Bewertung von Stresseffekten auf die kognitive Flexibilität anhand eines operanten Strategiewechsel-Paradigmas

Zusammenfassung

Stressige Lebensereignisse beeinträchtigen die kognitive Funktion und erhöhen das Risiko psychiatrischer Störungen. Dieses Protokoll veranschaulicht, wie Stress die kognitive Flexibilität beeinflusst, indem ein automatisiertes paradigmatisches Paradigma der operanten Strategie bei männlichen und weiblichen Sprague-Dawley-Ratten verwendet wird. Spezifische Gehirnbereiche, die bestimmten Verhaltensweisen zugrunde liegen, werden diskutiert und die translationale Relevanz der Ergebnisse untersucht.

Zusammenfassung

Stress beeinflusst die kognitive Funktion. Ob Stress die kognitive Funktion verbessert oder beeinträchtigt, hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der 1) Art, Intensität und Dauer des Stressors; 2) Art der untersuchten kognitiven Funktion; und 3) Timing des Stressors in Bezug auf das Lernen oder Ausführen der kognitiven Aufgabe. Darüber hinaus wurden Geschlechtsunterschiede zwischen den Auswirkungen von Stress auf die kognitive Funktion umfassend dokumentiert. Hier beschrieben ist eine Adaption eines automatisierten operanten Strategiewechsel-Paradigmas, um zu beurteilen, wie sich Stressschwankungen auf die kognitive Flexibilität bei männlichen und weiblichen Sprague-Dawley-Ratten auswirken. Insbesondere wird Zurückhaltungsstress vor oder nach dem Training in dieser operantenbasierten Aufgabe verwendet, um zu untersuchen, wie sich Stress auf die kognitive Leistungsfähigkeit bei beiden Geschlechtern auswirkt. Bestimmte Gehirnareale, die mit jeder Aufgabe in diesem automatisierten Paradigma assoziiert sind, sind gut etabliert (d.h. der mediale präfrontale Kortex und der orbitofrontale Kortex). Dies ermöglicht gezielte Manipulationen während des Experiments oder die Beurteilung bestimmter Gene und Proteine in diesen Regionen nach Abschluss des Paradigmas. Dieses Paradigma ermöglicht auch die Erkennung verschiedener Arten von Leistungsfehlern, die nach Stress auftreten und jeweils über definierte neuronale Substrate verfügen. Ebenfalls identifiziert wurden deutliche Geschlechtsunterschiede bei ausdauernden Fehlern nach einem wiederholten Zurückhaltungsstressparadigma. Die Verwendung dieser Techniken in einem präklinischen Modell kann zeigen, wie sich Stress auf das Gehirn auswirkt und die Kognition bei psychiatrischen Störungen wie posttraumatischer Belastungsstörung (PTBS) und schwerer depressiver Störung (MDD) beeinträchtigt, die deutliche Geschlechtsunterschiede in der Prävalenz aufweisen.

Einleitung

Beim Menschen können stressige Lebensereignisse die kognitive Funktion beeinträchtigen (d.h. kognitive Flexibilität¹), was die Fähigkeit bezeichnet, kognitive Verarbeitungsstrategien an neue Bedingungen in der Umwelt anzupassen². Eine Beeinträchtigung der Kognition beschleunigt und verschlimmert viele psychiatrische Störungen wie posttraumatische Belastungsstörung (PTBS) und Major Depressive Disorder (MDD)^3,4. Diese Störungen sind bei den Frauen⁵, 6^,7,8doppelt so häufig, doch die biologische Grundlage für diese Ungleichheit bleibt unbekannt. Aspekte der exekutiven Funktion beim Menschen können mit der Wisconsin Card Sorting Task, einer Demonstration der kognitiven Flexibilität^2,bewertet werden. Die Leistung bei dieser Aufgabe ist bei Patienten mit PTBS⁹ und MDD¹⁰beeinträchtigt, aber die neuronalen Grundlagen dieser Veränderung können nur durch Bildgebung des Gehirns untersucht werden¹¹.

Fortschritte im Verständnis, wie sich Stress auf das Gehirn auswirkt, wurden durch die Verwendung von Tiermodellen, insbesondere Nagetieren, erzielt. Da die kognitive Flexibilität bei stressbedingten Erkrankungen beeinträchtigt ist, ist es ein außergewöhnlich relevanter Phänotyp, der bei Nagetieren untersucht werden muss. Bis heute hat die meiste Stress-Neurobiologie-Literatur ein alternatives kognitives Flexibilitätsparadigma verwendet (manchmal auch als Grabaufgabe bezeichnet)^12,13,14,15. Während diese Aufgabe ausführlich überprüft wurde, erfordert es mehr Zeit und Mühe vom Experimentator, Nagetiere zu trainieren. Angepasst und beschrieben ist hier ein gut etabliertes automatisiertes Set-Shifting-Protokoll¹⁶ zur Beurteilung der kognitiven Flexibilität bei männlichen und weiblichen Sprague-Dawley-Ratten unter Verwendung verschiedener Stressmodelle^17,18. Das Verfahren erfordert eine minimale Aufsicht durch den Experimentator und ermöglicht es, mehrere Ratten gleichzeitig zu testen. Darüber hinaus erfordert die Anpassung dieses Paradigmas im Gegensatz zu anderen Versionen dieser automatisierten Aufgabe¹⁹nur 3 Tage Training und beinhaltet eine effiziente programmierte Datenanalyse.

Ob Stress die kognitive Funktion verbessert oder beeinträchtigt, hängt von der Art, Intensität und Dauer des Stressors sowie dem Zeitpunkt des Stressors in Bezug auf das Lernen oder Ausführen einer kognitiven Aufgabe^{ab 20,21}. Daher beinhaltet das Protokoll Stressverfahren sowohl vor als auch nach dem Operandentraining. Es untersucht auch repräsentative Ergebnisse aus Stressstudien. Darüber hinaus sind die Gehirnregionen, die bestimmten Aspekten der Mengenverschiebung zugrunde^liegen,gut etabliert²,^16,22; Daher beschreibt der Bericht auch, wie bestimmte Gehirnregionen während oder nach den Stress- und Strategiewechselverfahren gezielt und bewertet werden können.

Es gibt nur begrenzte Forschung zur direkten Untersuchung von Geschlechtsunterschieden in der kognitiven Flexibilität^18,23.  Das Protokoll beschreibt, wie 1) sowohl männliche als auch weibliche Ratten in das experimentelle Paradigma einbezogen werden können, dann 2) Östruszyklen vor und während der Verfahren bei frei kreisenden Weibchen verfolgt werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Stress vor dem operativen Training bei Ratten zu geschlechtsspezifischen Defiziten in der kognitiven Flexibilität führen kann¹⁷. Insbesondere weibliche Ratten zeigen Störungen der kognitiven Flexibilität nach Stress, während sich die kognitive Flexibilität bei männlichen Ratten nach Stress verbessert¹⁷. Interessanterweise ist ein Hauptmerkmal stressbedingter psychiatrischer Störungen, die beim Menschen eine geschlechtsspezifische Inzidenz aufweisen, die kognitive Inflexibilität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Frauen anfälliger für diese Art von kognitiver Beeinträchtigung sein können als Männer. Die Verwendung dieser Techniken in Tiermodellen wird Aufschluss über die Auswirkungen von Stress auf das Gehirn geben und wie er die Kognition bei psychiatrischen Störungen beim Menschen beeinträchtigt.

Protokoll

Alle Verfahren in dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Bryn Mawr College genehmigt. Holen Sie die IACUC- oder anderweitig anwendbare behördliche Genehmigung ein, bevor Sie Labortiere bestellen und mit den Versuchen beginnen.

1. Tierpräparation

1. Erwerben Sie männliche und weibliche erwachsene Sprague Dawley Ratten.
   HINWEIS: Die Ratten können vor dem Alter von 65 Tagen entbunden werden, beginnen jedoch erst nach diesem Zeitpunkt mit den Verfahren, um sicherzustellen, dass sowohl Männchen als auch Weibchen voll ausgereift sind.
2. Paarhaus gleichgeschlechtliche Ratten für so lange wie möglich, da langfristige Isolation ein Stressor^{ist 24}. Für Nahrungsbeschränkungen, einzeln Hausratten kurz vor dem operanten Strategieverschiebungsprotokoll.
3. Beginnen Sie nach 1 Woche der Akklimatisierung vorsichtig mit dem Umgang mit Ratten für 3-5 Minuten pro Tag. Sammeln Sie das Körpergewicht jeder Ratte. Wenn Sie daran interessiert sind, zu beurteilen, wie Gonadenhormone die Ergebnisse beeinflussen können, sammeln Sie außerdem vaginale Lavage für weibliche Ratten (beschrieben in Abschnitt 2).
4. Beschränken Sie (aus der Nahrung) Tiere, die mindestens 3 Tage vor Beginn des Trainings im paradigma des operativen Strategiewechsels ausgeführt werden, damit sie die Aufgabe erfolgreich erlernen. Stellen Sie sicher, dass Wasser immer frei verfügbar ist. Für jedes Tier sollten schriftliche Aufzeichnungen geführt werden, um den täglichen Nahrungs- und Flüssigkeitsverbrauch, den Flüssigkeitsstatus sowie alle Verhaltens- und klinischen Veränderungen zu dokumentieren, die als Kriterien für die vorübergehende oder dauerhafte Entfernung eines Tieres aus einem Protokoll verwendet werden (Morton 2000; NRC 2003b).
   1. Wenn Sie vor dem Training länger als 3 Tage ein Belastungsverfahren anwenden, passen Sie die Nahrungseinschränkung an die Anzahl der Stresstage an (z. B. 5 Tage Zurückhaltung plus Nahrungsbeschränkung²⁵).
   2. Liefern Sie jeden Tag 80% der normalen täglichen Nahrungsaufnahme (dh 4 g Nahrung pro 100 g Körpergewicht)²⁶. Verwenden Sie die tägliche Gewichtssammlung für die Ratte, um zu berechnen, wie viel Nahrung Sie jeden Tag geben sollen.
   3. Setzen Sie die Nahrungsbeschränkung während der Trainings- und Testtage fort. Legen Sie das Futter jedoch erst in den Heimkäfig, nachdem die Ratte das Training oder den Test für den Tag abgeschlossen hat, da sie sonst nicht motiviert werden, die Aufgaben für eine Belohnung für Futterpellets auszuführen. Stellen Sie sicher, dass der Zeitpunkt der Futterlieferung an Ratten nach Abschluss der Aufgabe ziemlich unvorhersehbar ist, da dies dazu beiträgt, eine verminderte Motivation zu vermeiden, in der Operantenkammer aufzutreten (zugunsten des einfachen Wartens auf Nahrung im Heimkäfig danach).
      HINWEIS: Tiere, die sich dem Zurückhaltungsstressparadigma unterziehen, zeigen keinen signifikant größeren Gewichtsverlust als unkontrollierte, gestresste Probanden. Verschiedene Stressverfahren können jedoch selbst einen Gewichtsverlust induzieren, was dazu führt, dass Ratten während einer auf dem Körpergewicht basierenden Nahrungsbeschränkung weniger Nahrung erhalten als unbetonte Gegenstücke. Dies kann einen zusätzlichen, verwirrenden Stressor darstellen. Wenn dies der Fall zu sein scheint, verwenden Sie alternativ eine feste Menge an Nahrung, die jedem Subjekt gegeben wird, unabhängig vom Gewicht²⁷.

2. Vaginale Lavage

HINWEIS: Es ist bekannt, dass Gonadenhormone (d. H. Östrogen und Progesteron) die Stressreaktion und Kognition beeinflussen^28,29,30. Diese Hormone schwanken über den Östruszyklus weiblicher Ratten³¹. Wenn Sie daran interessiert sind, den Östruszyklus von frei kreisenden weiblichen Nagetieren zu verfolgen, um mit Stress- oder kognitiven Flexibilitätsdaten zu korrelieren, sammeln Sie vaginale Lavage wie unten beschrieben. Repräsentative Daten, die das Stadium des Östruszyklus berücksichtigen, werden nicht vorgelegt.

1. Um vaginale Lavage-Proben von Frauen zu erhalten, sammeln Sie warmes Wasser in einem sauberen Becher, einer Glasböse, einem "Lavage" -Objektträger (Mikroskop-Objektträger mit Acryl-Farbkreisen, um die Lavage-Probe zu halten) und einem leeren Becherglas.
2. Füllen Sie die Pipette mit einer kleinen Menge warmem Wasser (~ 0,5 ml) und führen Sie dann die Spitze in die Vagina der weiblichen Ratte ein (durch Anheben am Schwanz). Das sterile Wasser 2x–3x ausstoßen und die gesammelte Flüssigkeit auf einen mikroskopisch kleinen Objektträger ausstoßen. Den Lavage-Schiebekreis nicht überlaufen lassen.
3. Überschüssige Flüssigkeit in das leere Becherglas ausstoßen. Beschriften Sie den Lavage-Objektträger mit Rattennummern und legen Sie die Proben von jeder Ratte in diese Reihenfolge, damit klar ist, welche Probe zu jeder Ratte gehört.
4. Spülen Sie die Pipette gründlich aus, indem Sie sauberes warmes Wasser pipettieren und mehrmals in das "überschüssige" Becherglas geben, bevor Sie die Pipette füllen, um die nächste Ratte zu beproben.
5. Tragen Sie den Lavage-Objektträger vorsichtig zu einem Hellfeldmikroskop, um die Lavage-Probe abzubilden und den Tag innerhalb des Östruszyklus zu klassifizieren, wie in Becker et al³¹beschrieben.
   HINWEIS: Idealerweise sollte die Spülung für einige Wochen durchgeführt werden, um den Zyklus einer Frau richtig zu verfolgen, und sollte jeden Tag zu einer sehr ähnlichen Zeit durchgeführt werden, um den circadianen Rhythmus zu kontrollieren. Vorzugsweise sollte dieses Verfahren vor Stress- und operanten Strategiewechselverfahren durchgeführt werden. Die Verwendung von Wattestäbchen und steriler Kochsalzlösung kann auch als Alternative zu dieser Eye-Dropper-Technik verwendet werden. Daten für weibliche Ratten können post-hoc nach dem Tag des Östruszyklus analysiert werden (betrachten Sie die Tage des Zyklus, an denen Stress durchgeführt wird, und / oder den Zyklustag, an dem tests durchgeführt wird).

3. Ausrüstung und Software

1. Verwenden Sie operante Kammern für Verhaltenstraining und -tests.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Kammern mindestens zwei versenkbare Hebel mit zwei darüber liegenden Stimulusleuchten, ein Hauslicht und einen Spender zur Verstärkung für diese Aufgaben enthalten.
   2. Überprüfen Sie, ob sich die Hebel auf beiden Seiten des zentralen Verstärkungsabgabebereichs befinden, mit einem Stimuluslicht über jedem Hebel.
   3. Verwenden Sie das Hauslicht, um die Kammer zu beleuchten, ohne die Erkennung des Lichtreizes zu beeinträchtigen (es ist am besten, wenn sich das Hauslicht an der Rückwand der Kammer befindet, gegenüber den Hebeln und Stimuluslichtern).
2. Verwenden Sie staubfreie Futterpellets (hier werden 45 mg Pellets verwendet: 18,7% Protein, 5,6% Fett und 4,7% Ballaststoffe) zur Verstärkung bei Ratten mit eingeschränkter Ernährung. Verwenden Sie keine Pellets mit hohem Saccharose- oder Fettgehalt (es sei denn, es besteht Interesse daran, wie sich Stress auf die schmackhafte Nahrungsaufnahme auswirkt).
3. Steuern Sie die Darstellung von Reizen, die Hebelbetätigung und die Datenerfassung von einem Computer aus mit einer Software, die in der Lage ist, die Kammer zu bedienen (Materialtabelle).
   HINWEIS: Für Informationen zur Codierung von Programmen, die diese Software verwenden, wenden Sie sich an die Autoren. MED-PC-Skripts sind als ergänzende Dateien enthalten. Diese Software sammelt Informationen über die Reaktionen des Tieres für jeden Versuch (welcher Hebel gedrückt wird, ob er richtig / falsch / keine Reaktion ist und Latenz, um die Wahl zu treffen). Aus diesen Informationen können Benutzer verschiedene Messgrößen im Verhaltensparadigma berechnen, wie im Abschnitt Verhaltensanalyse beschrieben.
4. Führen Sie jeden Tag zur gleichen Zeit Training / Tests durch, um den circadianen Rhythmus in Stresshormonen³² (und andere relevante Maßnahmen) zu kontrollieren.
5. Füllen Sie das untere Tablett jeder Operantenbox mit frischer Bettwäsche, um Kot / Abfall zu sammeln. Entleeren Sie nach jeder Sitzung jedes Tablett, reinigen Sie die Tabletts und das Innere der Kammer mit Alkoholtüchern oder einem IACUC-zugelassenen Desinfektionsmittel und ersetzen Sie es durch frische Einstreu, bevor Sie ein neues Tier in die Kammer legen.

4. Stressverfahren

1. Entscheiden Sie, ob das Stressverfahren vor, während und/oder nach dem Training des Paradigmas des operativen Strategiewechsels durchgeführt werden soll (z. B. 5 Tage Zurückhaltungsstress vor 3 Tagen Operanttraining vs. 3 Tage Operantentraining, gefolgt von einer einzigen Zurückhaltung und Prüfung).
2. Führen Sie das Stressverfahren täglich zur gleichen Zeit in Bezug auf das Operantentraining durch. (z. B. 30 Minuten Rückhaltebelastung ab 9 A.M., gefolgt von der Platzierung in der Operantenkammer).
3. Führen Sie die Stressverfahren in einem separaten Raum sowohl aus dem Kolonieraum als auch aus dem Strategiewechsel-Paradigmenraum durch (um sicherzustellen, dass keine Störfaktoren im Zusammenhang mit Zeugenstress vorhanden sind)³³. Legen Sie die Ratte kurz in ein transparentes Rückhalterohr im Broome-Stil und versiegeln Sie die Öffnung, wobei Sie darauf achten, die Gliedmaßen oder den Schwanz nicht zu kneifen. Verwenden Sie zwischen jedem Probanden ein IACUC-zugelassenes Desinfektionsmittel, um das Broome-Röhrchen zu reinigen. Eine unsachgemäße Desinfektion kann Pheromone hinterlassen, die das Testprotokoll beeinträchtigen können.
   HINWEIS: Schätzen Sie, wie lange die erste Gruppe von Ratten in den Operantenkammern verbringen wird. Dies variiert je nach Training und Testtag. Nach dem Ausführen mehrerer Kohorten kann jedoch eine durchschnittliche Zeit berechnet werden, um jede Aufgabe abzuschließen, um zukünftige Aufgaben abzuschätzen.
4. Je nachdem, wie viele Operantenkammern zur Verfügung stehen, staffeln Sie das Belastungsverfahren für Probanden. Zum Beispiel unterliegen vier Ratten einem Rückhaltestress und werden in vier Operandenkammern untergebracht. Eine Stunde später unterziehen sich vier weitere Tiere einem Stressverfahren, dem die Operantenkammer folgen wird.

5. Schulung

HINWEIS: Dieses Paradigma ist von dem von Floresco et al. entwickelten operanten Set-Shifting-Verfahren so modifiziert, dass es in 3 Tagen abgeschlossen werden kann¹⁹.  Trainingsverfahren für Ratten benötigen 3 Tage (1 Tag, um jede Aufgabe wie unten beschrieben zu erlernen). Es ist selten, dass eine Ratte diese Aufgaben nicht lernt. Wenn eine Ratte jede Aufgabe nicht lernt, sollte sie von der Abschlussstudie ausgeschlossen werden. Siehe Abbildung 1A für eine visuelle Darstellung des unten beschriebenen Trainingsparadigmas.

1. Bevor Sie die Ratte in die Kammer legen, stellen Sie sicher, dass genügend Futterpellets im Spender vorhanden sind und dass die Operantenboxen ordnungsgemäß funktionieren. Um dies zu erreichen, laden und initiieren Sie ein Trainings- oder Testtagesprogramm in einer leeren Kammer und testen Sie manuell, ob der richtige Hebel eine Belohnung pro Hebeldruck liefert.
2. Trainieren Sie die Ratte, um jeden Hebel zu drücken
   1. Bevor Sie die Ratte für den ersten Trainingstag in die Box legen, legen Sie manuell eine Futterpelletbelohnung auf den richtigen Hebel, wie beim Laden des Trainingsvorgangs in jeder Kammer angegeben.
   2. Trainieren Sie die Ratte mit einem festen Verhältnis (FR-1) Zeitplan, so dass jede richtige Hebelpresse mit einer Verstärkung belohnt wird. Gleichen Sie den richtigen Hebel pro Tag über Themen und / oder experimentelle Bedingungen hinweg aus (indem Sie jeweils nur einen Hebel formen), indem Sie den richtigen Hebel beim Laden des Trainingsverfahrens auf den Computer, der die Kammern bedient, festlegen.
   3. Lassen Sie die Ratte den Hebel drücken, bis sie das Kriterium erreicht, indem Sie den richtigen Hebel 50x drücken und die Aufgabe normalerweise zwischen 30 und 45 Minuten abschließen.
   4. Zwingen Sie die Ratte am folgenden Tag, diese Aufgabe am gegenüberliegenden Hebel mit dem gleichen Programm wie am ersten Trainingstag auszuführen, aber bestimmen Sie den gegenüberliegenden Hebel als den richtigen. Es besteht keine Notwendigkeit, den Hebel an diesem Trainingstag mit einem Futterpellet zu "formen". Typischerweise wird dieses Kriterium schnell erworben, nachdem Ratten gelernt haben, den ersten Hebel zu drücken.
3. Trainieren Sie die Ratte, um auf den Lichtreiz zu reagieren
   1. Beleuchten Sie am dritten Trainingstag das Licht über beiden Hebeln für 15-s-Versuche, bei denen die Ratte einen Hebel drücken kann, um möglicherweise eine Belohnung für Futterpellets zu erhalten. Während der Lichtunterscheidungsaufgabe wählt dieses Programm nach dem Zufallsprinzip aus, welcher Hebel probeweise richtig ist.
   2. Wenn die Ratte den richtigen Hebel drückt, stellen Sie sicher, dass die Lichter für 3 s leuchten und die Belohnung geliefert wird, gefolgt von einer Periode von 5 s, in der die Lichter vor dem nächsten Versuch ausgeschaltet werden. Wenn die Ratte den falschen Hebel drückt, stellen Sie sicher, dass keine Belohnung geliefert wird und dass die Lichter vor dem nächsten Versuch für 10 s ausgeschaltet sind.
   3. Berechnen Sie nach diesem letzten Trainingstag die "Seitenverzerrung", um festzustellen, ob die Ratte eine Präferenz für den linken oder rechten Hebel hat, indem Sie die Anzahl der Drücke eines Hebels dividiert durch die Gesamtzahl der Hebeldrücke dividieren. Am Testtag beginnt die Ratte auf ihrer am wenigsten bevorzugten Seite, um sicherzustellen, dass sie die spezifische Reaktions-Belohnungs-Kontingenz lernt, anstatt auf einen bevorzugten Hebel zu reagieren.

6. Prüfung

HINWEIS: In Abbildung 1B finden Sie eine visuelle Darstellung des unten beschriebenen Testparadigmas.

1. Legen Sie die Ratte an Tag 4 (Testtag) nach Stressverfahren in die Operanzkammer und testen Sie sie seriell in Seitenunterscheidungs-, Seitenumkehr- und Lichtunterscheidungsaufgaben. Stellen Sie sicher, dass die Lichtunterscheidungsaufgabe nur das Licht über dem "richtigen" Hebel beleuchtet. Bei jeder Aufgabe müssen Ratten nacheinander acht korrekte Versuche durchführen, um jede Diskriminierung abzuschließen, ohne den unbelohnten, falschen Hebel zu drücken. Ein falscher Hebeldruck setzt diese Kette von Versuchen zurück.
   1. Testen Sie Ratten mit der Nebendiskriminierungsaufgabe. Belohnen Sie die Ratte mit dem Seitenunterscheidungsprogramm für das Drücken des Hebels auf ihrer am wenigsten bevorzugten Seite, wie ab dem dritten Trainingstag festgelegt, unabhängig vom Lichtsignal. Die Aufgabe endet mit 8x hintereinander (ohne Auslassungen) mit dem richtigen Hebel.
   2. Führen Sie den Seitenumkehrtest durch, indem Sie Ratten mit dem Seitenunterscheidungsprogramm erneut ausführen, aber diesmal den Hebel, der dem richtigen aus der Seitenunterscheidungsaufgabe entgegengesetzt ist, als korrekt bezeichnen. Stellen Sie sicher, dass die Ratte für das Drücken dieses Hebels belohnt wird, unabhängig vom Lichtsignal. Die Aufgabe endet mit 8x hintereinander (ohne Auslassungen) mit dem richtigen Hebel.
   3. Führen Sie die Lichtunterscheidungsaufgabe aus, bei der die Ratte für das Drücken des Hebels mit dem oben beleuchteten Licht belohnt wird. Jeder Operanttest ist abgeschlossen, wenn der richtige Hebel 8x hintereinander gedrückt wird (ohne Auslassungen).
      HINWEIS: Basierend auf früheren Studien kodieren diese Aufgaben mindestens 30 Versuche, unabhängig von aufeinanderfolgenden Pressen, um sicherzustellen, dass Ratten genügend Zeit haben, die Regeln jeder Aufgabe zu lernen¹⁸. Wenn die Ratte also nacheinander acht korrekte Studien erreicht, bevor 30 Studien stattgefunden haben, bleibt die Aufgabe so lange beschäftigt, bis 30 Studien abgeschlossen sind.

7. Verhaltensanalyse

HINWEIS: Die für jedes Tier am Testtag erfassten Daten werden automatisch aufgezeichnet und vom Computer gespeichert, sofern für jede Aufgabe ein MED-PC-Skript initiiert und ausgeführt werden kann (siehe ergänzende Materialien für MED-PC-Skripte).

1. Öffnen Sie die Daten für jede Testtagsaufgabe (Seitenunterscheidung, Seitenumkehr und Lichtunterscheidung) mit dem Computerprogramm. Die wichtigsten Maßnahmen, die vom Programm aufgezeichnet werden, sind Versuche zum Kriterium, Fehler im Kriterium und Zeit zum Kriterium. Diese Maßnahmen werden im Folgenden ausführlich beschrieben.
   HINWEIS: Die Autoren haben ein MATLAB-Skript generiert, das die Automatisierung des Analyseprozesses sowie die Analyse von ausdauernden vs. regressiven Fehlern ermöglicht (kontaktieren Sie die Autoren für Codeinformationen, um die Datenanalyse zu optimieren).
   1. Verwenden Sie Versuche als Kriterium (was sich auf die Gesamtzahl der Versuche [ohne Auslassungen] bezieht, die für die Ratte erforderlich sind, um acht korrekte Versuche, einschließlich dieser acht Versuche, nacheinander abzuschließen) als Hauptindikator für die Genauigkeit. Diese Daten befinden sich in der ersten Spalte in Feld B in einer Datendatei, die vom MED-PC-Skript für eine der Aufgaben am Testtag generiert wird.
   2. Untersuchen Sie die Gesamtfehler, die während der einzelnen Aufgaben aufgetreten sind. Diese Daten befinden sich in der dritten Spalte von Array B in einer Datendatei, die vom MED-PC-Skript für eine der Aufgaben am Testtag generiert wird. Diese Fehler werden auch in dauerhafte oder regressive Fehler kategorisiert. Beharrliche Fehler werden begangen, wenn die Ratte weiterhin die frühere Regel aus der vorherigen Aufgabe befolgt. Regressive Fehler werden begangen, nachdem sie sich von der vorherigen Regel gelöst hat, aber weiterhin versucht, die neue Regel zu erwerben (weitere Informationen zur Berechnung dieser Fehlertypen finden Sie in der veröffentlichten Methode¹⁸).
   3. Wenn die Ratte innerhalb von 15 s nicht auf einen Lichtreiz reagierte, wird die Studie als Auslassung eingestuft und zählt nicht zur Gesamtzahl der zu kritischen Studien. Berechnen Sie dies, indem Sie zuerst die Anzahl der richtigen Antworten (in der zweiten Spalte von Array B in der Datendatei) und die Anzahl der Fehler (in der dritten Spalte von Array B in der Datendatei) addieren. Als nächstes subtrahieren Sie diese Zahl von der Gesamtzahl der Versuche zu Kriterium (dies ist die letzte Zahl in der ersten Spalte von Array B in einer Datendatei, die sich von den Versuchen zu Kriterium unterscheidet).
   4. Verwenden Sie die vom Programm aufgezeichneten Start- und Endzeiten (oben in einer Datendatei, die vom MED-PC-Skript für eine der Aufgaben am Testtag generiert wurde), um die Zeit bis zum Kriterium zu berechnen. Die Latenz zum ersten Hebeldruck kann auch aus der Datendatei berechnet werden, indem die Variable K (verstrichene Zeit in Sekunden ab dem ersten Hebeldruck) von der Zeit zum Kriterium subtrahiert wird.
   5. Mittelwert der Daten für jedes Verhaltensmaß für Ratten innerhalb derselben Behandlungsgruppe. Führen Sie geeignete statistische Analysen durch (je nachdem, wie viele Variablen untersucht werden).

8. Gehirnsubstrate

1. Bestimmen Sie einen interessierten Gehirnbereich und / oder Aspekt der kognitiven Flexibilität. Zum Beispiel, wenn Stress ausdauernde Fehler in der Seitenumkehraufgabe erhöht, kann der orbitofrontale Kortex (OFC) von besonderem Interesse sein, da frühere Läsionsstudien gezeigt haben, dass diese Gehirnregion eine Rolle bei vielen Formen des Umkehrungslernens spielt (dh räumliche Umkehrung, die in der Seitenumkehraufgabe getestet wurde)^34,35,36. In diesem Beispiel opfern Ratten nach Abschluss des Strategiewechsel-Paradigmas und untersuchen c-fos (Maß der neuronalen Aktivierung³⁷⁾im OFC unter Verwendung der beschriebenen immunhistochemischen Methoden²⁵ und hier kurz beschrieben.
   1. Extrahieren Sie zunächst Gehirne aus Tieren und schneiden Sie sie in 40 μm große Scheiben.
   2. Waschen Sie das Gewebe in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 4x für jeweils 5 min, dann inkubieren Sie in 0,3% Wasserstoffperoxid für 10 min, um endogene Peroxidasen zu löschen.
   3. Waschen Sie das Gewebe in PBS 2x für jeweils 5 min, dann inkubieren Sie es in Maus Anti-C-Fos Primärantikörper (1:500), 3% normalem Eselserum (NDS) und 0,3% Triton X über Nacht.
   4. Am nächsten Tag das Gewebe in PBS 3x für jeweils 5 min waschen und dann 2 h in Biotin-SP-konjugiertem Esel-Anti-Maus-Antikörper (1:500) inkubieren.
   5. Gewebe in PBS 3x für jeweils 5 min waschen, dann 1 h im Avidin-Streptavidin AB-Komplex inkubieren.
   6. Waschen Sie das Gewebe in PBS 3x für jeweils 5 min und inkubieren Sie es dann in DAB-Lösung für bis zu 10 min, während das Gewebe einer oxidationschromogenen Reaktion unterzogen wird.
   7. Waschen Sie das Gewebe in PBS 3x für jeweils 5 min, dann montieren Sie die Gehirnscheiben auf Glasmikroskop-Objektträgern.
   8. Decken Sie das Gewebe mit einem Toluol-basierten Montagemedium ab und bilden Sie es mit einem Hellfeldmikroskop ab.
      HINWEIS: Hier, wie sich in den repräsentativen Ergebnissen widerspiegelt, werden Ratten 30 Minuten nach dem Ende des Strategiewechsel-Paradigmas geopfert, etwa 60-90 Minuten nach Abschluss der Umkehraufgabe (abhängig von der Leistung jeder Ratte in der Lichtaufgabe). Dies sollte ein optimales Timing für den c-fos-Ausdruck³⁸darstellen, der die Leistung in der Umkehraufgabe widerspiegelt.
2. Alternativ können Sie einen bestimmten Gehirnbereich für die Injektion von Medikamenten oder die Virusinjektion vor der Ausführung von Stress oder dem paradigmatischen Paradigmenwechsel der operanten Strategie kanülieren.
   HINWEIS: Forscher möchten möglicherweise untersuchen, wie die Manipulation neuronaler Substrate die Auswirkungen von Stress auf die kognitive Flexibilität verändert. Zum Beispiel können Forscher einen bestimmten Neurotransmitterrezeptor im präfrontalen Kortex vor dem Testen blockieren.

Ergebnisse

Das oben beschriebene angepasste paradigma des automatisierten paradigma des strategiewechsels wurde verwendet, um festzustellen, ob wiederholter Zurückhaltungsstress die Kognition bei männlichen und weiblichen Sprague-Dawley-Ratten beeinflusst. Repräsentative Verhaltensdaten sind in Abbildung 2 unten beschrieben. Kurz gesagt, Kontroll- und wiederholt zurückgehaltene Ratten führten diesen operanten Strategiewechseltest durch, der aus einer Reihe von Aufgaben bestand: Seitenunterscheidun...

Diskussion

Das Protokoll zeigt, wie die Auswirkungen von Stress auf die kognitive Funktion gemessen werden können. Insbesondere wird bei Nagetieren ein modifiziertes operatives Strategiewechselparadigma verwendet, das die kognitive Flexibilität misst (analog zur Wisconsin Card Sorting Task beim Menschen)¹. Kognitive Flexibilität bezeichnet die Fähigkeit, kognitive Verarbeitungsstrategien an neue Bedingungen in der Umwelt anzupassen, und sie ist entscheidend für das normale tägliche Funktionieren

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 inch glass pipette eye droppers	Amazon	4306-30-012LC	For vaginal lavage
Alcohol Wipes	VWR	15648-990	To clean trays in set shifting boxes between rats
Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse lgG (H+L), minimal cross reaction to bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster, horse, human, rabbit, sheep serum proteins	Jackson ImmunoResearch	715-065-150	All other DAB protocol staining materials are standard buffers/DAB and are not specified here, as this is not the main focus of the methods paper
C-fos mouse monoclonal primary antibody	AbCam	ab208942	To stain neural activation in brain areas after set shifting
Dustless Food Pellets	Bio Serv	F0021	For set shifting boxes (dispenser for reward)
GraphPad Prism			Used for data analysis
Leica DM4 B Microscope and associated imaging software	Leica		Lots of different parts for the microscope and work station, for imaging lavage and/or cfos
MatLab			Software; code to help analyze set shifting data, available upon request.
Med-PC Software Suite	Med Associates	SOF-736	Software; uses codes to operate operant chambers
Operant Chambers	Med PC	MED-008-B2	Many different parts for the chamber set up and software to work with it; we also wrote a separate code for set shifting, available upon request.
Rat Bedding	Envigo	T.7097
Rat Chow	Envigo	T.2014.15
Restraint Devices	Bryn Mawr College	Made by our shop	For stress exposure; specifications available upon request.
Scribbles 3d fabric paint	Amazon	54139	For vaginal lavage
Sprague Dawley Rats	Envigo		At least D65 Males and Females
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR	48311-703	For vaginal lavage and/or brain slices/staining for c-fos