オペラ戦略シフトパラダイムを用いた認知の柔軟性に対するストレス効果の評価

要約

ストレスの多い生命事象は認知機能を損ない、精神疾患のリスクを高める。このプロトコルは、男性と女性のスプレイグ・ドーリーラットのパラダイムをシフトする自動化されたオペラ戦略を使用して、ストレスが認知の柔軟性にどのような影響を与えるかを示しています。特定の行動の根底にある特定の脳領域について議論し、結果の翻訳関連性を探求する。

要約

ストレスは認知機能に影響を与えます。ストレスが認知機能を高めるか損なうかは、1)タイプ、強度、ストレータの持続時間を含むいくつかの要因に依存します。2)研究中の認知機能の種類;そして3)認知タスクの学習または実行に関連するストレータのタイミング。さらに、ストレスが認知機能に及ぼす影響の性差が広く文書化されている。ここでは、ストレスの変動が男性と女性のスプレイグ・ドーリーラットの認知柔軟性にどのような影響を与えるかを評価するための自動化されたオペラ戦略シフトパラダイムの適応です。具体的には、拘束ストレスは、ストレスが男女の認知能力にどのような影響を与えるかを調べるために、このオペラベースのタスクのトレーニングの前後に使用されます。この自動化されたパラダイムにおける各タスクに関連する特定の脳領域は、十分に確立されている(すなわち、内側前頭前野および眼窩前頭皮質)。これにより、パラダイムの完了時に、実験中の標的操作や、これらの領域の特定の遺伝子およびタンパク質の評価が可能になります。このパラダイムは、ストレスの後に発生するさまざまなタイプのパフォーマンスエラーを検出することを可能にし、それぞれが神経基質を定義しています。また、繰り返し拘束ストレスパラダイムの後の忍耐エラーにおける明確な性差も同定される。前臨床モデルでこれらの技術を使用すると、ストレスが脳にどのような影響を与え、心的外傷後ストレス障害(PTSD)や大うつ病性障害(MDD)などの精神疾患の認知を損なう可能性があります。

概要

人間では、ストレスの多いライフイベントは、認知機能(すなわち、認知の柔軟性¹⁾を損なう可能性があり、これは認知処理戦略を環境の新しい条件に直面するように適応する能力を意味する^2。認知障害は、心的外傷後ストレス障害(PTSD)および大うつ病障害(MDD)3,4などの多くの精神疾患を引き起こし^、悪化させる。これらの疾患は女性^{5、6、7、8}の2倍の流行であるが^、この格差の生物学的根拠は不明のままである。人間のエグゼクティブ機能の側面は、ウィスコンシンカードソーティングタスク、認知柔軟性^{のデモンストレーション2}を使用して評価することができます。このタスクにおけるパフォーマンスは、PTSD⁹およびMDD¹⁰を有する患者において損なわれるが、この変化の神経基盤は脳イメージング¹¹によってしか調べることができない。

ストレスが脳にどのような影響を与えるかを理解する上での進歩は、動物モデル、特にげっ歯類の使用を通じて行われてきた。認知の柔軟性はストレス関連疾患に影響を受けるので、げっ歯類を調べるのは非常に関連性の高い表現型です。現在までに、ほとんどのストレス神経生物学の文献は、代替認知柔軟性パラダイム(掘り出し作業とも呼ばれます)12、13、14、15を使用しています。このタスクは広範囲に検証されていますが、げっ歯類を訓練するには実験者によってより多くの時間と労力が必要です。適応し、ここで説明は、様々なストレスモデル^17、18を使用して男性と女性のスプレイグドーレーラットの認知の柔軟性を評価するために確立された自動セットシフトプロトコル^16です。この手順は、実験者による最小限の監視を必要とし、複数のラットを同時にテストすることができます。さらに、この自動化されたタスク¹⁹の他のバージョンとは異なり、このパラダイムの適応は3日間のトレーニングを必要とし、効率的なプログラムされたデータ分析を含みます。

ストレスが認知機能を増強するか、または損なうかは、ストレータの種類、強度、および持続時間、ならびに認知タスク^20,21の学習または実行に関連するストレータのタイミングに依存する。したがって、プロトコルは、オペラントトレーニングの前後の両方のストレス手順を組み込んでいます。また、ストレス研究の代表的な結果を調べます。また、セットシフトの特定の側面の基礎となる脳領域は^{、2、16、22}を確立されています。したがって、この報告書はまた、ストレスおよび戦略シフト手順の間または後に特定の脳領域を標的にして評価する方法を説明する。

認知の柔軟性の性差を直接調べる研究は限られています^18,23. プロトコルは、1)実験的パラダイムに男性と女性の両方のラットを組み込む方法を説明し、その後2)自由にサイクリング女性の手順の前後にエストルースサイクルを追跡する。以前の研究では、オペラントトレーニング前のストレスは、ラット¹⁷の認知柔軟性における性特異的な欠陥につながる可能性があることを示している。特に、雌ラットはストレス後の認知の柔軟性に混乱を示し、一方、認知の柔軟性はストレス¹⁷後の雄ラットで改善する。興味深いことに、ヒトの性に偏った発生率を有するストレス関連精神疾患の主な特徴は、認知的柔軟性の不足である。これらの結果は、女性が男性よりもこのタイプの認知障害に対してより脆弱である可能性があることを示唆している。動物モデルにおけるこれらの技術の使用は、脳に対するストレスの影響と、それがヒトの精神疾患における認知を損なう方法に光を当てる。

プロトコル

この研究のすべての手順は、ブリン・マウア・カレッジの制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。実験動物を注文し、実験を開始する前に、IACUCまたはそれ以外の適用される規制の承認を得る。

1. 動物の準備

1. 男性と女性の大人のスプレイグ・ドーリーラットを取得します。
   注:ラットは65日前に出産することができますが、男性と女性の両方が完全に成熟していることを確認するために、この時点まで手順を開始しないでください。
2. ペアハウスの同性ラットはできるだけ長く、長期的な隔離がストスタク²⁴であるとして。食品制限のために、オペラ戦略シフトプロトコルの直前にネズミを歌う。
3. 1週間の順応の後、1日3~5分間ラットの取り扱いをやさしく始めます。各ラットの体重を収集します。さらに、性腺ホルモンが結果にどのような影響を与えるかを評価することに興味がある場合は、雌ラットの膣洗浄を収集する(セクション2に記載)。
4. 訓練開始の少なくとも3日前にパラダイムをシフトするオペラ戦略で実行される動物を(食べ物から)制限して、タスクを正常に学ぶようにします。水が常に自由に利用できることを確認してください。各動物の記録は、毎日の食物および流体の消費、水分補給の状態、およびプロトコルから動物を一時的または永久的に除去するための基準として使用される行動および臨床的変化を文書化するために維持されるべきである(Morton 2000;NRC 2003b)。
   1. トレーニング前に3日以上ストレス手順を採用する場合、ストレスの日数(例えば、5日間の拘束と食品制限²⁵⁾に一致するように食品制限を調整する。
   2. 毎日、通常の1日の食物摂取量の80%を送達する(すなわち、体重100g当たり4gの食物^)26。ラットの毎日の体重コレクションを使用して、毎日与える食べ物の量を計算します。
   3. トレーニングとテストの日を通して、食品の制限を続けます。しかし、ラットが一日のトレーニングやテストを完了するまで、家庭のケージに食べ物を入れないでください。これは、オペランチャンバーで実行するモチベーションの低下を避けるのに役立ちます(その後、単にホームケージで食べ物を待つことを支持するので)、タスクの完了時にラットへの食物配達のタイミングはかなり予測不可能であることを確認してください。
      注:拘束ストレスパラダイムを受けている動物は、コントロール、ストレスのない被験者よりも有意に大きな減量を示していません。しかし、様々なストレス手順自体が体重減少を誘発し、体重ベースの食品制限中にストレスを受けていないラットよりも少ない食物を受け取る。これは、追加の、交感ストリファを提示することができます。そうであるように思われる場合は、体重²⁷に関係なく、各被験者に与えられる一定量の食品を代わりに使用する。

2. 膣洗浄

注:性腺ホルモン(すなわち、エストロゲンとプロゲステロン)は、ストレス応答と認知^28、29、30に影響を与えることが知られている。これらのホルモンは雌ラット³¹のエストルスサイクルで変動する。ストレスや認知の柔軟性データと相関するように自由にサイクリング女性げっ歯類のエストルースサイクルを追跡することに興味がある場合は、以下に説明するように膣洗浄を収集します。エストルースサイクルステージを考慮した代表的なデータは提供されていない。

1. 女性から膣洗浄サンプルを取得するには、きれいなビーカー、ガラススポイト、"ラベジ"スライド(ラベラーサンプルを保持するアクリル塗料サークル付きの顕微鏡スライド)、および1つの空のビーカーに温水を収集します。
2. 少量のぬるま湯(0.5mL)でスポイトを満たし、その後、(その尾で持ち上げることによって)雌のラットの膣に先端を挿入します。滅菌水を2x-3xを排出し、採取した流体を顕微鏡スライドに排出します。ラヴィージスライドの円をオーバーフローしないでください。
3. 余分な液体を空のビーカーに排出します。ラベジスライドにラット番号のラベルを付け、各ラットのサンプルをその順序で入れて、どのサンプルが各ラットに属しているかを明確にします。
4. きれいなぬるま湯をピペット化し、それを「過剰」ビーカーに数回分配してから、次のラットをサンプリングするためにスポイトを充填する前に、スポイトを徹底的に洗い流します。
5. 慎重にラベジのスライドを明視野顕微鏡に運び、洗浄サンプルをイメージし、Beckerら³¹で説明したように、エストルースサイクル内で一日を分類する。
   注:理想的には、ラベラーは、女性のサイクルを適切に追跡するために数週間行われるべきであり、概日リズムを制御するために毎日非常に類似した時間に行われるべきです。好ましくは、この手順は、ストレスおよびオペラ戦略シフト手順の前に実行する必要があります。綿棒および生殖不能生理液の使用はまたこのスポイトの技術の代替として使用することができる。雌ラットのデータは、エコストリスサイクル日(ストレスが行われるサイクルの日やテストが発生した場合のサイクルの日を考慮)に従って、ポストホックで分析することができます。

3. 機器とソフトウェア

1. 行動訓練およびテストのためのオペラ室を使用してください。
   1. チャンバーには、上記の2つの刺激ライト、ハウスライト、およびこれらのタスクのための補強用ディスペンサーを備えた少なくとも2つの格納式レバーが含まれていることを確認してください。
   2. レバーが中央補強供給エリアの両側にあり、各レバーの上に1つの刺激光が付いていることを確認します。
   3. ハウスライトを使用して、光刺激の検出を妨げることなくチャンバーを照らします(ハウスライトがチャンバーの裏壁にあり、レバーや刺激ライトの反対側にある場合に最適です)。
2. 食品制限ラットの強化には、ダストレス食品ペレット(ここでは45mgペレットが使用されます:18.7%タンパク質、5.6%脂肪、4.7%繊維)を使用してください。ショ糖や脂肪の多いペレットを使用しないでください(ストレスが味わい可能な食物摂取に与える影響に関心がない限り)。
3. チャンバーを操作できるソフトウェアを使用して、コンピュータからの刺激、レバー操作、およびデータ収集の表示を制御する(材料表)。
   注:このソフトウェアを使用したプログラムのコーディングに関連する情報については、作者にお問い合わせください。MED-PC スクリプトは補助ファイルとして含まれています。このソフトウェアは、各試行に対する動物の反応(どのレバーが押されているか、それが正しい/間違っているか、応答がないか、および選択を行うための待ち時間)に関する情報を収集します。この情報から、ユーザーは行動分析セクションで説明されているように、行動パラダイムのさまざまなメジャーを計算できます。
4. ストレスホルモン³²⁽ およびその他の関連する措置)の概日リズムを制御するために、毎日同じ時間にトレーニング/テストを行います。
5. 各操作箱の底トレイに新鮮な寝具を入れ、便を回収します。各セッションに続いて、各トレイ、清潔なトレイ、チャンバーインテリアをアルコール拭きまたはIACUC承認消毒剤でダンプし、チャンバーに新しい動物を置く前に新鮮な寝具に交換してください。

4. ストレス手順

1. ストレス手順を、オペラ戦略シフトパラダイム(例えば、3日間のオペラ訓練前の5日間の拘束ストレスと3日間の手術訓練 の 前に、単一の拘束とテスト)に関する訓練の前、中、および/または訓練後に行うべきかどうかを決定します。
2. オペラ訓練に関して、毎日同時にストレス手順を実行します。(例えば、9 A.Mから始まる拘束応力の30分、続いてオペラ室への配置)。
3. コロニールームと戦略シフトパラダイムルームの両方から別の部屋でストレス手順を実行する(目撃者のストレスに関連する交感要因がないことを確認する)³³.簡単に言えば、ラットをブルームスタイルの透明な拘束チューブに入れ、手足や尾をつままないように注意して開口部を密封します。各被験者の間で、ブルームスタイルのチューブをきれいにするためにIACUC承認消毒剤を使用してください。不適切な消毒は、テストプロトコルに悪影響を及ぼす可能性のあるフェロモンを後ろに残すことができます。
   注:ラットの最初のグループがオペラ室で過ごす期間を見積もります。これはトレーニング と テストの日によって異なります。ただし、複数のコホートを実行した後、各タスクを完了して将来のタスクを見積もる平均時間を計算できます。
4. 利用可能な室の数に応じて、被験者のストレス手順をずらします。例えば、4匹のラットは拘束応力を受け、4つの手術室に入れられる。1時間後、さらに4匹の動物がオペラ座に続くストレス処置を受ける。

5. トレーニング

注:このパラダイムは、Florescoらによって開発されたオペラのセットシフト手順から変更され、3日間^{で完了することができます。} ラットのトレーニング手順は3日(以下に説明するように各タスクを学習するのに1日)を必要とします。ラットがこれらのタスクを学ばないことはまれです。ラットが各タスクを学習できない場合は、最終調査から除外する必要があります。以下に説明するトレーニングパラダイムの視覚的な描写については、 図1A を参照してください。

1. チャンバーにラットを入れる前に、ディスペンサーに十分な食品ペレットがあり、オペランボックスが適切に機能していることを確認してください。これを達成するために、空の部屋でトレーニングまたはテストデイプログラムをロードして開始し、正しいレバーがレバープレスごとに1つの報酬を適切に提供することを手動でテストします。
2. 各レバーを押すラットを訓練する
   1. トレーニングの最初の日のために箱にラットを置く前に、各部屋の中の訓練手順をロードする際に指定された正しいレバーに手動で1つの食糧ペレット報酬を設定する。
   2. 各正しいレバープレスが1つの補強で報われるような固定比率(FR-1)スケジュールを使用してラットを訓練します。チャンバーを操作するコンピュータにトレーニング手順をロードする際に正しいレバーを指定することで、被験者や実験条件(一度に1つのレバーのみ整形)で1日あたりの正しいレバーのバランスを取ります。
   3. 正しいレバーを50x押して基準に達するまでラットがレバーを押し、通常は30~45分の間に作業を完了します。
   4. 翌日、ラットはトレーニングの最初の日と同じプログラムを使用して反対側のレバーでこのタスクを実行するように強制しますが、反対側のレバーを正しいものとして指定します。トレーニングのこの日に食品ペレットでレバーを「形作る」必要はありません。通常、この基準は、ラットが最初のレバーを押すことを学んだ後にすぐに取得されます。
3. ライトキューに応答するラットのトレーニング
   1. 訓練の3日目に、ラットが潜在的に食品ペレット報酬を受け取るためにレバーの1つを押す可能性がある15の試験のために両方のレバーの上の光を照らします。軽い差別作業の間、このプログラムは試行によって正しいレバーをランダムに選択します。
   2. ラットが正しいレバーを押した場合は、ライトが3 sで点灯したままで、報酬が届けられ、その後に5s期間が経過し、次のトライアルの前にライトが消灯されることを確認します。ネズミが誤ったレバーを押した場合は、報酬が届かないことと、次のトライアルの前に10 sのライトが消灯していることを確認してください。
   3. トレーニングのこの最後の日に続いて、ラットがレバープレスの合計数で割って1つのレバーのプレスの数を割ることによって、左または右のレバーの好みを持っているかどうかを判断するために「サイドバイアス」を計算します。テスト日には、ラットは、好ましいレバーに応答するのではなく、特定の応答報酬の不測の事態を学習していることを確認するために、最も好ましくない側から始まります。

6. テスト

注: 下記のテストパラダイムを視覚的に表現するには 、図1B を参照してください。

1. 4日目(試験日)に、ストレス手順に従って手術室にラットを置き、横の差別、サイド逆転、および軽い差別タスクで連続的にテストします。光の識別タスクが「正しい」レバーの上のライトのみを照らしていることを確認します。各タスクでは、ラットは、報われない、誤ったレバーを押すことなく、各差別を完了するために連続して8つの正しい試験を達成する必要があります。間違ったレバープレスは、試験のこのチェーンをリセットします。
   1. 横の判別タスクを用いてラットを試験する。サイド差別プログラムを使用して、軽い手がかりに関係なく、トレーニングの3日目から決定された最も好ましくない側のレバーを押したラットに報酬を与えます。タスクは、正しいレバーを8x連続して押すと終了します(省略を除く)。
   2. サイド差別プログラムを使ってラットを再度走らせたりしてサイド反転試験を行うが、今度は側の判別タスクから正しいものと反対のレバーを正しいものとして指定する。ライトキューに関係なく、このレバーを押すことで、ラットが報われるようにします。タスクは、正しいレバーを8x連続して押すと終了します(省略を除く)。
   3. 上に照らされた光でレバーを押したネズミに報いる光判別作業を行います。各操作性試験は、正しいレバーを8倍連続で押すと完了します(省略を除く)。
      注:以前の研究に基づいて、これらのタスクは、ラットが各タスク¹⁸のルールを学ぶのに十分な時間を持っていることを確認するために、連続したプレスに関係なく、最低30の試験をエンコードします。したがって、ラットが30回の試験が行われる前に8回の正しい試験を連続して達成した場合、タスクは30回の試験が完了するまで従事し続けます。

7. 行動分析

注: テスト日に動物ごとに取得したデータは、各タスクの MED-PC スクリプトが開始され、完了できる限り、コンピュータによって自動的に記録および保存されます (MED-PC スクリプトの補足資料を参照)。

1. コンピュータプログラムを使用して、テスト日のタスク(サイド差別、サイド反転、光差別)のデータを開きます。プログラムによって記録された主なメジャーは、基準、基準の誤差、および基準までの時間に対する試行です。これらの措置について、以下で詳しく説明します。
   注: 著者たちは、分析プロセスの自動化と、忍耐的なエラーと回帰的なエラーの分析を可能にするMATLABスクリプトを生成しました(データ分析を合理化するためのコード情報の著者に連絡してください)。
   1. 試験を使用して、正確さの主な指標として、ラットが8つの正しい試験を連続して完了するために必要な試験の総数(省略を含まない)を基準にします。このデータは、配列 B の最初の列に、テスト日のタスクの MED-PC スクリプトによって生成されたデータ ファイルにあります。
   2. 各タスクの間に発生したエラーの合計を調べます。このデータは、テスト日のタスクの MED-PC スクリプトによって生成されたデータ ファイル内の配列 B の 3 番目の列にあります。これらのエラーは、忍耐的または回帰的なエラーにも分類されます。前のタスクの前のルールに従って、ラットが続行すると、エラーがコミットされます。回帰エラーは、前のルールから外れた後にコミットされますが、新しいルールの取得を続行します(これらのタイプのエラーの計算方法の詳細については、公開された方法¹⁸を参照してください)。
   3. ラットが15以内の軽い手がかりに反応しなかった場合、試験は省略として分類され、基準に試験の総数にカウントされません。これを計算するために、まず、正しい応答の数 (データ ファイルの配列 B の配列 B の 2 番目の列にあります) とエラーの数 (データ ファイルの配列 B の 3 列目に配置されます) を加算します。次に、この数値を試験の総数から基準に引きます (これは、データファイル内の配列 B の最初の列の最後の数値で、試行から基準に対する数値とは異なります)。
   4. プログラムによって記録された開始時刻と終了時刻 (テスト日のタスクの MED-PC スクリプトによって生成されたデータ ファイルの先頭にあります) を使用して、基準までの時間を計算します。最初のレバープレスに対する待ち時間は、基準までの時間から変数K(最初のレバープレスからの秒数)を差し引くことによってデータファイルから計算することもできます。
   5. 同じ治療群内のラットの行動測定ごとにデータを平均する。適切な統計分析を実行します(検査対象の変数の数に応じて異なります)。

8. 脳の基質

1. 関心のある脳領域および/または認知の柔軟性の側面を決定します。.例えば、側逆転タスクにおける応力が忍耐誤差を増加させる場合、眼窩前頭皮質(OFC)は、この脳領域が多くの形態の逆転学習(すなわち、側逆転タスクでテストされた空間反転)34、35、36において役割を果たすことを示しているように、特に興味深い。この例では、戦略シフトパラダイムが完了した後にラットを犠牲にし、ここで説明した免疫物質化学的方法²⁵を用いてOFCにおけるc-fos(神経活性化尺度³⁷⁾を調べる。
   1. まず、動物から脳を抽出し、40μmのスライスに切ります。
   2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)4xで組織を5分間洗浄し、0.3%過酸化水素で10分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼをクエンチします。
   3. PBS2xで組織をそれぞれ5分間洗浄し、マウス抗c-fos一次抗体(1:500)、3%正常ロバ血清(NDS)、および0.3%トリトンXを一晩インキュベートする。
   4. 翌日、PBS 3xで組織をそれぞれ5分間洗浄し、次にビオチンSP-コンジュゲートロバ抗マウスサリー抗体(1:500)で2時間インキュベートする。
   5. PBS3xで組織をそれぞれ5分間洗浄し、アビジン・ストレプトアビジンAB複合体中で1時間インキュベートする。
   6. PBS 3xで組織をそれぞれ5分間洗浄し、その後、組織が酸化発色反応を起ぜて最大10分間DAB溶液中でインキュベートする。
   7. PBS 3xで組織をそれぞれ5分間洗浄し、次に、ガラス顕微鏡スライドに脳スライスを取り付けます。
   8. 明視野顕微鏡を用いてトルエン系装着媒体と画像を用いて組織を覆い落とす。
      注:ここでは、代表的な結果に反映されるように、ラットは戦略シフトパラダイムが終了した後30分、逆転タスクが完了した後に約60〜90分(軽いタスクにおける各ラットの性能に応じて)犠牲になります。これは、逆転タスクにおける性能を反映したc-fos式³⁸の最適タイミングを表す必要がある。
2. あるいは、ストレスの実行前に薬物注射またはウイルス注射のための特定の脳領域をカニューテレートするか、またはパラダイムを移すオペラ戦略。
   注:研究者は、神経基質を操作すると、認知の柔軟性に対するストレスの影響がどのように変化するかを調べたいと思うかもしれません。例えば, 研究者は、テストの前頭前野の特定の神経伝達物質受容体をブロックすることができます。.

結果

上記で概説した適応された自動化されたオペラ戦略シフトパラダイムは、繰り返し拘束ストレスが男性および女性のスプレイグ・ドーリーラットの認知に影響を与えるかどうかを判断するために使用された。代表的な行動データは、以下の 図2 に記載されています。要するに、制御と繰り返し抑制されたラットは、一連のタスクで構成されたこのオペラ戦略シフトテス?...

ディスカッション

プロトコルは、認知機能に対するストレスの影響を測定する方法を示しています。具体的には、修正されたオペラ戦略シフトパラダイムは、認知の柔軟性(人間のウィスコンシンカードソーティングタスクに似ています)を測定するげっ歯類で使用されます¹.認知の柔軟性は、環境の新しい条件に直面する認知処理戦略を適応させる能力を示し、それは正常な毎日の機能

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
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Alcohol Wipes	VWR	15648-990	To clean trays in set shifting boxes between rats
Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse lgG (H+L), minimal cross reaction to bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster, horse, human, rabbit, sheep serum proteins	Jackson ImmunoResearch	715-065-150	All other DAB protocol staining materials are standard buffers/DAB and are not specified here, as this is not the main focus of the methods paper
C-fos mouse monoclonal primary antibody	AbCam	ab208942	To stain neural activation in brain areas after set shifting
Dustless Food Pellets	Bio Serv	F0021	For set shifting boxes (dispenser for reward)
GraphPad Prism			Used for data analysis
Leica DM4 B Microscope and associated imaging software	Leica		Lots of different parts for the microscope and work station, for imaging lavage and/or cfos
MatLab			Software; code to help analyze set shifting data, available upon request.
Med-PC Software Suite	Med Associates	SOF-736	Software; uses codes to operate operant chambers
Operant Chambers	Med PC	MED-008-B2	Many different parts for the chamber set up and software to work with it; we also wrote a separate code for set shifting, available upon request.
Rat Bedding	Envigo	T.7097
Rat Chow	Envigo	T.2014.15
Restraint Devices	Bryn Mawr College	Made by our shop	For stress exposure; specifications available upon request.
Scribbles 3d fabric paint	Amazon	54139	For vaginal lavage
Sprague Dawley Rats	Envigo		At least D65 Males and Females
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR	48311-703	For vaginal lavage and/or brain slices/staining for c-fos