam com sucesso dos mecanismos de de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
50mL syringe	BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium	ATCC	PCS-300-030
Bacteria shaker	ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit	ATCC	PCS-300-040
Cell Counter	Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System	Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT	ThermoFisher Scientific	4387406
HITES medium	ATCC	ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells	ATCC	ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells	ATCC	ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer	BD Biosciences
Nikkon confocal microscope	Nikkon
OD reader	USA Scientific
PCR primers	ITD
Pseudomonas aeruginosa	ATCC	ATCC 47085	PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula	ATCC	ATCC 27853	P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F)	University of Kentucky	TP-7-VA
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106
Transprent PET Transwell Insert	Corning Costar
Tryptic Soy Broth	BD Biosciences