JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Стрессовые жизненные события ухудшают когнитивные функции, увеличивая риск психических расстройств. Этот протокол иллюстрирует, как стресс влияет на когнитивную гибкость, используя автоматизированную оперантную стратегию смены парадигмы у самцов и самок крыс Sprague Dawley. Обсуждаются конкретные области мозга, лежащие в основе определенного поведения, и исследуется трансляционная релевантность результатов.

Аннотация

Стресс влияет на когнитивные функции. Усиливает ли стресс или ухудшает когнитивные функции, зависит от нескольких факторов, включая 1) тип, интенсивность и продолжительность стрессора; 2) тип изучаемой когнитивной функции; и 3) сроки стрессора в отношении обучения или выполнения познавательной задачи. Кроме того, половые различия между эффектами стресса на когнитивные функции были широко задокументированы. Здесь описана адаптация автоматизированной парадигмы смены оперантной стратегии для оценки того, как изменения в стрессе влияют на когнитивную гибкость у самцов и самок крыс Sprague Dawley. В частности, сдерживающее напряжение используется до или после тренировки в этой оперантной задаче, чтобы изучить, как стресс влияет на когнитивные функции у обоих полов. Конкретные области мозга, связанные с каждой задачей в этой автоматизированной парадигме, были хорошо установлены (то есть медиаальная префронтальная кора и орбитофронтальная кора). Это позволяет проводить целенаправленные манипуляции во время эксперимента или оценку конкретных генов и белков в этих областях после завершения парадигмы. Эта парадигма также позволяет обнаруживать различные типы ошибок производительности, которые возникают после стресса, каждый из которых имеет определенные нейронные субстраты. Также выявлены явные половые различия в персеверативных ошибках после повторяющейся парадигмы сдерживающего стресса. Использование этих методов в доклинической модели может показать, как стресс влияет на мозг и ухудшает познание при психических расстройствах, таких как посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) и большое депрессивное расстройство (MDD), которые демонстрируют заметные половые различия в распространенности.

Введение

У людей стрессовые жизненные события могут ухудшить когнитивную функцию (т.е. когнитивную гибкость1),что означает способность адаптировать когнитивные стратегии обработки к новым условиям в окружающей среде2. Нарушение когнитивных функций ускоряет и усугубляет многие психические расстройства, такие как посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) и большое депрессивное расстройство (МДД)3,4. Эти расстройства в два раза распространенным явлением у женщин5,6,7,8,однако биологическая основа этого несоответствия остается неизвестной. Аспекты исполнительного функционирования у людей могут быть оценены с помощью Wisconsin Card Sorting Task, демонстрации когнитивной гибкости2. Производительность в этой задаче нарушена у пациентов сПТСР 9 и MDD10,но нейронная основа этого изменения может быть исследована только с помощью визуализации мозга11.

Успехи в понимании того, как стресс влияет на мозг, были достигнуты благодаря использованию животных моделей, особенно грызунов. Поскольку когнитивная гибкость затрагивается при заболеваниях, связанных со стрессом, это исключительно релевантный фенотип для изучения у грызунов. На сегодняшний день в большинстве литератур по нейробиологии стресса используется альтернативная парадигма когнитивной гибкости (иногда называемая задачей копания)12,13,14,15. Хотя эта задача была тщательно проверена, экспериментатор требует больше времени и усилий для обучения грызунов. Здесь адаптирован и описан хорошо задан автоматизированный протокол сдвига наборов16 для оценки когнитивной гибкости у самцов и самок крыс Sprague Dawley с использованием различных стрессовых моделей17,18. Процедура требует минимального надзора со стороны экспериментатора и позволяет одновременно тестировать несколько крыс. Кроме того, в отличие от других версий этой автоматизированной задачи19,адаптация этой парадигмы требует всего 3 дней обучения и включает в себя эффективный запрограммированный анализ данных.

Усиливает ли стресс или ухудшает когнитивную функцию, зависит от типа, интенсивности и продолжительности стрессора, а также от времени действия стрессора в отношении обучения или выполнения когнитивной задачи20,21. Таким образом, протокол включает в себя стрессовые процедуры как до, так и после оперантной тренировки. В нем также рассматриваются репрезентативные результаты стрессовых исследований. Кроме того, области мозга, лежащие в основе конкретных аспектов смещениямножеств,были хорошо установлены2,16,22; таким образом, в докладе также описывается, как нацеливаться и оценивать конкретные области мозга во время или после процедур изменения стресса и стратегии.

Были проведены ограниченные исследования по непосредственному изучению половых различий в когнитивной гибкости18,23.  Протокол описывает, как 1) включить как самцов, так и самок крыс в экспериментальную парадигму, а затем 2) отслеживать эструсные циклы до и во время процедур у свободно циклических самок. Предыдущие исследования показали, что стресс перед оперантной тренировкой может привести к специфическому для пола дефициту когнитивной гибкости у крыс17. В частности, самки крыс демонстрируют нарушения когнитивной гибкости после стресса, тогда как когнитивная гибкость улучшается у самцов крыс после стресса17. Интересно, что основным признаком психических расстройств, связанных со стрессом, которые имеют склонность к сексу у людей, является когнитивная негибкость. Эти результаты свидетельствуют о том, что женщины могут быть более уязвимы к этому типу когнитивных нарушений, чем мужчины. Использование этих методов на животных моделях проложит свет на влияние стресса на мозг и на то, как он ухудшает познание при психических расстройствах у людей.

протокол

Все процедуры в этом исследовании были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в колледже Брин Мор. Получите одобрение IACUC или других применимых регулирующих органов, прежде чем заказывать лабораторных животных и начинать эксперименты.

1. Подготовка животных

  1. Приобретите самцов и самок взрослых крыс Sprague Dawley.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы могут быть доставлены до 65-дневного возраста, но не начинайте процедуры до этого момента, чтобы убедиться, что как самцы, так и самки полностью зрелы.
  2. Парные однополые крысы как можно дольше, так как длительная изоляция является стрессором24. Для ограничения пищи, поощродно домовых крыс непосредственно перед протоколом оперантного изменения стратегии.
  3. После 1 недели акклиматизации осторожно начинают обрабатывать крыс по 3–5 мин в день. Соберите массу тела каждой крысы. Кроме того, если вы заинтересованы в оценке того, как гонадные гормоны могут повлиять на результаты, соберите вагинальный лаваж для самок крыс (описано в разделе 2).
  4. Ограничьте (от еды) животных, которые будут бегать в парадигме смены оперантной стратегии, по крайней мере, за 3 дня до начала дрессировки, чтобы они успешно освоили задачу. Убедитесь, что вода всегда находится в свободном доступе. Письменные записи должны вестись для каждого животного, чтобы документировать ежедневное потребление пищи и жидкости, состояние гидратации и любые поведенческие и клинические изменения, используемые в качестве критериев для временного или постоянного исключения животного из протокола (Morton 2000; NRC 2003b).
    1. Если вы используете стрессовую процедуру более чем за 3 дня до тренировки, скорректируйте ограничение в еде в соответствии с количеством дней стресса (например, 5 дней ограничения плюс ограничение в еде25).
    2. Ежедневно доставляют 80% от нормальной суточной нормы потребления пищи (т.е. 4 г пищи на 100 г массы тела)26. Используйте ежедневный сбор веса для крысы, чтобы рассчитать, сколько пищи давать каждый день.
    3. Продолжайте ограничение в еде в течение дней обучения и тестирования. Тем не менее, не размещайте пищу в домашней клетке до тех пор, пока крыса не завершит обучение или тестирование в течение дня, иначе они не будут мотивированы на выполнение задач за вознаграждение за пищевые гранулы. Убедитесь, что сроки доставки пищи крысам по завершении задания довольно непредсказуемы, так как это помогает избежать снижения мотивации к выступлению в оперантной камере (в пользу простого ожидания еды в домашней клетке впоследствии).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, подвергающиеся парадигме сдерживающего стресса, не демонстрируют значительно большей потери веса, чем контрольные, ненапряженные субъекты. Тем не менее, различные стрессовые процедуры могут сами по себе вызывать потерю веса, в результате чего крысы получают меньше пищи, чем ненапряженные коллеги во время ограничения пищи на основе массы тела. Это может представлять собой дополнительный, мешающий стрессор. Если это так, альтернативно используйте фиксированное количество пищи, даваемой каждому субъекту, независимо от веса27.

2. Промывание влагалища

ПРИМЕЧАНИЕ: Известно, что гормоны гонад (т.е. эстроген и прогестерон) влияют на реакцию на стресс и познание28,29,30. Эти гормоны колеблются в течение эстрального цикла самок крыс31. Если вы заинтересованы в отслеживании эстрального цикла свободно езда на велосипеде самок грызунов, чтобы коррелировать со стрессом или данными о когнитивной гибкости, соберите влагалищное лаваж, как описано ниже. Репрезентативные данные, учитывающие стадию эструацикла, не представлены.

  1. Чтобы получить образцы влагалищного лаважа от самок, соберите теплую воду в чистый стакан, стеклянную пипетку, слайд «лаваж» (слайд микроскопа с кружками акриловой краски для удержания образца лаважа) и один пустой стакан.
  2. Наполните пипетку небольшим количеством теплой воды (~0,5 мл), затем вставьте кончик во влагалище самки крысы (подняв ее хвостом). Вытолкните стерильную воду в 2–3 раза и выталкивая собранную жидкость на микроскопический слайд. Не переполняйте круг скольжения лаважа.
  3. Выталкивайте лишнюю жидкость в пустой замок. Пометьте слайд лаважа номерами крыс и поместите образцы от каждой крысы в этом порядке, чтобы было ясно, какой образец принадлежит каждой крысе.
  4. Тщательно промойте пипетку, пипеткой чистой теплой воды и раздав ее в «лишний» клюш несколько раз, прежде чем заполнить пипетку, чтобы попробовать следующую крысу.
  5. Осторожно перенесут слайд лаважа в микроскоп с ярким полем, чтобы получить изображение образца лаважа и классифицировать день в рамках эстрозного цикла, как описано в Becker et al31.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, промывание должно проводиться в течение нескольких недель, чтобы правильно отслеживать женский цикл, и должно выполняться в очень похожее время каждый день, чтобы контролировать циркадные ритмы. Предпочтительно, чтобы эта процедура была выполнена до процедур изменения стрессовой и оперантной стратегии. Использование ватных тампонов и стерильного физиологического раствора также может быть использовано в качестве альтернативы этой технике пипетки для глаз. Данные для самок крыс могут быть проанализированы пост-hoc в соответствии с эструсным днем цикла (учитывайте дни цикла, когда выполняется стресс, и / или день цикла, когда происходит тестирование).

3. Оборудование и программное обеспечение

  1. Используйте оперантные камеры для поведенческой тренировки и тестирования.
    1. Убедитесь, что камеры содержат по крайней мере два выдвижных рычага с двумя стимулирующими огнями выше, домашний свет и диспенсер для усиления для этих задач.
    2. Убедитесь, что рычаги находятся по обе стороны от центральной области доставки арматуры с одним стимулирующим светом над каждым рычагом.
    3. Используйте свет дома, чтобы осветить камеру, не мешая обнаружению светового стимула (лучше всего, если свет дома находится на задней стенке камеры, напротив рычагов и стимулирующих огней).
  2. Используйте беспылевые пищевые гранулы (здесь используются гранулы 45 мг: 18,7% белка, 5,6% жира и 4,7% клетчатки) для подкрепления у крыс с ограниченным содержанием пищи. Не используйте гранулы с высоким содержанием сахарозы или жира (если нет интереса к тому, как стресс влияет на потребление вкусной пищи).
  3. Управление представлением стимулов, работой рычага и сбором данных с компьютера с помощью программного обеспечения, способного управлять камерой(Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения информации, связанной с кодированием программ с использованием этого программного обеспечения, свяжитесь с авторами. Скрипты MED-PC включены в качестве дополнительных файлов. Это программное обеспечение собирает информацию об ответах животного для каждого испытания (какой рычаг нажат, является ли он правильным / неправильным / нет ответа, и задержка для выбора). Исходя из этой информации, пользователи могут рассчитать различные меры в поведенческой парадигме, как описано в разделе поведенческого анализа.
  4. Выполняйте тренировки / тестирование в одно и то же время каждый день, чтобы контролировать циркадные ритмы в гормонах стресса32 (и другие соответствующие меры).
  5. Заполните нижний лоток каждой оперантной коробки свежей подстилкой для сбора фекалий/отходов. После каждого сеанса сбрасывайте каждый лоток, чистые лотки и внутреннюю часть камеры спиртовыми салфетками или дезинфицирующим средством, одобренным IACUC, и заменяйте их свежим постельным бельем перед помещением нового животного в камеру.

4. Стрессовые процедуры

  1. Решите, следует ли выполнять процедуру стресса до, во время и/или после тренировки парадигмы смены оперантной стратегии (например, 5 дней удерживающего стресса до 3 дней оперантной тренировки против 3 дней оперантной тренировки с последующим одним ограничением и тестированием).
  2. Выполняйте стрессовую процедуру в одно и то же время ежедневно в отношении оперантного обучения. (например, 30 мин удерживающего напряжения, начиная с 9 А.M., с последующим помещением в оперантную камеру).
  3. Выполняйте стрессовые процедуры в отдельной комнате как от колониальной комнаты, так и от комнаты смены парадигмы стратегии (чтобы убедиться, что нет смешанных факторов, связанных со стрессом свидетеля)33. Вкратце, поместите крысу в прозрачную удерживающую трубку в стиле Брума и запечатайте отверстие, заботясь о том, чтобы не защемить конечности или хвост. Между каждым субъектом используйте дезинфицирующее средство, одобренное IACUC, для очистки трубки в стиле Брума. Неправильная санитарная проверка может оставить феромоны, которые могут негативно повлиять на протокол тестирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените, сколько времени первая группа крыс проведет в оперантных камерах. Это будет варьироваться в зависимости от тренировочного и тестового дня; однако после выполнения нескольких когорт можно рассчитать среднее время выполнения каждой задачи для оценки будущих задач.
  4. В зависимости от того, сколько оперантных камер доступно, пошатнули процедуру стресса для испытуемых. Например, четыре крысы подвергаются сдерживающим нагрузкам и помещаются в четыре оперантные камеры. Через час еще четыре животных проходят стрессовые процедуры, за которыми следует оперантная камера.

5. Обучение

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта парадигма модифицирована из процедуры оперантного сдвига множеств, разработанной Floresco et al., так что она может быть завершена за 3 дня19.  Процедуры дрессировки для крыс требуют 3 дня (1 день, чтобы изучить каждую задачу, как описано ниже). Редко, когда крыса не учится этим задачам. Если крыса не может выучить каждое задание, ее следует исключить из итогового исследования. На рисунке 1A показано визуальное описание парадигмы обучения, описанной ниже.

  1. Прежде чем поместить крысу в камеру, убедитесь, что в дозаторе достаточно пищевых гранул и что оперантные коробки функционируют должным образом. Чтобы достичь этого, нагрузите и начните программу обучения или тестового дня в пустой камере, вручную проверяя, что правильный рычаг надлежащим образом обеспечивает одно вознаграждение за нажатие рычага.
  2. Обучение крысы нажатию на каждый рычаг
    1. Перед тем, как поместить крысу в коробку на первый день обучения, вручную установите одну награду за пищевые гранулы на правильный рычаг, как указано при загрузке процедуры обучения в каждой камере.
    2. Тренируйте крысу, используя график с фиксированным соотношением (FR-1), так что каждое правильное нажатие рычага вознаграждается одним усилением. Уравновешивайте правильный рычаг в день по испытуемым и/или экспериментальным условиям (формируя только один рычаг за раз), назначая правильный рычаг при загрузке процедуры обучения на компьютер, работающий с камерами.
    3. Позвольте крысе нажимать на рычаг до тех пор, пока она не достигнет критерия, нажав правильный рычаг 50x, обычно выполняя задачу между 30-45 минутами.
    4. На следующий день заставьте крысу выполнить это задание на противоположном рычаге, используя ту же программу, что и в первый день обучения, но обозначьте противоположный рычаг как правильный. В этот день тренировки нет необходимости «формировать» рычаг пищевой гранулой. Как правило, этот критерий быстро приобретается после того, как крысы научились нажимать на первый рычаг.
  3. Обучение крысы реагировать на световой сигнал
    1. На третий день обучения зажгите свет над обоими рычагами в течение 15 с испытаний, во время которых крыса может нажать на один из рычагов, чтобы потенциально получить награду за пищевые гранулы. Во время задачи легкой дискриминации эта программа будет случайным образом выбирать, какой рычаг является правильным на экспериментальной основе.
    2. Если крыса нажимает на правильный рычаг, убедитесь, что огни остаются включенными в течение 3 с и награда доставлена, а затем период 5 с, в течение которого свет выключается перед следующим испытанием. Если крыса нажимает на неправильный рычаг, убедитесь, что награда не доставлена и что свет выключен на 10 с до следующего испытания.
    3. После этого последнего дня тренировки рассчитайте «боковое смещение», чтобы определить, отдает ли крыса предпочтение левому или правому рычагу, разделив количество нажатий одного рычага, деленное на общее количество нажатий рычага. В день теста крыса начнет с наименее предпочтительной стороны, чтобы убедиться, что она изучает конкретную непредвиденную реакцию и вознаграждение, а не реагирует на предпочтительный рычаг.

6. Тестирование

ПРИМЕЧАНИЕ: См. рисунок 1B для визуального изображения парадигмы тестирования, описанной ниже.

  1. На 4-й день (тестовый день) поместите крысу в оперантную камеру после стрессовых процедур и протестируйте их в задачах боковой дискриминации, бокового разворота и легкой дискриминации последовательно. Убедитесь, что задача различания света освещает только свет над «правильным» рычагом. В каждой задаче крысы должны последовательно достичь восьми правильных испытаний, чтобы завершить каждую дискриминацию, не нажимая на невознаградивый, неправильный рычаг. Неправильное нажатие рычага сбросит эту цепочку испытаний.
    1. Тестируйте крыс, используя задачу боковой дискриминации. Используя программу боковой дискриминации, вознаграждайте крысу за нажатие рычага на наименее предпочтительную сторону, как определено с третьего дня обучения, независимо от светового сигнала. Задача заканчивается при нажатии на правильный рычаг 8x последовательно (исключая пропуски).
    2. Выполните тест бокового разворота, снова запустив крыс с помощью программы боковой дискриминации, но на этот раз обозначив рычаг, противоположный правильному с боковой задачи дискриминации, как правильный. Убедитесь, что крыса вознаграждена за нажатие на этот рычаг, независимо от светового сигнала. Задача заканчивается при нажатии на правильный рычаг 8x последовательно (исключая пропуски).
    3. Выполните задание на различательность света, которое вознаграждает крысу за нажатие на рычаг с помощью света, освещенного выше. Каждое тестирование оперантов завершается при последовательном нажатии правильного рычага 8x (исключая пропуски).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на предыдущих исследованиях, эти задания кодируют как минимум 30 испытаний, независимо от последовательных нажатий, чтобы гарантировать, что крысы имеют достаточно времени для изучения правил каждого задания18. Таким образом, если крыса последовательно достигает восьми правильных испытаний до того, как произойдет 30 испытаний, задача будет оставаться занятой до тех пор, пока не будет завершено 30 испытаний.

7. Поведенческий анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, полученные для каждого животного в день тестирования, автоматически записываются и сохраняются компьютером, при том, что сценарий MED-PC для каждой задачи был инициирован и разрешен к завершению (см. дополнительные материалы для сценариев MED-PC).

  1. Откройте данные для каждого задания тестового дня (боковая дискриминация, боковое изменение и легкая дискриминация) с помощью компьютерной программы. Основными показателями, регистрируемыми программой, являются пробы к критерию, ошибки в критерии и время до критерия. Эти меры подробно описываются ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы создали скрипт MATLAB, который позволяет автоматизировать процесс анализа, а также анализ персеверативных и регрессивных ошибок (свяжитесь с авторами для получения информации о коде для оптимизации анализа данных).
    1. Используйте критерий испытаний (который относится к общему количеству испытаний [не включая упущения], необходимых для того, чтобы крыса последовательно завершила восемь правильных испытаний, включая эти восемь испытаний) в качестве основного показателя точности. Эти данные находятся в первом столбце массива B в файле данных, сгенерированном скриптом MED-PC для любой из задач в день тестирования.
    2. Изучите общее количество ошибок, допущенных во время выполнения каждой задачи. Эти данные находятся в третьем столбце массива B в файле данных, сгенерированном скриптом MED-PC для любой из задач в день тестирования. Эти ошибки также подразделяются на персевертивные или регрессивные ошибки. Персеверативные ошибки совершаются, когда крыса продолжает следовать более раннему правилу из предыдущей задачи. Регрессивные ошибки совершаются после того, как он отключился от предыдущего правила, но продолжает пытаться получить новое правило (подробнее о том, как вычисляются эти типы ошибок, см. опубликованный метод18).
    3. Если крыса не ответила на световой сигнал в течение 15 с, испытание классифицируется как упущение, и оно не будет учитываться в общем количестве испытаний по критерию. Рассчитайте это, сначала сложив количество правильных ответов (расположенных во втором столбце массива B в файле данных) и количество ошибок (расположенных в третьем столбце массива B в файле данных). Далее вычтите это число из общего числа испытаний по критерию (это последнее число в первом столбце массива B в файле данных, отличное от испытаний к критерию).
    4. Используйте время начала и окончания, записанные программой (расположенные в верхней части файла данных, сгенерированного скриптом MED-PC для любой из задач в день тестирования), чтобы рассчитать время до критерия. Задержка до первого нажатия рычага также может быть рассчитана из файла данных путем вычитания переменной K (время, прошедшее в секундах с первого нажатия рычага) из времени до критерия.
    5. Усредненные данные для каждой поведенческой меры для крыс в пределах одной группы лечения. Провести соответствующий статистический анализ (в зависимости от того, сколько переменных исследуется).

8. Субстраты мозга

  1. Определите интересующий его область мозга и/или аспект когнитивной гибкости. Например, если стресс увеличивает персевертивные ошибки в задаче бокового разворота, орбитофронтальная кора (OFC) может представлять особый интерес, поскольку предыдущие исследования поражений показали, что эта область мозга играет роль во многих формах реверсивного обучения (т. Е. Пространственный разворот, протестированный в задаче бокового разворота)34,35,36. В этом примере жертвоприношения крыс после завершения парадигмы смены стратегии и изучения c-fos (мера нейронной активации37)в ОФК с использованием описанных иммуногистохимических методов25 и кратко описанных здесь.
    1. Во-первых, извлеките мозг из животных и нарежьте на 40 мкм ломтики.
    2. Промыть ткань фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) 4x в течение 5 мин каждый, затем инкубировать в 0,3% перекиси водорода в течение 10 мин для гашения эндогенных пероксидаз.
    3. Промыть ткань в PBS 2x в течение 5 мин каждая, затем инкубировать в мышином анти-c-fos первичном антителе (1:500), 3% нормальной ослиной сыворотке (NDS) и 0,3% Triton X на ночь.
    4. На следующий день промыть ткань в PBS 3x в течение 5 мин каждая, затем инкубировать в биотин-SP-конъюгированных антимышьих антителах против мыши (1:500) в течение 2 ч.
    5. Промыть ткань в PBS 3x в течение 5 мин каждая, затем инкубировать в комплексе авидин-стрептавидин AB в течение 1 ч.
    6. Промывайте ткань в PBS 3x в течение 5 мин каждая, затем инкубируют в растворе DAB до 10 мин, так как ткань подвергается окислительной хромогенной реакции.
    7. Промыть ткань в PBS 3x в течение 5 минут каждая, затем установить срезы мозга на стеклянные слайды микроскопа.
    8. Обложивайте ткань с помощью монтажной среды на основе толуола и изображения с помощью микроскопа brightfield.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, как отражено в репрезентативных результатах, крыс приносят в жертву через 30 минут после окончания парадигмы смены стратегии, примерно через 60–90 минут после завершения задачи разворота (в зависимости от производительности каждой крысы в световой задаче). Это должно представлять собой оптимальное время для выражения c-fos38,отражающее производительность в задаче разворота.
  2. В качестве альтернативы, можно свести определенную область мозга для инъекции наркотиков или вирусной инъекции до выполнения стресса или смены парадигмы оперантной стратегии.
    Исследователи могут захотеть изучить, как манипулирование нейронными субстратами изменяет влияние стресса на когнитивную гибкость. Например, исследователи могут блокировать определенный рецептор нейротрансмиттера в префронтальной коре до тестирования.

Результаты

Адаптированная автоматизированная парадигма смены оперантной стратегии, изложенная выше, была использована для определения того, влияет ли повторяющийся стресс сдерживания на познание у самцов и самок крыс Sprague Dawley. Репрезентативные поведенческие данные описаны на рисунк...

Обсуждение

Протокол демонстрирует, как измерить влияние стресса на когнитивные функции. В частности, модифицированная парадигма изменения оперантной стратегии используется у грызунов, которая измеряет когнитивную гибкость (аналогичную задаче сортировки карт Висконсина у людей)1. К...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Ханну Замор, Эмили Сакс и Джоша Сирла за их помощь в установлении этой парадигмы изменения оперантной стратегии в лаборатории Графа. Они также хотели бы поблагодарить Кевина Снайдера за его помощь с кодом MATLAB для анализа.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3 inch glass pipette eye droppersAmazon4306-30-012LCFor vaginal lavage
Alcohol WipesVWR15648-990To clean trays in set shifting boxes between rats
Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse lgG (H+L), minimal cross reaction to bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster, horse, human, rabbit, sheep serum proteinsJackson ImmunoResearch715-065-150All other DAB protocol staining materials are standard buffers/DAB and are not specified here, as this is not the main focus of the methods paper
C-fos mouse monoclonal primary antibodyAbCamab208942To stain neural activation in brain areas after set shifting
Dustless Food PelletsBio ServF0021For set shifting boxes (dispenser for reward)
GraphPad PrismUsed for data analysis
Leica DM4 B Microscope and associated imaging softwareLeicaLots of different parts for the microscope and work station, for imaging lavage and/or cfos
MatLabSoftware; code to help analyze set shifting data, available upon request.
Med-PC Software SuiteMed AssociatesSOF-736Software; uses codes to operate operant chambers
Operant ChambersMed PCMED-008-B2Many different parts for the chamber set up and software to work with it; we also wrote a separate code for set shifting, available upon request.
Rat BeddingEnvigoT.7097
Rat ChowEnvigoT.2014.15
Restraint DevicesBryn Mawr CollegeMade by our shopFor stress exposure; specifications available upon request.
Scribbles 3d fabric paintAmazon54139For vaginal lavage
Sprague Dawley RatsEnvigoAt least D65 Males and Females
VWR Superfrost Plus Micro SlideVWR48311-703For vaginal lavage and/or brain slices/staining for c-fos

Ссылки

  1. Hurtubise, J. L., Howland, J. G. Effects of stress on behavioral flexibility in rodents. Neuroscience. 345, 176-192 (2016).
  2. Bissonette, G. B., Powell, E. M., Roesch, M. R. Neural structures underlying set-shifting: Roles of medial prefrontal cortex and anterior cingulate cortex. Behavioural Brain Research. 250, 91-101 (2013).
  3. Vasterling, J. J., Brailey, K., Constans, J. I., Sutker, P. B. Attention and memory dysfunction in posttraumatic stress disorder. Neuropsychology. 12 (1), 125-133 (1998).
  4. Bangasser, D. A., Kawasumi, Y. Cognitive disruptions in stress-related psychiatric disorders: A role for corticotropin releasing factor (CRF). Hormones and Behavior. 76, 125-135 (2015).
  5. Nestler, E. J., et al. Neurobiology of depression. Neuron. 34 (1), 13-25 (2002).
  6. Keane, T. M., Marshall, A. D., Taft, C. T. Posttraumatic stress disorder: etiology, epidemiology, and treatment outcome. Annual Review of Clinical Psychology. 2, 161 (2006).
  7. Seeman, M. V. Psychopathology in women and men: focus on female hormones. The American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1641-1647 (1997).
  8. Hodes, G. E., Epperson, C. N. Sex Differences in Vulnerability and Resilience to Stress Across the Life Span. Biological Psychiatry. 86 (6), 421-432 (2019).
  9. Monika, T. -. B., Antoni, F., Piotr, G., Marian, M., Krzysztof, Z. Wisconsin Card Sorting Test in psychological examination of patients with psychiatric disorders. Polski merkuriusz lekarski: organ Polskiego Towarzystwa Lekarskiego. 25, 51-52 (2008).
  10. Merriam, E. P., Thase, M. E., Haas, G. L., Keshavan, M. S., Sweeney, J. A. Prefrontal cortical dysfunction in depression determined by Wisconsin Card Sorting Test performance. The American Journal of Psychiatry. 156 (5), 780-782 (1999).
  11. Monchi, O., Petrides, M., Petre, V., Worsley, K., Dagher, A. Wisconsin Card Sorting revisited: distinct neural circuits participating in different stages of the task identified by event-related functional magnetic resonance imaging. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (19), 7733-7741 (2001).
  12. Bulin, S. E., Hohl, K. M., Paredes, D., Silva, J. D., Morilak, D. A. Bidirectional optogenetically-induced plasticity of evoked responses in the rat medial prefrontal cortex can impair or enhance cognitive set-shifting. eNeuro. 7 (1), 0363 (2019).
  13. Chaby, L. E., Karavidha, K., Lisieski, M. J., Perrine, S. A., Liberzon, I. Cognitive Flexibility Training Improves Extinction Retention Memory and Enhances Cortical Dopamine With and Without Traumatic Stress Exposure. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 24 (2019).
  14. Drozd, R., Rojek-Sito, K., Rygula, R. The trait 'pessimism' does not interact with cognitive flexibility but makes rats more vulnerable to stress-induced motivational deficits: Results from the attentional set-shifting task. Behavioural Brain Research. 335, 199-207 (2017).
  15. Birrell, J. M., Brown, V. J. Medial frontal cortex mediates perceptual attentional set-shifting in the rat. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (11), 4320-4324 (2000).
  16. Floresco, S. B., Block, A. E., Tse, M. T. L. Inactivation of the medial prefrontal cortex of the rat impairs strategy set-shifting, but not reversal learning, using a novel, automated procedure. Behavioural Brain Research. 190 (1), 85-96 (2008).
  17. Grafe, L. A., Cornfeld, A., Luz, S., Valentino, R., Bhatnagar, S. Orexins Mediate Sex Differences in the Stress Response and in Cognitive Flexibility. Biological Psychiatry. 81 (8), 683-692 (2017).
  18. Snyder, K. P., Barry, M., Valentino, R. J. Cognitive impact of social stress and coping strategy throughout development. Psychopharmacology. 232 (1), 185-189 (2014).
  19. Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant procedures for assessing behavioral flexibility in rats. Journal of Visualized Experiments. (96), e52387 (2015).
  20. Sandi, C., Pinelo-Nava, M. T. Stress and Memory: Behavioral Effects and Neurobiological Mechanisms. Neural Plasticity. , 1-20 (2007).
  21. Shansky, R. M., Lipps, J. Stress-induced cognitive dysfunction: hormone-neurotransmitter interactions in the prefrontal cortex. Frontiers in Human Neuroscience. 7, 123 (2013).
  22. Ragozzino, M. E., Detrick, S., Kesner, R. P. Involvement of the prelimbic-infralimbic areas of the rodent prefrontal cortex in behavioral flexibility for place and response learning. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 19 (11), 4585-4594 (1999).
  23. Liston, C., et al. Stress-induced alterations in prefrontal cortical dendritic morphology predict selective impairments in perceptual attentional set-shifting. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26 (30), 7870-7874 (2006).
  24. Hatch, A., Wiberg, G. S., Balazs, T., Grice, H. C. Long-Term Isolation Stress in Rats. Science. 142 (3591), 507 (1963).
  25. Grafe, L. A., Cornfeld, A., Luz, S., Valentino, R., Bhatnagar, S. Orexins Mediate Sex Differences in the Stress Response and in Cognitive Flexibility. Biological Psychiatry. 81 (8), 683-692 (2017).
  26. Lapiz-Bluhm, M. D. S., et al. Behavioural assays to model cognitive and affective dimensions of depression and anxiety in rats. Journal of Neuroendocrinology. 20 (10), 1115-1137 (2008).
  27. McEwen, B. S. Permanence of brain sex differences and structural plasticity of the adult brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (13), 7128-7130 (1999).
  28. Manber, R., Armitage, R. Sex, steroids, and sleep: a review. Sleep. 22 (5), 540-555 (1999).
  29. Sherwin, B. B. Estrogen and Cognitive Functioning in Women. Endocrine Reviews. 24 (2), 133-151 (2003).
  30. Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146 (4), 1650-1673 (2005).
  31. Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
  32. Warren, B. L., et al. Neurobiological sequelae of witnessing stressful events in adult mice. Biological Psychiatry. 73 (1), 7-14 (2013).
  33. McAlonan, K., Brown, V. J. Orbital prefrontal cortex mediates reversal learning and not attentional set-shifting in the rat. Behavioural Brain Research. 146 (1-2), 97-103 (2003).
  34. Schoenbaum, G., Saddoris, M. P., Stalnaker, T. A. Reconciling the roles of orbitofrontal cortex in reversal learning and the encoding of outcome expectancies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1121 (1), 320-335 (2007).
  35. Meunier, M. Effects of orbital frontal and anterior cingulate lesions on object and spatial memory in rhesus monkeys. Neuropsychologia. 35 (7), 999-1015 (1997).
  36. Zappulla, R. A., Wang, W., Friedrich, V. L., Grabel, J., Nieves, J. CNS activation patterns underlying motor evoked potentials as demonstrated by c-fos immunoreactivity. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 43, 155-169 (1991).
  37. Schoenenberger, P., Gerosa, D., Oertner, T. G. Temporal Control of Immediate Early Gene Induction by Light. PLoS ONE. 4 (12), 8185 (2009).
  38. Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. The European Journal of Neuroscience. 36 (3), 2368-2375 (2012).
  39. Hancock, P. A., Warm, J. S. A dynamic model of stress and sustained attention. Human Performance in Extreme Environments. 7 (1), 15-28 (2003).
  40. Johnson, P. L., Molosh, A., Fitz, S. D., Truitt, W. A., Shekhar, A. Orexin, stress, and anxiety/panic states. Progress in Brain Research. 198, 133-161 (2012).
  41. Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
  42. Holmes, A., Wellman, C. L. Stress-induced prefrontal reorganization and executive dysfunction in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 33 (6), 773-783 (2009).
  43. Placek, K., Dippel, W. C., Jones, S., Brady, A. M. Impairments in set-shifting but not reversal learning in the neonatal ventral hippocampal lesion model of schizophrenia: further evidence for medial prefrontal deficits. Behavioural Brain Research. 256, 405-413 (2013).
  44. Nikiforuk, A., Popik, P. Long-lasting cognitive deficit induced by stress is alleviated by acute administration of antidepressants. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 28-39 (2011).
  45. Bondi, C. O., Rodriguez, G., Gould, G. G., Frazer, A., Morilak, D. A. Chronic unpredictable stress induces a cognitive deficit and anxiety-like behavior in rats that is prevented by chronic antidepressant drug treatment. Neuropsychopharmacology. 33 (2), 320-331 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены