JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описано здесь протокол для изучения того, как экстракт сигаретного дыма влияет на бактериальную колонизацию эпителиальных клеток легких.

Аннотация

Курение сигарет является основной этиологической причиной эмфиземы легких и хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Курение сигарет также способствует восприимчивости к бактериальным инфекциям в дыхательной системе. Тем не менее, влияние курения сигарет на бактериальные инфекции в клетках эпителия легких человека до сих пор тщательно не изучены. Описано здесь подробный протокол для подготовки экстрактов курения сигарет (CSE), лечение эпителиальных клеток легких человека с CSE, и бактериальной инфекции и определения инфекции. CSE был подготовлен обычным методом. Легкие эпителиальные клетки лечились с 4% CSE для 3 ч. CSE-обработанные клетки были, то, инфицированных Pseudomonas при множественности инфекции (MOI) 10. Бактериальные нагрузки клеток определялись тремя различными методами. Результаты показали, что CSE увеличила нагрузку Pseudomonas в легких эпителиальных клеток. Таким образом, этот протокол обеспечивает простой и воспроизводимый подход к изучению влияния сигаретного дыма на бактериальные инфекции в эпителиальных клетках легких.

Введение

Курение сигарет влияет на здоровье населения миллионов людей во всем мире. Многие вредные заболевания, в том числе рак легких и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), как сообщается, связаныс курением сигарет 1,2. Курение сигарет повышает восприимчивость к острым микробным инфекциям в дыхательной системе3,,4,,5. Кроме того, растущие доказательства доказывают, что курение сигарет усиливает патогенез многих хронических расстройств6,,7,,8. Например, курение сигарет может увеличить вирусные или бактериальные инфекции, которые вызывают обострение ХОБЛ9. Среди бактериальных патогенов, которые этиологически способствуют острому обострению ХОБЛ, оппортунистический грамотрицатель бактерий патоген, Pseudomonas aeruginosa, вызывает инфекции, которые коррелируют с плохими прогнозами и более высокойсмертности 10,11. Обострение ХОБЛ ухудшает болезнь за счет ускорения патологического прогрессирования. Нет эффективных методов лечения обострения ХОБЛ, за исключением антисимптомного управления12. Обострение ХОБЛ способствует смертности пациентов, снижает качество жизни и увеличивает экономическую нагрузку на общество13.

Дыхательные пути представляют если вылазаемые дыхательные пути, то есть открытые системы, постоянно подвергаемые различным микробным патогенам, присутствующим за пределами страны. Оппортунистические бактериальные патогены обычно обнаруживаются в верхних дыхательных путях, но иногда наблюдаются в нижнихдыхательных путях 14,,15. В животных моделях P. aeruginosa могут быть обнаружены в альвеолярных мешках уже через 1 ч после заражения16. Как основной защитный механизм, иммунные клетки, такие как макрофаги или нейтрофилов устранить бактерии в дыхательных путях. Эпителиальные клетки легких, как первый физиологический барьер, выполняют уникальную роль в защите хозяина от микробных инфекций. Легкие эпителиальные клетки могут регулировать микробное вторжение, колонизацию или репликацию независимо от иммунных клеток17. Некоторые молекулы, найденные в эпителиальных клетках, включая PPARg, оказывают антибактериальные функции, тем самым регулируя бактериальную колонизацию и репликацию в эпителиальных клеткахлегких 18. Курение сигарет может изменить молекулы и ухудшить нормальную функцию защиты в легких эпителиальныхклеток 19,20. Недавние исследования сообщили о прямом воздействии сигаретного дыма на легочные эпителиальные клетки с помощьюробота курительного аппарата 21,22. Воздействие дыма может быть выполнено другими способами, однако, в том числе применение CSE. Подготовка CSE является воспроизводимым подходом с потенциальным применением в других типах клеток, включая сосудистые эндотелиальные клетки, которые косвенно подвергаются воздействию сигаретного дыма.

В этом докладе описывается протокол для создания экстракта сигаретного дыма для изменения бактериальной нагрузки в клетках эпителия легких. CSE увеличивает бактериальную нагрузку P. aeruginosa, и это может способствовать рецидиву бактериальных инфекций, как правило, наблюдается при обострении ХОБЛ. Для подготовки CSE используется обычный метод. Легкие эпителиальные клетки, на их экспоненциальной стадии роста, лечатся с 4% CSE для 3 ч. Кроме того, монослойные эпителиальные клетки легких могут быть непосредственно подвержены воздействию сигаретного дыма в воздухо-жидком интерфейсе. CSE-обработанные клетки после этого оспорены с Pseudomonas на разносторонности инфекции (MOI) 10. Бактерии распространяются с определенной скоростью встряхивания, чтобы обеспечить морфологию их flagella остается нетронутым, чтобы сохранить их полную инвазивную способность. Гентамицин используется для уничтожения бактерий, оставшихся в среде культуры, тем самым уменьшая потенциальное загрязнение во время последующего определения бактериальной нагрузки. Протокол также использует GFP помечены Pseudomonas, который был использован в качестве мощного инструмента в изучении инфекции Pseudomonas в различных моделях. Репрезентативным штаммом является P. fluorescens Migula23. Степень инфекции или бактериальной нагрузки после лечения CSE определяется тремя способами: метод drop plate с подсчетом колоний, количественный ПЦР с использованием Pseudomonas 16S rRNA-специфических грунтовок, или цитометрия потока в клетках, инфицированных флуоресцентными Pseudomonas. Этот протокол представляет можно простой и воспроизводимый подход к изучению влияния сигаретного дыма на бактериальные инфекции в эпителиальных клетках легких.

протокол

1. 100% подготовка CSE

  1. Нарисуйте 10 мл носителя культуры клеток, свободных от сыворотки (DMEM/F12 для клеток BEAS-2B; базальная среда эпителиальной клетки дыхательных путей для клеток HSAEC) в шприц 60 мл.
  2. Обратно прикрепите соответствующим образом подстриженный наконечник пипетки 1 мл к соплу шприца в качестве адаптера для удержания сигареты (3R4F).
  3. Снимите фильтр сигареты. Прикрепите сигарету к адаптеру наконечника и сголите сигарету.
  4. Нарисуйте 40 мл дымосодержащего воздуха в 10 мл безотхвных средств массовой информации. Смешайте дым со средой, энергично встряхивая (30 с за ничью).
  5. Повторите шаг 1.4 около 11x в 7 мин, пока сигарета полностью выгорела.
  6. Фильтр 10 мл копченых средств массовой информации с фильтром 0,22 мкм, чтобы исключить любые микроорганизмы и нерастворимые частицы. Перенесите в закрытую стерильную трубку. Подготовьте 100% CSE не более чем за 30 минут до последующего анализа.

2. Псевдомонас культуры

  1. Прививка замороженных P. aeruginosa (напряжение PAO1) или P. fluorescens Migula (напряжение PAO143) в триптический соевый бульон (TSB) агар пластины для ночной культуры при 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить достаточное количество бактерий для культивирования, распространение как можно больше бактерий на TSB агар пластины, как это возможно.
  2. Соберите бактериальный мазок и инкубировать в 20 мл TSB с 5% глицерола в качестве источника углерода.
  3. Встряхните бактериальную суспензию в инкубаторе 37 градусов по Цельсию при 200 об/мин за 1 ч до значения OD600 и 0,6.
    ВНИМАНИЕ: Не позволяйте скорости встряхивания превышать 200 об/мин. Более высокие скорости встряхивания могут повредить морфологию бактериальной флагеллы и повлиять на бактериальное вторжение в эпителию легких. Аналогичным образом, ограничить время встряхивания до 1 ч для получения высокоинвазивных бактерий. Измерьте значение OD600 для оценки количества бактерий. OD600 No 1 соответствует 109 единицам формирования (CFU)/mL.

3. Культура эпителиальных клеток легких человека и лечение CSE

  1. Культура человеческих клеток BEAS-2B в среде HITES (500 мл DMEM/F12, 2,5 мг инсулина, 2,5 мг трансферрина, 2,5 мг натрия селенит, 2,5 мг трансферрина, 10 МК гидрокортизон, 10 МКМ β-эстрадиол, 10 мМ HEPES, и 2 мМ L-глутамин) дополнены 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), какранее описано 24.
  2. Культура человека первичных малых дыхательных путей эпителиальных клеток (HSAEC) в дыхательных путей эпителиальной клеточной культуры среды (500 мл airway Cell Базал Средний, 500 мкг / мл HSA, 0,6 МКМ линолевая кислота, 0,6 мкг/мл лецитина, 6 мм L-глутамина, 0,4% экстракта P, 1,0 мкг эпинефрина, 5 мкг/мл трансферрина, 10 нм Т3, 1 мкг/мл гидрокортизона, rh EGF 5 нг/мл и 5 мкг/мл инсулина). Инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2.
  3. Разобщить клетки с 1 мл 0,25% трипсина в течение 5 мин, пока клетки полностью отделиться от нижней части пластины.
  4. Добавьте 10 мл полной среды HITES, чтобы нейтрализовать трипсин и собрать клетки в 15 мл трубки. Центрифуга при 4 градусов по Цельсию при 300 х г в течение 5 мин.
    ВНИМАНИЕ: Тщательно контролировать время для переваривания трипсина с помощью микроскопии, потому что переварение желудка может привести к гибели клеток.
  5. Отбросьте супернатант и ресуссуйте клетки в 2 мл среды HITES с 10% FBS.
  6. Pipette 10 йл вышеуказанной клеточной подвески на пластину и вставить его в автоматизированный счетчик ячейки для получения концентрации в клетках / мл.
  7. Плита BEAS-2B клетки в концентрации 3 × 105 клеток / мл в 6 пластин хорошо в общем объеме 2 мл в HITES среды дополняется 10% FBS для ночной культуры.
  8. Лечить клетки примерно на 80% слияния, или 5 х 105 клеток / мл, с 4% CSE для 3 ч. Перед лечением CSE, изменить средний с HITES среды с 1% от FBS.

4. Бактериальная инфекция

  1. Добавить P. aeruginosa или P. fluorescens Migula (No 1 × 107 CFU/mL) к каждой колодец клеток, обработанных CSE, и инкубировать в течение 1 ч при 37 градусах по Цельсию в 5% CO2.
  2. Аспирировать супернатанты и заменить 2 мл свежей среды HITES для лечения с 4% CSE и 100 мкг / мл гентамицина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гентамицин используется, потому что он не в состоянии проникнуть человека легких эпителиальных клеточных мембран. Таким образом, он может убить все бактерии в среде, но не те, которые вторглись в легких эпителиальных клеток.
  3. После 1 ч CSE/ gentamicin лечения при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2, аспирировать супернатанты и мыть клетки 3x с PBS для последующего определения бактериальной концентрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения интернализированных бактерий, клетки, инфицированные GFP помечены P. fluorescens Migula наблюдались под флуоресцентной микроскопии.

5. Определение бактериальной концентрации с помощью метода drop plate

  1. Чтобы определить бактериальную нагрузку в инфицированных клетках методом drop plate, промыть гентамицин-обработанные клетки 2x с 2 мл холодного PBS.
  2. Добавьте 1 мл буфераеслиса клеток (0,5% тритона X-100 в PBS) к каждой хорошо.
  3. Разбавить лизаты клеток, содержащие интернализированные бактерии в градиенте (1:10, 1:100, 1:1000 и 1:10,000) для следующей прививки к пластине TSB agar.
  4. После 16 ч инкубации, получить результаты CFU путем подсчета бактериальных колоний.

6. Обнаружение РТ-кПКР бактериальной 16S рРНК

  1. Лечить Pseudomonas-инфицированныхлегких эпителиальных клеток (No 1 х 106 клеток / мл) с гентамицином, как описано выше. Аспирировать средний и мыть клетки 2x с 2 мл холодного PBS.
  2. Добавьте 0,35 мл буфера тиоцианата гуанидия на колодец 6 хорошо пластины. Соберите клетки с помощью клеточного скребка. Pipette лизатье в микроцентрифуг трубки и аккуратно перемешать с пипеткой.
  3. Добавьте тот же объем (0,35 мл) свежеприготовленного 70% этанола в лизат и хорошо перемешайте. Перенесите все образцы в колонку спина, помещенную в трубку для сбора 2 мл. Центрифуга при 10 000 х г при 30 с при 20-25 градусах Цельсия. Затем отбросьте буфер в трубке сбора.
  4. Вымойте столбец с 0,7 мл буфера мытья 1. Центрифуга колонны на 10 000 х г на 30 с. Вымойте колонку 2x с 0,5 мл буфера для мытья мембраны связаны РНК. Повторите центрифугу при 10 000 х г в течение 2 мин.
  5. Поместите колонку в новую трубку для сбора 1,5 мл. Добавьте воду без 30-50 йл RNase. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин. Соберите поток через и измерить концентрацию РНК.
  6. Выполните обратную реакцию транскрипции в соответствии с протоколом производителя. Смешайте 1 мкг общей РНК с 10 мл буфера реакции, 1 йл обратной транскриптазы, и RNase-свободной воды для 20 йл реакции. Проведи обратную транскрипцию при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч, а затем 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
  7. Смешайте шаблоны cDNA (1 йл каждой обратной транскрипционной реакции выше), 5 МКЛ Мастер Микс, содержащий краситель SYBR, 1 йл каждых 200 нМ конкретных грунтовок, и воды в 20 йл смеси для следующего анализа ПЦР, в соответствии с рекомендациями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведены праймеры ориентации 16S рРНК P. aeruginosa: вперед 5 "-CAAAACTGAGCAGTACG-3"; обратный 5"-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3 ". GAPDH использовался в качестве управления погрузкой со следующими грунтовки: вперед: 5 "-GGCATGGACTGGTCATGA-3"; обратный: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3 ".
  8. Используйте сравнительный метод КТ для определения выражения.

7. Обнаружение флуоресцентных Псевдомонас с потоком цитометрии

  1. Лечить выше флуоресцентных Pseudomonas-инфицированныхлегких эпителиальных клеток (No 1 х10 6 клеток / мл) с гентамицином, как описано ранее. Аспирировать средний и мыть клетки 2x с 2 мл холодного PBS.
  2. Проанализируйте образцы с цитометром потока на длине волны 509 нм для обнаружения GFP. Прекратите каждое чтение на 100 000 пунктов. Проанализируйте приобретенные данные с помощью связанного программного обеспечения.

Результаты

Диаграмма используется для иллюстрации протокола на рисунке 1. Легкие эпителиальные клетки BEAS-2B лечились CSE и оспаривается с Pseudomonas. Псевдомоны в среде культуры были убиты добавленным гентамицином, и клетки подверглись анализу капли пластины, обнаружению RT-qPCR ?...

Обсуждение

Бактериальное вторжение в легочные эпителиальные клетки является важным шагом в патогенеза бактериальных инфекций. Процесс бактериального вторжения в клетки может быть разбит на следующие три шага: во-первых, бактерии контакт и придерживаться поверхности эпителиальной клетки, испол...

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения R01 гранты HL125435 и HL142997 (к СЗ).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
50mL syringeBD Biosciences
airway epithelial cell basal mediumATCCPCS-300-030
Bacteria shakerThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kitATCCPCS-300-040
Cell CounterBio-Rad
CFX96 Real-Time PCR SystemBio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KITThermoFisher Scientific4387406
HITES mediumATCCATCC 30-2004
human BEAS-2B cellsATCCATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cellsATCCATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometerBD Biosciences
Nikkon confocal microscopeNikkon
OD readerUSA Scientific
PCR primersITD
Pseudomonas aeruginosaATCCATCC 47085PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens MigulaATCCATCC 27853P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F)University of KentuckyTP-7-VA
RNeasy Mini KitQiagen74106
Transprent PET Transwell InsertCorning Costar
Tryptic Soy BrothBD Biosciences

Ссылки

  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
  3. Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
  4. Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
  5. Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
  6. Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
  7. Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
  8. Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
  9. Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
  10. Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
  11. Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
  12. Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
  13. Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).
  14. Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), 286-291 (2000).
  15. Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
  16. Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
  17. Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
  18. Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
  19. Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
  20. Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
  21. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
  22. Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
  23. Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
  24. Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
  25. Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
  26. Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
  27. Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
  28. Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
  29. Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
  30. Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
  31. Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
  32. Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
  33. Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
  34. Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
  36. Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
  37. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE159Pseudomonas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены