מחקר השפעות של עשן סיגריות על זיהום פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות

Summary

מתואר כאן הוא פרוטוקול כדי ללמוד כיצד תמצית עשן סיגריות משפיעה על קולוניזציה חיידקים בתאי אפיתל ריאות.

Abstract

עישון סיגריות הוא הגורם האטיולוגי העיקרי לנפחת ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD). עישון סיגריות גם מקדם רגישות לזיהומים חיידקיים במערכת הנשימה. עם זאת, ההשפעות של עישון סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות אנושיים עדיין לא נחקרו ביסודיות. מתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט להכנת תמציות עישון סיגריות (CSE), טיפול בתאי אפיתל ריאות אנושיים עם CSE, זיהום חיידקי וקביעת זיהום. CSE הוכן בשיטה קונבנציונלית. תאי אפיתל ריאות טופלו עם 4% CSE עבור 3 שעות. תאים שטופלו CSE היו, אז, נגועים פסאודומונס בריבוי של זיהום (MOI) של 10. עומסים חיידקיים של התאים נקבעו על ידי שלוש שיטות שונות. התוצאות הראו כי CSE גדל עומס פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות. פרוטוקול זה, לכן, מספק גישה פשוטה ושחזור כדי ללמוד את ההשפעה של עשן סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות.

Introduction

עישון סיגריות משפיע על בריאות הציבור של מיליוני אנשים ברחבי העולם. מחלות מזיקות רבות, כולל סרטן ריאות ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), מדווחים להיות קשורים עישון סיגריות^1,,2. עישון סיגריות מגביר את הרגישות לזיהומים מיקרוביאליים חריפים במערכת^{הנשימה 3,4,5}. יתר על כן, הצטברות ראיות מוכיחה כי עישון סיגריות משפר את הפתוגנזה של הפרעות^{כרוניות רבות 6,7,8}. לדוגמה, עישון סיגריות עלול להגביר זיהומים ויראליים או חיידקיים הגורמים להחרפה COPD⁹. בין הפתוגנים החיידקיים התורמים באופן אטיאולוגי להחמרה חריפה של COPD, פתוגן באקלוס אופורטוניסטי-שלילי, פסאודומונס ארוגינוזה, גורם לזיהומים המתאם עם פרוגנוזה עניים ותמותה^{גבוהה יותר 10,11}. החמרת COPD מחמירה את המחלה על ידי האצת ההתקדמות הפתולוגית. אין טיפולים יעילים נגד החמרה COPD למעט ניהול אנטי-סמפטומטי¹². החמרת COPD מקדמת תמותת חולים, מפחיתה את איכות החיים ומגבירה את הנטל הכלכלי על^{החברה 13}.

דרכי הנשימה היא מערכת פתוחה, נתון ברציפות פתוגנים מיקרוביאליים שונים נוכחים מבחוץ. פתוגנים חיידקיים אופורטוניסטיים מזוהים בדרך כלל בדרכי הנשימה העליונות, אך לעתים נצפו בדרכי הנשימה^{התחתיות 14,15}. במודלים של בעלי חיים P. aeruginosa ניתן לזהות בבקבי alveolar ברגע 1 שעה לאחר זיהום¹⁶. כמנגנון הגנה מרכזי, תאים חיסוניים כגון מקרופאגים או נויטרופילים לחסל את החיידקים בדרכי הנשימה. תאי אפיתל ריאות, כמו המחסום הפיזיולוגי הראשון, לבצע תפקיד ייחודי בהגנה המארח מפני זיהומים מיקרוביאליים. תאי אפיתל ריאות עשויים לווסת פלישה מיקרוביאלית, קולוניזציה, או שכפול ללא תלות בתאים חיסוניים¹⁷. מולקולות מסוימות שנמצאו בתאי אפיתל, כולל PPARg, להפעיל פונקציות אנטיבקטריאליות, ובכך ויסות קולוניזציה חיידקים שכפול בתאי אפיתל^{ריאות 18}. עישון סיגריות עשוי לשנות את המולקולות ולפגוע בתפקוד ההגנה הנורמלי בתאי^{אפיתל ריאות 19,20}. מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על חשיפה ישירה של עשן סיגריות לתאי אפיתל^{ריאות באמצעות 21,22}. חשיפה לעשן יכולה להתבצע בדרכים אחרות, עם זאת, כולל יישום של CSE. הכנת CSE היא גישה לשחזור עם יישומים פוטנציאליים בסוגי תאים אחרים, כולל תאי אנדותל כלי דם החשופים בעקיפין לעשן סיגריות.

דו"ח זה מתאר פרוטוקול כדי ליצור תמצית עשן סיגריה כדי לשנות את העומס חיידקים בתאי אפיתל ריאות. CSE מגביר העומס החיידקי של P. aeruginosa, וזה עשוי לתרום הישנות של זיהומים חיידקיים בדרך כלל לראות בהחמרה COPD. שיטה קונבנציונלית משמשת להכנת CSE. תאי אפיתל ריאות, בשלב הצמיחה המעריכי שלהם, מטופלים עם 4% CSE עבור 3 שעות. לחלופין, תאי אפיתל ריאות חד שכבתיים יכולים להיחשף ישירות לעשן סיגריות בממשק נוזלי אוויר. תאים שטופלו CSE לאחר מכן מאותגרים עם פסאודומונס בריבוי של זיהום (MOI) של 10. החיידקים מופצים במהירות רועדת מסוימת כדי להבטיח את המורפולוגיה של הטלגלה שלהם נשאר שלם כדי לשמור על הקיבולת הפולשנית המלאה שלהם. Gentamycin מועסק להרוג את החיידקים שנותרו במדיום התרבות, ובכך להפחית את הזיהום הפוטנציאלי במהלך הקביעה הבאה של העומס החיידקי. הפרוטוקול משתמש גם בפסאודומונס עם תוויתGFP , אשר נוצל ככלי רב עוצמה בחקר זיהום פסאודומונס במודלים שונים. זן מייצג הוא P. פלואורסן של מיגולה²³. מידת הזיהום או העומס החיידקי לאחר טיפול CSE נקבעת בשלוש דרכים: שיטת צלחת הטיפה עם ספירת מושבה, PCR כמותי באמצעות פריימרים ספציפיים Pseudomonas 16S rRNA, או ציתומיה זרימה בתאים נגועים פסאודומונס פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גישה פשוטה לשחזור כדי לחקור את ההשפעה של עשן סיגריות על זיהומים חיידקיים בתאי אפיתל ריאות.

Protocol

1. הכנת CSE 100%

1. צייר 10 מ"ל של מדיה של תרבות תאים ללא סרום (DMEM/F12 עבור תאי BEAS-2B; אוויר אפיתל תא בסיס בינוני עבור תאי HSAEC) לתוך מזרק 60 מ"ל.
2. חבר הפוך קצה פיפטה 1 מ"ל גזוז כראוי לתרסיס המזרק כמתאם להחזיק את הסיגריה (3R4F).
3. הסר את המסנן של הסיגריה. חבר סיגריה לפטיפטי מתאם ובעצר את הסיגריה.
4. משוך 40 מ"ל של אוויר המכיל עשן לתוך 10 מ"ל של מדיה ללא סרום. מערבבים את העשן עם המדיום על ידי רעד נמרצות (30 שניות לכל תיקו).
5. חזור על שלב 1.4 על 11x ב ~ 7 דקות עד הסיגריה נשרף לחלוטין.
6. לסנן את 10 מ"ל של מדיה מעושנת עם מסנן 0.22 μm כדי לא לכלול כל מיקרואורגניזמים וחלקיקים מסיסים. העברה לצינור סטרילי סגור. הכן את 100% CSE לא יותר מ- 30 דקות לפני ההסכם הבא.

2. תרבות פסאודומונס

1. לחסן קפוא P. aeruginosa (זן PAO1) או P. פלואורסצן מיגולה (זן PAO143) לתוך מרק סטיטי (TSB) צלחת אגר לתרבות לילה ב 37 °C.
   הערה: כדי להשיג מספיק חיידקים לקולטה, להפיץ חיידקים רבים ככל האפשר על צלחת אגר TSB ככל האפשר.
2. לאסוף מריחה חיידקית דגירה ב 20 מ"ל של TSB עם 5% של גליצטרול כמקור הפחמן.
3. לנער את המתלים חיידקים ב אינקובטור 37 °C ב 200 סל"ד עבור 1 שעה עד OD_{600 ערך} = 0.6.
   התראה: אין לתת למהירות הרעידות לעלות על 200 סל"ד. מהירויות רועדות גבוהות יותר עלולות לפגוע מורפולוגיה של פלאגלה חיידקים ולהשפיע על הפלישה חיידקים לתוך אפיטליה ריאות. כמו כן, להגביל את זמן הרעידות 1 שעות כדי להשיג חיידקים פולשניים מאוד. למדוד את ערך OD₆₀₀ כדי להעריך את מספר החיידקים. OD₆₀₀ = 1 מתאים ~ 10⁹ מושבה יצירת יחידות (CFU)/mL.

3. תרבות תאי אפיתל ריאות אנושיים וטיפול CSE

1. תרבות תאי BEAS-2B אנושיים במדיום HITES (500 מ"ל של DMEM/F12, 2.5 אינסולין מ"ג, 2.5 מ"ג transferrin, 2.5 מ"ג נתרן סלניט, 2.5 מ"ג transferrin, 10 μM הידרוקורטיזון, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES, ו 2 mM L-גלוטמין) בתוספת עם 10% סרום מבקרים עובריים (FBS) כפי שתואר^{קודם לכן 24.}
2. תרבות תאי אפיתל דרכי הנשימה העיקריים של דרכי הנשימה (HSAEC) במדיום תרבות תאי האפיתל בדרכי הנשימה (500 מ"ל של תאי אוויר בינוני בסיס, 500 μg/mL HSA, 0.6 μM חומצה לינולאית, 0.6 μg/mL לציטין, 6 mM L-גלוטמין, 0.4% לחלץ P, 1.0 μM אפינפרין, 5 μg /mL transferrin, 10 nM T3, 1 μg/mL הידרוקורטיזון, rh EGF 5 ng/mL, ו 5 μg/mL rh אינסולין). דגירה התאים ב 37 °C ב 5% CO₂.
3. ניתוק התאים עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין במשך 5 דקות עד התאים להתנתק לחלוטין מתחתית הצלחת.
4. להוסיף 10 מ"ל של HITES שלם מדיום כדי לנטרל טריפסין ולאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ב-300 x גרם למשך 5 דקות.
   התראה: בזהירות לפקח על הזמן לעיכול נסהפסין על ידי מיקרוסקופיה, כי עיכול יתר עלול לגרום למוות של תאים.
5. בטל את supernatant וssuspend התאים ב 2 מ"ל של HITES בינוני עם 10% FBS.
6. Pipette 10 μL של מתלה התא לעיל על הלוח ולהכניס אותו לתוך מונה תא אוטומטי כדי להשיג את הריכוז בתאים / מ"ל.
7. צלחת BEAS-2B תאים בריכוז של 3 × 10^{5 תאים} / מ"ל לתוך 6 צלחות גם בנפח כולל של 2 מ"ל ב HITES בינוני בתוספת עם 10% של FBS לתרבות לילה.
8. לטפל בתאים בכ 80% confluency, או 5 x 10⁵ תאים / מ"ל, עם 4% CSE עבור 3 שעות. לפני טיפול CSE, לשנות את המדיום עם HITES בינוני עם 1% של FBS.

4. זיהום חיידקי

1. הוסף P. aeruginosa או P. פלואורסצנים מיגולה (~ 1 ×^{10 7} CFU / מ"ל) לכל באר של תאים שטופלו CSE דגירה עבור 1 שעה ב 37 ° C ב 5% CO₂.
2. שאף את supernatants ולהחליף עם 2 מ"ל של HITES טרי בינוני לטיפול עם 4% CSE ו 100 μg / מ"ל gentamicin.
   הערה: Gentamicin משמש כי הוא אינו מסוגל לחדור קרום תאי אפיתל ריאות אנושיות. לכן, זה יכול להרוג את כל החיידקים במדיום אבל לא את אלה שפלשו לתאי אפיתל הריאה.
3. לאחר 1 שעה של CSE / gentamicin טיפול ב 37 °C ב 5% CO₂, לשאוף את supernatants ולשטוף את התאים 3x עם PBS לקביעת ריכוז חיידקים הבאים.
   הערה: כדי לאשר את החיידקים הפנימיים, תאים נגועים GFP תווית P. פלואורסצנים מיגולה נצפו תחת מיקרוסקופ פלורסנט.

5. קביעת ריכוז חיידקים בשיטת צלחת הטיפה

1. כדי לקבוע עומס חיידקים בתאים נגועים בשיטת צלחת טיפה, לשטוף את התאים שטופלו gentamycin 2x עם 2 מ"ל של PBS קר.
2. הוסף 1 מ"ל של מאגר סיס תא (0.5% triton X-100 ב PBS) לכל באר.
3. לדלל את התא המכיל את החיידקים הפנימיים בהדרגתי (1:10, 1:100, 1:1,000 ו- 1:10,000) עבור החיסונים הבאים לצלחת אגר TSB.
4. לאחר 16 שעות של דגירה, להשיג את התוצאות של CFU על ידי ספירת המושבות חיידקים.

6. RT-qPCR זיהוי של חיידקים 16S rRNA

1. לטפל בתאי אפיתל ריאות נגועיםפסאודומונס (~ 1 x 10⁶ תאים / מ"ל) עם gentamycin כמתואר לעיל. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים 2x עם 2 מ"ל של PBS קר.
2. מוסיפים 0.35 מ"ל של מאגר הליזה של גאנידיום תיוציאניאט לבאר של צלחת באר 6. לאסוף את התאים עם מגרד תא. פיפט lysate לתוך צינור microcentrifuge ולערבב בעדינות עם פיפטה.
3. מוסיפים את אותו נפח (0.35 מ"ל) של אתנול טרי 70% לתוך lysate ומערבבים היטב. העבר את כל הדגימות לעמודת ספין הממוקמת בצינור אוסף של 2 מ"ל. צנטריפוגה ב- 10,000 x g עבור 30 s ב 20-25 ° C. לאחר מכן, מחק את המאגר בצינור האוסף.
4. שטוף את העמודה עם 0.7 מ"ל של מאגר כביסה 1. צנטריפוגה בעמודה ב- 10,000 x g עבור 30 s. יש לשטוף את העמודה 2x עם 0.5 מ"ל של חוצץ כדי לשטוף את RNA מאוגד קרום. חזור על הצנטריפוגה ב- 10,000 x g למשך 2 דקות.
5. מקם את העמודה בצינור קולקציה חדש של 1.5 מ"ל. מוסיפים 30-50 μL מים ללא תסה. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה אחת. לאסוף את הזרימה דרך למדוד את ריכוז RNA.
6. בצע תגובת שעתוק הפוכה בהתאם לפרוטוקול היצרן. לערבב 1 μg של RNA הכולל עם 10 מ"ל של מאגר תגובה, 1 μL של תעתיק הפוך, ומים ללא RNase לתגובה 20 μL. לבצע את תגובת שעתוק הפוכה ב 37 ° C עבור 1 שעות ולאחר מכן 95 ° C במשך 5 דקות.
7. לערבב יחד את תבניות cDNA (1 μL של כל תגובה שעתוק הפוך לעיל), 5 μL של תערובת מאסטר המכיל צבע SYBR, μL 1 של כל פריימרים ספציפיים 200 nM, ומים בתערובת 20 μL לניתוח PCR הבא, על פי המלצות היצרן.
   הערה: להלן פריימרים מיקוד 16S rRNA של P. aeruginosa: קדימה 5′-CAAAACTACTGAGCTAGAGAGAGCG-3′; הפוך 5′-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH שימש כפקד טעינה עם פריימרים הבאים: קדימה: 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′; הפוך: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.
8. השתמש בשיטת CT השוואתית כדי לקבוע את הביטוי.

7. זיהוי פסאודומונס פלורסנט עם ציתום זרימה

1. לטפל פלואורסצנט פסאודומונס -נגוע תאיאפיתל ריאות (~ 1 x 10^{6 תאים} / מ"ל) עם gentamycin כפי שתואר קודם לכן. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים 2x עם 2 מ"ל של PBS קר.
2. נתח את הדגימות עם ציטומטר זרימה באורך גל של 509 ננומטר לזיהוי GFP. סיים כל קריאה ב-100,000 אישומים. נתח את הנתונים שנרכשו באמצעות תוכנה קשורה.

תוצאות

דיאגרמה משמשת להמחשת הפרוטוקול באות 1. תאי BEAS-2B אפיתל ריאות טופלו CSE ואתגרו עם פסאודומונס. פסאודומונס במדיום התרבות נהרגו על ידי gentamycin הוסיף ואת התאים היו נתונים לצלחת טיפה, RT-qPCR זיהוי של פסאודומונס ריבוזום 16S RNA, וציטומטריית זרימה. בהשוואה לבקרה, טיפול CSE גדל ב?...

Discussion

פלישה חיידקית לתאי אפיתל ריאות היא צעד מכריע בפתוגנזה של זיהומים חיידקיים. התהליך של פלישה חיידקית לתאים יכול להיות מחולק לתוך שלושת השלבים הבאים: הראשון, מגע החיידקים ולדבוק על פני השטח של תא האפיתל באמצעות flagella שלהם. שנית, החיידקים עוברים הפניה או חודרים את קרום התא. לבסוף, החיידקים לשכפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50mL syringe	BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium	ATCC	PCS-300-030
Bacteria shaker	ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit	ATCC	PCS-300-040
Cell Counter	Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System	Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT	ThermoFisher Scientific	4387406
HITES medium	ATCC	ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells	ATCC	ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells	ATCC	ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer	BD Biosciences
Nikkon confocal microscope	Nikkon
OD reader	USA Scientific
PCR primers	ITD
Pseudomonas aeruginosa	ATCC	ATCC 47085	PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula	ATCC	ATCC 27853	P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F)	University of Kentucky	TP-7-VA
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106
Transprent PET Transwell Insert	Corning Costar
Tryptic Soy Broth	BD Biosciences