Evaluación de los efectos del estrés en la flexibilidad cognitiva utilizando un paradigma de cambio de estrategia operante

Resumen

Los eventos estresantes de la vida perjudican la función cognitiva, lo que aumenta el riesgo de trastornos psiquiátricos. Este protocolo ilustra cómo el estrés afecta la flexibilidad cognitiva utilizando una estrategia operante automatizada que cambia el paradigma en ratas Sprague Dawley macho y hembra. Se discuten áreas específicas del cerebro que subyacen a comportamientos particulares y se explora la relevancia traslacional de los resultados.

Resumen

El estrés afecta la función cognitiva. Si el estrés mejora o deteriora la función cognitiva depende de varios factores, incluyendo el 1) tipo, intensidad y duración del factor estresante; 2) tipo de función cognitiva en estudio; y 3) el momento del factor estresante en relación con el aprendizaje o la ejecución de la tarea cognitiva. Además, las diferencias de sexo entre los efectos del estrés en la función cognitiva han sido ampliamente documentadas. Aquí se describe una adaptación de una estrategia operante automatizada que cambia el paradigma para evaluar cómo las variaciones en el estrés afectan la flexibilidad cognitiva en ratas Sprague Dawley macho y hembra. Específicamente, el estrés de restricción se utiliza antes o después del entrenamiento en esta tarea basada en el operante para examinar cómo el estrés afecta el rendimiento cognitivo en ambos sexos. Las áreas cerebrales particulares asociadas con cada tarea en este paradigma automatizado han sido bien establecidas (es decir, la corteza prefrontal medial y la corteza orbitofrontal). Esto permite manipulaciones dirigidas durante el experimento o la evaluación de genes y proteínas particulares en estas regiones al completar el paradigma. Este paradigma también permite la detección de diferentes tipos de errores de rendimiento que ocurren después del estrés, cada uno de los cuales tiene sustratos neuronales definidos. También se identifican diferencias de sexo distintas en los errores perseverantes después de un paradigma de estrés de restricción repetido. El uso de estas técnicas en un modelo preclínico puede revelar cómo el estrés afecta al cerebro y afecta la cognición en trastornos psiquiátricos, como el trastorno de estrés postraumático (TEPT) y el trastorno depresivo mayor (TDM), que muestran marcadas diferencias de sexo en la prevalencia.

Introducción

En los seres humanos, los eventos estresantes de la vida pueden afectar la función cognitiva (es decir, la flexibilidad cognitiva^1),lo que denota la capacidad de adaptar las estrategias de procesamiento cognitivo para enfrentar nuevas condiciones en el entorno². El deterioro de la cognición precipita y exacerba muchos trastornos psiquiátricos, como el trastorno de estrés postraumático (TEPT) y el trastorno depresivo mayor (TDM)^3,4. Estos trastornos son dos veces más prevalentes en las mujeres^5,6,7,8,sin embargo, la base biológica de esta disparidad sigue siendo desconocida. Los aspectos del funcionamiento ejecutivo en humanos se pueden evaluar utilizando la Wisconsin Card Sorting Task, una demostración de flexibilidad cognitiva². El rendimiento en esta tarea se ve afectado en pacientes con TEPT⁹ y MDD^10,pero la base neuronal de este cambio solo puede ser examinada por imágenes cerebrales¹¹.

Los avances en la comprensión de cómo el estrés afecta al cerebro se han logrado a través del uso de modelos animales, particularmente roedores. Como la flexibilidad cognitiva se ve afectada en las enfermedades relacionadas con el estrés, es un fenotipo excepcionalmente relevante para examinar en roedores. Hasta la fecha, la mayoría de la literatura de neurobiología del estrés ha utilizado un paradigma alternativo de flexibilidad cognitiva (a veces denominado la tarea de excavación)^12,13,14,15. Si bien esta tarea ha sido ampliamente examinada, requiere más tiempo y esfuerzo por parte del experimentador para entrenar roedores. Adaptado y descrito aquí es un protocolo automatizado de cambio de conjunto bien establecido¹⁶ para evaluar la flexibilidad cognitiva en ratas Sprague Dawley macho y hembra utilizando varios modelos de estrés^17,18. El procedimiento requiere una supervisión mínima por parte del experimentador y permite que múltiples ratas sean probadas simultáneamente. Además, a diferencia de otras versiones de esta tarea automatizada^19,la adaptación de este paradigma solo requiere 3 días de entrenamiento e incluye un eficiente análisis de datos programados.

Si el estrés mejora o deteriora la función cognitiva depende del tipo, la intensidad y la duración del factor estresante, así como del momento del factor estresante en relación con el aprendizaje o la ejecución de una tarea cognitiva^20,21. Así, el protocolo incorpora procedimientos de estrés tanto antes como después del entrenamiento operante. También examina los resultados representativos de los estudios de estrés. Además, las regiones cerebrales subyacentes a aspectos particulares del cambio de conjuntos han sido bien establecidas^2,16,22; por lo tanto, el informe también describe cómo apuntar y evaluar regiones cerebrales particulares durante o después de los procedimientos de cambio de estrés y estrategia.

Ha habido investigaciones limitadas sobre el examen directo de las diferencias sexuales en la flexibilidad cognitiva^18,23.  El protocolo describe cómo 1) incorporar ratas macho y hembra en el paradigma experimental, luego 2) rastrear ciclos estrales antes y durante los procedimientos en hembras que pedalean libremente. Estudios previos han indicado que el estrés antes del entrenamiento operante puede conducir a déficits específicos del sexo en la flexibilidad cognitiva en^{ratas 17}. En particular, las ratas hembra exhiben interrupciones en la flexibilidad cognitiva después del estrés, mientras que la flexibilidad cognitiva mejora en las ratas macho después del estrés¹⁷. Curiosamente, un sello distintivo importante de los trastornos psiquiátricos relacionados con el estrés, que tienen una incidencia sesgada por el sexo en los seres humanos, es la inflexibilidad cognitiva. Estos resultados sugieren que las mujeres pueden ser más vulnerables a este tipo de deterioro cognitivo que los hombres. El uso de estas técnicas en modelos animales arrojará luz sobre los efectos del estrés en el cerebro y cómo afecta la cognición en los trastornos psiquiátricos en humanos.

Protocolo

Todos los procedimientos de este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Bryn Mawr College. Obtener la aprobación regulatoria de la IACUC o de otra manera aplicable antes de ordenar animales de laboratorio y comenzar la experimentación.

1. Preparación animal

1. Adquirir macho y hembra de ratas Sprague Dawley adultas.
   NOTA: Las ratas pueden ser entregadas antes de los 65 días de edad, pero no comiencen los procedimientos hasta después de este punto para asegurarse de que tanto los machos como las hembras estén completamente maduros.
2. Emparejar ratas del mismo sexo durante el mayor tiempo posible, ya que el aislamiento a largo plazo es un factor estresante²⁴. Para la restricción de alimentos, amese solo a las ratas justo antes del protocolo de cambio de estrategia operante.
3. Después de 1 semana de aclimatación, comience suavemente a manejar ratas durante 3-5 minutos por día. Recoge el peso corporal de cada rata. Además, si está interesado en evaluar cómo las hormonas gonadales pueden afectar los resultados, recoja el lavado vaginal para ratas hembra (descrito en la sección 2).
4. Restrinja (de la comida) a los animales que se ejecutarán en el paradigma de cambio de estrategia operante al menos 3 días antes de que comience el entrenamiento para que aprendan con éxito la tarea. Asegúrese de que el agua esté siempre disponible gratuitamente. Se deben mantener registros escritos para cada animal para documentar el consumo diario de alimentos y líquidos, el estado de hidratación y cualquier cambio de comportamiento y clínico utilizado como criterio para la eliminación temporal o permanente de un animal de un protocolo (Morton 2000; NRC 2003b).
   1. Si emplea un procedimiento de estrés durante más de 3 días antes del entrenamiento, ajuste la restricción de alimentos para que coincida con el número de días de estrés (por ejemplo, 5 días de restricción más restricción de alimentos²⁵).
   2. Cada día, entregar el 80% de la ingesta diaria normal de alimentos (es decir, 4 g de alimentos por cada 100 g de peso corporal)²⁶. Use la recolección diaria de peso para la rata para calcular la cantidad de comida que debe dar cada día.
   3. Continúe con la restricción de alimentos durante los días de entrenamiento y prueba. Sin embargo, no coloque la comida en la jaula del hogar hasta después de que la rata haya completado el entrenamiento o las pruebas del día, o de lo contrario no estará motivada para realizar las tareas para obtener una recompensa de pellets de alimento. Asegúrese de que el momento de la entrega de alimentos a las ratas al finalizar la tarea sea bastante impredecible, ya que esto ayuda a evitar una motivación reducida para realizar en la cámara operante (a favor de simplemente esperar la comida en la jaula doméstica después).
      NOTA: Los animales sometidos al paradigma de estrés de restricción no exhiben una pérdida de peso significativamente mayor que los sujetos de control no estresados. Sin embargo, varios procedimientos de estrés pueden inducir la pérdida de peso, lo que resulta en que las ratas reciban menos alimentos que sus contrapartes no estresadas durante la restricción de alimentos basada en el peso corporal. Esto puede presentar un factor estresante adicional y confuso. Si este parece ser el caso, alternativamente use una cantidad fija de alimentos dados a cada sujeto, independientemente del peso²⁷.

2. Lavado vaginal

NOTA: Se sabe que las hormonas gonadales (es decir, estrógeno y progesterona) afectan la respuesta al estrés y la cognición^28,29,30. Estas hormonas fluctúan a lo largo del ciclo estral de las ratas hembra³¹. Si está interesado en rastrear el ciclo estral de roedores hembras que circulan libremente para correlacionarlos con datos de estrés o flexibilidad cognitiva, recopile el lavado vaginal como se describe a continuación. No se proporcionan datos representativos que consideren la etapa del ciclo estral.

1. Para obtener muestras de lavado vaginal de las hembras, reúna agua tibia en un vaso de precipitados limpio, un cuentagotas de vidrio, un portaobjetos de "lavado" (portaobjetos de microscopio con círculos de pintura acrílica para contener la muestra de lavado) y un vaso de precipitados vacío.
2. Llene el cuentagotas con una pequeña cantidad de agua tibia (~ 0.5 ml), luego inserte la punta en la vagina de la rata hembra (levantándola por la cola). Expulse el agua estéril 2x–3x y expulse el líquido recolectado en un portaobjetos microscópico. No desborde el círculo de deslizamiento de lavado.
3. Expulse cualquier exceso de líquido en el beaker vacío. Etiquete la diapositiva de lavado con números de rata y coloque las muestras de cada rata en ese orden para que quede claro qué muestra pertenece a cada rata.
4. Enjuague bien el cuentagotas pipeteando agua tibia limpia y dispensándola en el beaker "excedente" varias veces antes de llenar el cuentagotas para muestrear la siguiente rata.
5. Lleve cuidadosamente el portaobjetos de lavado a un microscopio de campo brillante para obtener imágenes de la muestra de lavado y clasificar el día dentro del ciclo estral como se describe en Becker et al³¹.
   NOTA: Idealmente, el lavado debe hacerse durante unas semanas para rastrear adecuadamente el ciclo de una mujer y debe realizarse a una hora muy similar cada día para controlar los ritmos circadianos. Preferiblemente, este procedimiento debe realizarse antes de los procedimientos de cambio de estrategia operante y de estrés. El uso de hisopos de algodón y solución salina estéril también se puede utilizar como una alternativa a esta técnica de cuentagotas. Los datos de las ratas hembra se pueden analizar post-hoc de acuerdo con el día del ciclo estral (considere los días del ciclo cuando se realiza el estrés y / o el día del ciclo cuando se realizan las pruebas).

3. Equipos y software

1. Use cámaras operantes para el entrenamiento y las pruebas de comportamiento.
   1. Asegúrese de que las cámaras contengan al menos dos palancas retráctiles con dos luces de estímulo arriba, una luz doméstica y un dispensador de refuerzo para estas tareas.
   2. Compruebe que las palancas estén a ambos lados del área central de entrega de refuerzo con una luz de estímulo sobre cada palanca.
   3. Use la luz de la casa para iluminar la cámara sin interferir con la detección del estímulo de luz (es mejor si la luz de la casa está en la pared posterior de la cámara, opuesta a las palancas y las luces de estímulo).
2. Use gránulos de alimentos sin polvo (aquí, se utilizan gránulos de 45 mg: 18.7% de proteína, 5.6% de grasa y 4.7% de fibra) para el refuerzo en ratas restringidas en alimentos. No use gránulos ricos en sacarosa o grasa (a menos que haya interés en cómo el estrés afecta la ingesta de alimentos sabrosos).
3. Controlar la presentación de estímulos, el funcionamiento de la palanca y la recolección de datos desde una computadora con software capaz de operar la cámara (Tabla de Materiales).
   NOTA: Para obtener información relacionada con la codificación de programas que utilizan este software, póngase en contacto con los autores. Los scripts de MED-PC se incluyen como archivos complementarios. Este software recopila información sobre las respuestas del animal para cada ensayo (qué palanca se presiona, si es correcta / incorrecta / no responde y latencia para tomar la decisión). A partir de esta información, los usuarios pueden calcular varias medidas en el paradigma conductual, como se describe en la sección de análisis de comportamiento.
4. Realizar entrenamientos/pruebas a la misma hora todos los días para controlar los ritmos circadianos en las hormonas del estrés³² (y otras medidas relevantes).
5. Llene la bandeja inferior de cada caja operante con ropa de cama fresca para recoger heces/residuos. Después de cada sesión, vierta cada bandeja, limpie las bandejas y el interior de la cámara con toallitas con alcohol o un desinfectante aprobado por la IACUC, y reemplácela con ropa de cama fresca antes de colocar un nuevo animal en la cámara.

4. Procedimientos de estrés

1. Decida si el procedimiento de estrés debe realizarse antes, durante y / o después de la capacitación sobre el paradigma de cambio de estrategia operante (por ejemplo, 5 días de estrés de restricción antes de 3 días de entrenamiento operante frente a 3 días de entrenamiento operante seguido de una sola restricción y prueba).
2. Ejecutar el procedimiento de estrés al mismo tiempo diariamente con respecto al entrenamiento operante. (por ejemplo, 30 min de tensión de sujeción a partir de 9 A.M., seguido de la colocación en la cámara operante).
3. Realizar los procedimientos de estrés en una habitación separada de la sala de colonias y de las salas de cambio de paradigma de estrategia (para garantizar que no haya factores de confusión asociados con el estrés de los testigos)³³. Brevemente, coloque a la rata en un tubo de sujeción transparente estilo Broome y selle la abertura, teniendo cuidado de no pellizcar las extremidades o la cola. Entre cada sujeto, use un desinfectante aprobado por IACUC para limpiar el tubo estilo Broome. La desinfección inadecuada puede dejar feromonas que pueden afectar negativamente el protocolo de prueba.
   NOTA: Calcule cuánto tiempo pasará el primer grupo de ratas en las cámaras operantes. Esto variará dependiendo del entrenamiento frente al día de la prueba; sin embargo, después de ejecutar varias cohortes, se puede calcular un tiempo promedio para completar cada tarea para estimar tareas futuras.
4. Dependiendo de cuántas cámaras operantes estén disponibles, escalone el procedimiento de estrés para los sujetos. Por ejemplo, cuatro ratas sufren tensión de restricción y se colocan en cuatro cámaras operantes. Una hora más tarde, cuatro animales más se someten a procedimientos de estrés que deben ser seguidos por la cámara operante.

5. Formación

NOTA: Este paradigma se modifica a partir del procedimiento operante de cambio de conjunto desarrollado por Floresco et al. de tal manera que se puede completar en 3 días^19.  Los procedimientos de entrenamiento para ratas requieren 3 días (1 día para aprender cada tarea como se describe a continuación). Es raro que una rata no aprenda estas tareas. Si una rata no aprende cada tarea, debe excluirse del estudio final. Consulte la Figura 1A para obtener una representación visual del paradigma de entrenamiento que se describe a continuación.

1. Antes de colocar la rata en la cámara, asegúrese de que haya suficientes gránulos de comida en el dispensador y que las cajas operantes funcionen correctamente. Para lograr esto, cargue e inicie un programa de entrenamiento o día de prueba en una cámara vacía, probando manualmente que la palanca correcta entrega adecuadamente una recompensa por prensa de palanca.
2. Entrenar a la rata para presionar cada palanca
   1. Antes de colocar la rata en la caja para el primer día de entrenamiento, coloque manualmente una recompensa de pellet de alimento en la palanca correcta, según lo designado al cargar el procedimiento de entrenamiento dentro de cada cámara.
   2. Entrene a la rata utilizando un horario de relación fija (FR-1), de modo que cada palanca correcta sea recompensada con un refuerzo. Contraequilibre la palanca correcta por día entre sujetos y / o condiciones experimentales (dando forma a una sola palanca a la vez) designando la palanca correcta al cargar el procedimiento de entrenamiento en la computadora que opera las cámaras.
   3. Permita que la rata presione la palanca hasta que alcance el criterio presionando la palanca correcta 50x, generalmente completando la tarea entre 30-45 min.
   4. Al día siguiente forzar a la rata a realizar esta tarea en la palanca opuesta utilizando el mismo programa que el primer día de entrenamiento, pero designar la palanca opuesta como la correcta. No hay necesidad de "dar forma" a la palanca con un pellet de comida en este día de entrenamiento. Por lo general, este criterio se adquiere rápidamente después de que las ratas han aprendido a presionar la primera palanca.
3. Entrenar a la rata para que responda a la señal de luz
   1. En el tercer día de entrenamiento, ilumine la luz sobre ambas palancas durante 15 pruebas, durante las cuales la rata puede presionar una de las palancas para recibir potencialmente una recompensa de pellets de alimento. Durante la tarea de discriminación ligera, este programa seleccionará aleatoriamente qué palanca es correcta prueba por prueba.
   2. Si la rata presiona la palanca correcta, asegúrese de que las luces permanezcan iluminadas durante 3 s y se entregue la recompensa, seguida de un período de 5 s, durante el cual las luces se apagan antes de la próxima prueba. Si la rata presiona la palanca incorrecta, asegúrese de que no se entregue ninguna recompensa y que las luces se apaguen durante los 10 años anteriores a la siguiente prueba.
   3. Después de este último día de entrenamiento, calcule el "sesgo lateral" para determinar si la rata tiene preferencia por la palanca izquierda o derecha dividiendo el número de prensas de una palanca dividido por el número total de prensas de palanca. El día de la prueba, la rata comenzará en su lado menos preferido para asegurarse de que está aprendiendo la contingencia específica de respuesta-recompensa, en lugar de responder a una palanca preferida.

6. Pruebas

NOTA: Consulte la Figura 1B para obtener una descripción visual del paradigma de prueba que se describe a continuación.

1. El día 4 (día de prueba), coloque la rata en la cámara operante siguiendo los procedimientos de estrés y pruébelos en tareas de discriminación lateral, inversión lateral y discriminación ligera en serie. Asegúrese de que la tarea de discriminación de luz solo ilumine la luz por encima de la palanca "correcta". En cada tarea, las ratas deben lograr consecutivamente ocho ensayos correctos para completar cada discriminación sin presionar la palanca incorrecta y no recompensada. Una prensa de palanca incorrecta restablecerá esta cadena de pruebas.
   1. Pruebe a las ratas utilizando la tarea de discriminación lateral. Usando el programa de discriminación lateral, recompense a la rata por presionar la palanca en su lado menos preferido según lo determinado a partir del tercer día de entrenamiento, independientemente de la señal de luz. La tarea termina al presionar la palanca correcta 8x consecutivamente (excluyendo omisiones).
   2. Realice la prueba de inversión lateral ejecutando ratas utilizando el programa de discriminación lateral nuevamente, pero esta vez designando la palanca opuesta a la correcta de la tarea de discriminación lateral como correcta. Asegúrese de que la rata sea recompensada por presionar esta palanca, independientemente de la señal de luz. La tarea termina al presionar la palanca correcta 8x consecutivamente (excluyendo omisiones).
   3. Realice la tarea de discriminación de luz, que recompensa a la rata por presionar la palanca con la luz iluminada arriba. Cada prueba operante se completa al presionar la palanca correcta 8 veces consecutivamente (excluyendo omisiones).
      NOTA: Con base en estudios previos, estas tareas codifican un mínimo de 30 ensayos, independientemente de las prensas consecutivas, para garantizar que las ratas tengan tiempo suficiente para aprender las reglas de cada tarea¹⁸. Por lo tanto, si la rata logra consecutivamente ocho ensayos correctos antes de que se hayan producido 30 ensayos, la tarea permanecerá comprometida hasta que se completen 30 ensayos.

7. Análisis conductual

NOTA: Los datos adquiridos para cada animal el día de la prueba son registrados y guardados automáticamente por la computadora, siempre y cuando se haya iniciado y permitido completar un script MED-PC para cada tarea (consulte los materiales complementarios para los scripts MED-PC).

1. Abra los datos de cada tarea del día de la prueba (discriminación lateral, inversión lateral y discriminación ligera) utilizando el programa informático. Las principales medidas registradas por el programa son los ensayos según el criterio, los errores en el criterio y el tiempo para el criterio. Estas medidas se describen en detalle a continuación.
   NOTA: Los autores han generado un script de MATLAB que permite la automatización del proceso de análisis, así como el análisis de errores perseverantes frente a los regresivos (póngase en contacto con los autores para obtener información de código para agilizar el análisis de datos).
   1. Utilizar los ensayos como criterio (que se refiere al número total de ensayos [sin incluir las omisiones] necesarios para que la rata complete consecutivamente ocho ensayos correctos, incluidos esos ocho ensayos) como el principal indicador de exactitud. Estos datos se encuentran en la primera columna de la matriz B en un archivo de datos generado por el script MED-PC para cualquiera de las tareas del día de la prueba.
   2. Examine el total de errores cometidos durante cada tarea. Estos datos se encuentran en la tercera columna de la matriz B en un archivo de datos generado por el script MED-PC para cualquiera de las tareas del día de la prueba. Estos errores también se clasifican en errores perseverantes o regresivos. Los errores perseverantes se cometen cuando la rata continúa siguiendo la regla anterior de la tarea anterior. Los errores regresivos se cometen después de que se ha desconectado de la regla anterior, pero continúa tratando de adquirir la nueva regla (para obtener más detalles sobre cómo se calculan estos tipos de errores, consulte el método publicado¹⁸).
   3. Si la rata no respondió a una señal de luz dentro de los 15 s, el ensayo se clasifica como una omisión y no contará para el número total de ensayos según el criterio. Calcule esto sumando primero el número de respuestas correctas (ubicadas en la segunda columna de la matriz B en el archivo de datos) y el número de errores (ubicado en la tercera columna de la matriz B en el archivo de datos). A continuación, reste este número del número total de ensayos al criterio (este es el último número de la primera columna de la matriz B en un archivo de datos, diferente de los ensayos al criterio).
   4. Utilice las horas de inicio y finalización registradas por el programa (ubicadas en la parte superior de un archivo de datos generado por el script MED-PC para cualquiera de las tareas del día de la prueba) para calcular el tiempo según el criterio. La latencia a la primera pulsación de palanca también se puede calcular a partir del archivo de datos restando la variable K (tiempo transcurrido en segundos desde la primera pulsación de palanca) del tiempo al criterio.
   5. Promedie los datos para cada medida de comportamiento para ratas dentro del mismo grupo de tratamiento. Realizar análisis estadísticos apropiados (dependiendo de cuántas variables se estén examinando).

8. Sustratos cerebrales

1. Determinar un área cerebral interesada y/o un aspecto de la flexibilidad cognitiva. Por ejemplo, si el estrés aumenta los errores perseverantes en la tarea de inversión lateral, la corteza orbitofrontal (OFC) puede ser de particular interés, ya que estudios de lesiones anteriores han indicado que esta región del cerebro desempeña un papel en muchas formas de aprendizaje de reversión (es decir, inversión espacial probada en la tarea de inversión lateral)^34,35,36. En este ejemplo, sacrifica ratas después de que se completa el paradigma de cambio de estrategia y examina c-fos (medida de activación neuronal³⁷⁾en el OFC utilizando los métodos inmunohistoquímicos descritos²⁵ y descritos brevemente aquí.
   1. Primero, extraiga los cerebros de los animales y córtese en rodajas de 40 μm.
   2. Lave el tejido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 4 veces durante 5 minutos cada una, luego incube en peróxido de hidrógeno al 0,3% durante 10 minutos para apagar las peroxidasas endógenas.
   3. Lave el tejido en PBS 2x durante 5 minutos cada uno, luego incube en anticuerpo primario anti-c-fos de ratón (1:500), suero de burro normal al 3% (NDS) y Tritón X al 0,3% durante la noche.
   4. Al día siguiente, lave el tejido en PBS 3x durante 5 minutos cada uno, luego incube en anticuerpo anti-ratón anti-ratón conjugado con biotina-SP (1:500) durante 2 h.
   5. Lave el tejido en PBS 3x durante 5 minutos cada uno, luego incube en el complejo AVIDIN-Streptavidin AB durante 1 h.
   6. Lave el tejido en PBS 3x durante 5 minutos cada uno, luego incube en solución DAB durante un período de hasta 10 minutos a medida que el tejido sufre una reacción cromogénica de oxidación.
   7. Lave el tejido en PBS 3x durante 5 minutos cada uno, luego monte las rebanadas cerebrales en portaobjetos de microscopio de vidrio.
   8. Cubre el tejido utilizando un medio de montaje a base de tolueno e imagen con un microscopio de campo brillante.
      NOTA: Aquí, como se refleja en los resultados representativos, las ratas se sacrifican 30 minutos después de que finaliza el cambio de paradigma de estrategia, aproximadamente 60-90 minutos después de que se haya completado la tarea de reversión (dependiendo del rendimiento de cada rata en la tarea ligera). Esto debe representar el momento óptimo para la expresión c-fos^38,lo que refleja el rendimiento en la tarea de reversión.
2. Alternativamente, cannulate un área específica del cerebro para la inyección de drogas o la inyección viral antes de la ejecución del estrés o el cambio de paradigma de la estrategia operante.
   NOTA: Los investigadores pueden querer examinar cómo la manipulación de sustratos neuronales altera los efectos del estrés en la flexibilidad cognitiva. Por ejemplo, los investigadores pueden bloquear un receptor de neurotransmisor particular en la corteza prefrontal antes de la prueba.

Resultados

El paradigma de cambio de estrategia operante automatizada adaptada descrito anteriormente se utilizó para determinar si el estrés de restricción repetido afecta la cognición en ratas Sprague Dawley macho y hembra. Los datos de comportamiento representativos se describen en la Figura 2 a continuación. En resumen, las ratas de control y repetidamente restringidas realizaron esta prueba de cambio de estrategia operante, que consistió en una serie de tareas: discriminación lateral, inver...

Discusión

El protocolo demuestra cómo medir los efectos del estrés en la función cognitiva. Específicamente, se utiliza un paradigma de cambio de estrategia operante modificada en roedores, que mide la flexibilidad cognitiva (análoga a la Wisconsin Card Sorting Task en humanos)¹. La flexibilidad cognitiva denota la capacidad de adaptar las estrategias de procesamiento cognitivo para enfrentar nuevas condiciones en el entorno, y es crucial para el funcionamiento diario normal². C...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 inch glass pipette eye droppers	Amazon	4306-30-012LC	For vaginal lavage
Alcohol Wipes	VWR	15648-990	To clean trays in set shifting boxes between rats
Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse lgG (H+L), minimal cross reaction to bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster, horse, human, rabbit, sheep serum proteins	Jackson ImmunoResearch	715-065-150	All other DAB protocol staining materials are standard buffers/DAB and are not specified here, as this is not the main focus of the methods paper
C-fos mouse monoclonal primary antibody	AbCam	ab208942	To stain neural activation in brain areas after set shifting
Dustless Food Pellets	Bio Serv	F0021	For set shifting boxes (dispenser for reward)
GraphPad Prism			Used for data analysis
Leica DM4 B Microscope and associated imaging software	Leica		Lots of different parts for the microscope and work station, for imaging lavage and/or cfos
MatLab			Software; code to help analyze set shifting data, available upon request.
Med-PC Software Suite	Med Associates	SOF-736	Software; uses codes to operate operant chambers
Operant Chambers	Med PC	MED-008-B2	Many different parts for the chamber set up and software to work with it; we also wrote a separate code for set shifting, available upon request.
Rat Bedding	Envigo	T.7097
Rat Chow	Envigo	T.2014.15
Restraint Devices	Bryn Mawr College	Made by our shop	For stress exposure; specifications available upon request.
Scribbles 3d fabric paint	Amazon	54139	For vaginal lavage
Sprague Dawley Rats	Envigo		At least D65 Males and Females
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR	48311-703	For vaginal lavage and/or brain slices/staining for c-fos