Pruebas biotribológicas y análisis de cartílago articular que se desliza contra el metal para implantes

Resumen

Este protocolo describe la preparación, las pruebas biotribológicas y el análisis de cilindros osteocondrales que se deslizan contra el material del implante metálico. Las medidas de resultados incluidas en este protocolo son la actividad metabólica, la expresión génica y la histología.

Resumen

Los defectos osteocondrales en pacientes de mediana edad pueden tratarse con implantes metálicos focales. Desarrollados por primera vez para defectos en la articulación de la rodilla, los implantes ahora están disponibles para el hombro, la cadera, el tobillo y la primera articulación metatarsalfalángica. Al tiempo que proporciona reducción del dolor y mejora clínica, se observan cambios degenerativos progresivos del cartílago opuesto en muchos pacientes. Los mecanismos que conducen a este daño no se entienden completamente. Este protocolo describe un experimento tribológico para simular un emparejamiento de metal sobre cartílago y un análisis exhaustivo del cartílago articular. El material de implante metálico se prueba contra cilindros osteocondrales bovinos como modelo para el cartílago articular humano. Mediante la aplicación de diferentes cargas y velocidades de deslizamiento, las condiciones de carga fisiológicas pueden ser imitadas. Para proporcionar un análisis exhaustivo de los efectos sobre el cartílago articular, la histología, la actividad metabólica y el análisis de la expresión génica se describen en este protocolo. La principal ventaja de las pruebas tribológicas es que los parámetros de carga se pueden ajustar libremente para simular condiciones in vivo. Además, se pueden utilizar diferentes soluciones de prueba para investigar la influencia de la lubricación o agentes proinflamatorios. Mediante el uso de análisis de expresión génica para genes específicos del cartílago y genes catabólicos, se podrían detectar cambios tempranos en el metabolismo de los condrocitos articulares en respuesta a la carga mecánica.

Introducción

El tratamiento de los defectos osteocondrales es exigente y requiere cirugía en muchos casos. Para las lesiones osteocondriales focales en pacientes de mediana edad, los implantes metálicos focales son una opción viable, especialmente después del fracaso del tratamiento primario, como la estimulación de la médula ósea (BMS) o la implantación de condrocitos autólogos (ACI)¹. Los reemplazos parciales de superficie se pueden considerar procedimientos de salvamento que pueden reducir el dolor y mejorar el rango de movimiento^2. Estos implantes se componen típicamente de una aleación CoCrMo y están disponibles en diferentes tamaños y configuraciones de desplazamiento para que coincida con la anatomía normal^3. Mientras que inicialmente desarrollado para defectos en el cóndí femoral medial en la rodilla, tales implantes están ahora disponibles y en uso para la cadera, tobillo, hombro, y codo^4,5,6. Para un resultado satisfactorio, es crucial evaluar la alineación mecánica de las articulaciones y la condición del cartílago opuesto. Además, se ha demostrado que la correcta implantación sin protuberancia del implante es fundamental^7.

Los estudios clínicos demostraron excelentes resultados a corto plazo en términos de reducción del dolor y mejora de la función en pacientes de mediana edad para varios lugares^5,6,8. En comparación con la implantación de aloinjertos, los implantes metálicos focales permiten un rodamiento de peso temprano. Sin embargo, el cartílago articular opuesto mostró un desgaste acelerado en un número considerable de pacientes^9,10. Por lo tanto, incluso con la colocación adecuada, en muchos casos la degeneración del cartílago nativo parece inevitable, mientras que los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros. Cambios degenerativos similares se han observado después de la hemiarthroplastia bipolar de la cadera¹¹ y se incrementan con la actividad y la carga¹².

Los experimentos tribológicos ofrecen la posibilidad de estudiar estos emparejamientos in vitro y simular diferentes situaciones de carga que ocurren en condiciones fisiológicas^13. El uso de pasadores osteocondrales ofrece un modelo de geometría simple para investigar la tribología del cartílago articular que se desliza contra el cartílago nativo o cualquier material de implante¹⁴ y podría utilizarse en modelos de simulación de articulaciones enteras¹⁵. Los emparejamientos de metal sobre cartílago muestran un desgaste acelerado del cartílago, una interrupción de la matriz extracelular y una menor viabilidad celular en la zona superficial en comparación con un emparejamiento de cartílago sobre cartílago¹⁶. El daño al cartílago se produjo principalmente en forma de delaminación entre las zonas superficial y media^17. Sin embargo, los mecanismos que conducen a la degeneración del cartílago no se entienden completamente. Este protocolo proporciona un análisis exhaustivo de la actividad biosintética del cartílago articular. Mediante la determinación de la actividad metabólica y los niveles de expresión génica de los genes catabólicos, se pudieron identificar indicaciones tempranas para la descomposición del cartílago. La ventaja de los experimentos tribológicos in vitro es que los parámetros de carga se pueden ajustar para imitar diversas condiciones de carga.

Por lo tanto, el siguiente protocolo es adecuado para simular un emparejamiento de metal sobre cartílago, que representa un modelo experimental de hemiarthroplastia.

Protocolo

1. Preparación de cilindros metálicos

1. Analizar las varillas cilíndricas de cobalto-cromo-molibdeno (CoCrMo) cumpliendo con las especificaciones estándar para los implantes quirúrgicos para su composición química utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM) con espectroscopia de rayos X dispersiva de energía por protocolo del fabricante para confirmar los valores proporcionados.
   NOTA: La composición elemental de la aleación CoCrMo utilizada para este experimento es 65% Co, 28% Cr, 5% Mo y 2% otros.
2. Humedezca las muestras con papel de molienda de carburo de silicio a partir de un tamaño de grano de 500. Utilice papel de molienda en orden creciente hasta un tamaño de grano de 4000.
3. Pulir el cilindro con pasta de 3 y 1 m para lograr una rugosidad superficial que se encuentra dentro del nivel de tolerancia de los requisitos de acabado superficial para implantes quirúrgicos metálicos (ISO 5832-12:2019) e implantes de reemplazo total y parcial de articulaciones (ISO 21534:2007).
   NOTA: La rugosidad media de la superficie se determina mediante un microscopio confocal.
4. Corte las varillas CoCrMo (o de 6 mm) a cilindros con una longitud de 10 mm.

2. Cosecha de cilindros osteocondrales

1. Utilice las articulaciones de asfixia bovina de animales esqueléticamente maduros (de 18 a 24 meses de edad en el momento del sacrificio) y manténgalos contenidos y enfriados hasta la disección dentro de las 24 h después del sacrificio.
   NOTA: Las articulaciones se compran al carnicero local. La articulación permanece cerrada hasta la disección.
2. Para cosechar tapones osteocondral cilíndricos en condiciones asépticas, desinfecte la rodilla y realice una artrototomía y exponga el cóndí femoral medial.
   NOTA: La disección debe realizarse con precaución para no dañar la superficie articular.
3. Inspeccione la superficie articular en busca de daños macroscópicos.
   NOTA: Deseche la muestra si el cartílago carece de su aspecto blanquecino, liso y brillante o si hay ampollas, fisuras o defectos más grandes.
4. Alinee el tubo de corte perpendicular a la superficie articular del área de soporte de peso y conduzca el dispositivo hacia el cartílago y el hueso subcondral por golpes firmes con un martillo. A una profundidad de penetración de 15 mm, gire el dispositivo en el sentido de las agujas del reloj con un movimiento repentino.
5. Retire el dispositivo, inserte la perilla blanca y atornille hasta que el extremo inferior del enchufe osteocondral sea visible.
6. Marque la orientación anteroposterior de las muestras con un marcador estéril para organizar el cilindro osteocondral en consecuencia durante la prueba.
   NOTA: La red de colágeno tridimensional y su compleja arquitectura facilitan las propiedades mecánicas únicas del cartílago articular y deben tenerse en cuenta en la orientación de las muestras.
7. Enjuague la muestra con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lavar la sangre y el tejido graso.
8. Repita los pasos mencionados anteriormente para cosechar el número deseado de tapones osteocondrales (8 mm de diámetro, 15 mm de longitud).
   NOTA: Típicamente, 9 a 12 cilindros osteocondral se pueden cosechar de la zona de cojinete de peso en el cóndí femoral medial.
9. Colocar las muestras en el medio modificado de Eagle de Dulbecco que contenga un 10% de suero bovino fetal, complementado con antibióticos (penicilina 200 U/ml; estreptomicina 0,2 mg/ml) y anfotericina B 2,5 g/ml y almacenarlas a 4 oC hasta que se realicen pruebas para mantener la viabilidad.
10. Analizar los tapones osteocondrales de control inmediatamente después de la cosecha para establecer valores basales (ver sección de análisis).

3. Pruebas tribológicas

1. Realice los experimentos utilizando un tribómetro alternativo disponible comercialmente con una configuración de cilindro en placa. Los requisitos para el dispositivo son la carga vertical y la carga ajustable y la velocidad de deslizamiento. Además, una célula líquida permite realizar las pruebas en una solución lubricante.
2. Determine la presión de contacto en el sistema CoCrMo-on-cartilage utilizando una película de medición de presión. Coloque la película de medición de presión en la interfaz y aplique la carga estática durante 30 s para determinar la presión de contacto inicial, el tamaño del contacto y la forma. Debido a la convexidad del cilindro metálico y el cartílago articular, el área de contacto inicial tiene una forma elíptica en esta configuración.
   NOTA: La película de medición de presión reacciona a la presión aplicada mostrando la decoloración roja de las zonas donde se alcanza o supera la presión umbral. Para 1 N de carga, la presión de contacto se determinó alrededor de 2 MPa en comparación visual con las presiones de contacto definidas.
3. Fije los cilindros osteocondrales en el soporte de la muestra inferior con el marcado alineado con la dirección deslizante, y monte los cilindros CoCrMo en la celda de carga superior.
4. Añadir la solución de prueba (PBS con ácido hialurónico de 3 g/L) a la célula líquida que resulta en sumergir el cilindro osteocondral y cubrir la interfaz deslizante metal-cartílago.
5. Establezca los parámetros de prueba (fuerza normal prescrita, carrera y velocidad de deslizamiento), que luego se aplican y mantienen durante toda la prueba.
   NOTA: La longitud del trazo del movimiento alternativo debe establecerse de acuerdo con el área de contacto para crear un área de contacto de migración (MCA). Para tapones de 8 mm de diámetro, una carrera de 2 mm permite una adecuada rehidratación del cartílago.
6. Inicie el deslizamiento recíproco del cilindro CoCrMo contra el cartílago articular sumergido en la solución lubricante con los parámetros de carga establecidos.
7. Supervise el coeficiente de fricción (COF) durante los experimentos.
   NOTA: El COF se evalúa automáticamente, pero se puede calcular utilizando la ecuación μ-F/W (μ - coeficiente de fricción; F - fuerza de fricción; W - carga normal aplicada por el sistema).
8. Finalice el experimento después del período de prueba deseado.
9. Retire el tapón osteocondral del portacáneo, enjuáguelo con PBS y guárdelo en medio hasta un análisis biológico posterior (ver más abajo).
10. Sumerja las muestras de control en la solución de ensayo a temperatura ambiente durante la duración de la prueba y analice junto con las muestras que han sido expuestas a la carga mecánica.

4. Análisis

NOTA: Cilindro osteocondral se analizan para la actividad metabólica y la expresión génica para investigar la actividad biológica; la histología se realiza para estudiar la integridad de la superficie del cartílago y la matriz subyacente.

1. Histología
   1. Para el análisis histológico, sumerja los tapones osteocondral en una solución de formaldehído tamponado del 4% a temperatura ambiente hasta su posterior procesamiento.
   2. Enjuague las muestras con PBS y colóquelas en un recipiente de plástico.
   3. Agregue un exceso de la solución descalcificador lista para usar para que todas las muestras estén cubiertas.
   4. Aplicar agitación constante durante 4 semanas para una descalcificación completa.
   5. Después de la descalcificación, incrustar las muestras en glicoles y resinas solubles en agua y almacenarlas a 80 oC.
   6. Obtener secciones de 6 m mediante la criocciones transversales a la zona de contacto.
   7. Posteriormente, prepare las muestras para la tinción Safranin O y la contramancha Fastgreen utilizando el protocolo de un fabricante.
   8. Capture imágenes histológicas utilizando un microscopio y procese utilizando un software de procesamiento de imágenes.
2. Actividad metabólica
   NOTA: La actividad metabólica de los condrocitos en el cartílago articular se investiga con un ensayo toxicológico ex vivo basado en XTT.
   1. Enjuague el tapón osteocondral usando PBS y coloque la muestra en un plato de Petri.
   2. Coloque una placa de 24 pozos en una escala y cero la escala.
   3. Cortar el cartílago del injerto osteocondral con un bisturí en una sola pieza.
   4. Bisect el cartílago en dos piezas iguales para que el área de contacto se distribuya por igual en ambas piezas de cartílago y picar una mitad a 1 mm3 piezas. La segunda mitad se utiliza para el análisis de la expresión génica.
   5. Transfiera el cartílago picado en un pozo de la placa preparada de 24 pozos y determine el peso del tejido.
   6. Repita los pasos mencionados anteriormente para cada muestra y agregue 1 ml de medio de crecimiento a cada pozo de la placa.
   7. Añadir la solución XTT (490 ml de reactivo de etiquetado XTT y 10 l de reactivo de activación) de acuerdo con las instrucciones y la mezcla del fabricante.
   8. Incubar la placa a 37oC y 5% de_CO2 durante 4 h.
   9. Después de la incubación, retire el sobrenadante y transfiéralo a un tubo de 5 ml.
   10. Extraiga el producto de tetrazolium añadiendo 0,5 ml de dimetilsólfóxido (DMSO) al tejido del cartílago en la placa de 24 pocillos y aplique agitación continua durante 1 h a temperatura ambiente.
   11. Quite la solución DMSO y a lagúlela con la solución XTT recopilada anteriormente.
   12. Transfiera 100 l de la muestra en triplicados en una placa de 96 pocillos en un lector de placas y mida la absorbancia a una longitud de onda de 492 nm y una longitud de onda de referencia a 690 nm.
   13. Normalice los valores de absorbancia resultantes al peso húmedo de cada muestra y realice análisis utilizando software.
3. Análisis de expresión génica
   1. Aislamiento de ARN
      NOTA: El aislamiento del ARN se lleva a cabo utilizando un kit comercial(Tabla de Materiales) deacuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante con pequeñas modificaciones.
      1. Mince la segunda mitad del tejido del cartílago obtenido del tapón osteocondral en trozos pequeños.
      2. Transfiéralos a un tubo que contenga perlas cerámicas y 300 l de tampón de lísis (que contiene un 1% β-mercaptoetanol).
         NOTA: Las muestras se pueden congelar en nitrógeno líquido hasta su posterior procesamiento.
      3. Descongelar las muestras durante 2 min y utilizar el lyser comercial para la homogeneización del tejido. Aplicar 6500 rpm durante 20 s (paso de homogeneización) cuatro veces con una fase de enfriamiento de 2 min después de cada carrera (a 4 oC utilizando el dispositivo de enfriamiento delyser comercial) para interrumpir completamente el tejido.
      4. Añadir 20 l de proteinasa K y 580 l de agua libre de RNase a cada tubo e incubarlos a 55 oC durante 30 min.
      5. Centrifugar las muestras durante 3 min a 10.000 x g y transferir el sobrenadante a un tubo de 1,5 ml.
      6. Añadir 0,5 volúmenes de etanol al 90% a cada tubo y mezclar.
      7. Transfiera 700 l de la muestra a una columna de unión de ARN colocada en un tubo de recogida de 2 ml y centrífuga a 8.000 x g para 15 s.
      8. Deseche el flujo y repita el paso de centrifugación para el lysate completo.
      9. Agregue 350 l de buffer RW1 a la columna, centrifugar a 8.000 x g para 15 s y deseche el flujo a través.
      10. Mezcle 10 ml de solución de DNase en stock y 70 l de RDD de búfer. Añadir la solución a la membrana de purificación de ARN e incubarla a temperatura ambiente durante 15 min.
      11. Agregue 350 l de Tampón RW1 a la columna y centrífuga a 8.000 x g para 15 s. Deseche el flujo a través.
      12. Añadir 500 l de Tampón RPE y centrífuga a 8.000 x g para 15 s. Deseche el flujo a través.
      13. Añadir 500 l de Tampón RPE a la columna de purificación de ARN y centrífuga a 8.000 x g durante 2 min.
      14. Coloque la columna en un tubo de recogida de 1,5 ml y añada 30 l de agua sin RNase. Centrífuga a 8.000 g g durante 1 min.
      15. Conservar el ARN aislado a -80 oC hasta la síntesis de ADNr.
   2. Síntesis de ADNC
      NOTA: Para sintetizar ADN complementario (ADNc) del ARN mensajero (ARNm) se utilizó un kit comercial (Tabla de materiales). Se añadió ARN de bacteriófago MS2 para estabilizar el ARN aislado durante la síntesis de ADNr.
      1. Descongelar y mezclar los reactivos. La composición de una sola reacción se muestra en la Tabla 1.
      2. Añadir 16 l de muestra de ARN al volumen para una sola reacción (14 l).
      3. Realizar la síntesis de ADNC en un ciclor térmico utilizando los siguientes parámetros: 10 min a 25oC (primer annealing), 60 min a 50oC (síntesis de ADN), 5 min a 85oC (desnaturalización) y 5 min a 20oC (fase de enfriamiento).
      4. Almacene el ADNC a -20 oC hasta la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR).
   3. RT-qPCR
      NOTA: Para RT-qPCR de muestras bovinas, las imprimaciones y sondas se diseñaron utilizando software qPCR comercial en tiempo real (por ejemplo, IDT) para los genes GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate deshidrogenase), COL2A1 (Collagen type 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Collagen type 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1) y MMP-13 (Matrix Metalloproteinase-13). Las imprimaciones bovinas y las sondas de doble enfriamiento fueron proporcionadas por IDT. Los reactivos utilizados para una sola reacción para evaluar la eficiencia y la expresión génica se muestran en la Tabla 2.
      1. Dispensar la mezcla maestra de una sola reacción (9 l) a cada pocero de una placa PCR de 96 pocillos y añadir 1 l de ADNc a cada reacción. Realizar pruebas para cada muestra en triplicados.
      2. Cierre la placa PCR con aceite de sellado y centrífuga a 877 x g durante 10 min a 4oC.
      3. Realice RT-qPCR utilizando un ciclor térmico de precisión con el siguiente protocolo: 95 oC durante 10 min, 45 ciclos de amplificación (95 oC para 10 s, recocido para 30 s, síntesis de cDNA) y 37 oC durante 30 s.
         NOTA: Se requieren temperaturas de recocido específicas para cada imprimación.
      4. Utilice GAPDH junto con los genes diana para confirmar la eficiencia.
      5. Utilice el software proporcionado para calcular la eficiencia de cada gen.
      6. Normalice los valores del umbral de ciclo (CT) a la expresión del gen de referencia GAPDH y utilice el método de LA CT para la cuantificación.

Resultados

El área de contacto y la presión de contacto deben confirmarse mediante una película de medición de presión(Figura 1). La condición de carga fisiológica se puede confirmar comparando con las impresiones de referencia para las presiones de contacto definidas. Durante las pruebas, el coeficiente de fricción se controla constantemente. Con un área de contacto de migración, se puede mantener un bajo coeficiente de fricción durante al menos 1 h (Figura 2)....

Discusión

Los implantes metálicos focales representan un procedimiento de rescate para defectos osteocondrales, especialmente en pacientes de mediana edad y después de un tratamiento primario fallido. Aunque los estudios clínicos demostraron resultados prometedores a corto plazo, una complicación observada es el daño al cartílago nativo opuesto,^10. Los estudios de cadáveres y biomecánicos muestran evidencia clara de que la implantación adecuada con posicionamiento plano o ligeramente empotrada mant...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma?Aldrich Chemie GmbH	A-2942-100ML
buffered formaldehyde solution 4%	VWR	97131000
Cell Proliferation Kit II (XTT)	Roche Diagnostics	11465015001	XTT-based ex vivo toxicology assay
CoCrMo raw material	Acnis International		CoCrMo rods 6mm in diameter
CryoStar NX70 Cryostat	Thermo Fischer Scientific		cryosectioning device
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sidma-Aldrich Chemie	D 2438-10ML
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Sigma?Aldrich Chemie GmbH		medium
fetal bovine serum	Gibco
Hyaluronic acid	Anika Therapeutics Inc.		component of lubricating solution
iCycler	BioRad		thermal cycler
Leica microscope DM?1000	Leica		microscope for histology
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche Diagnostics
LightCycler 96	Roche Diagnostics		thermal cycler for PCR
MagNA Lyser Green Beads	Roche Diagnostics	3358941001
Osteochondral Autograft Transfer System (OATS)	Arthrex Inc.		cutting tube for harvesting osteochondral cylinders
osteosoft	Merck	1017279010	decalcifier-solution
Penicillin /Streptomycin	Sigma?Aldrich Chemie GmbH	P4333-100ML
phosphate?buffered saline	Sigma?Aldrich Chemie GmbH		PBS
Prescale Low Pressure	Fujifilm		pressure indicating film
RNeasy Fibrous Tissue Kit	QIAGEN	74404
Synergy 2	BioTek Instruments		plate reader
Tetra?Falex MUST	Falex Tribology		Tribometer
Tissue? Tek O.C.T.	SAKURA	4583	embedding formulation
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche Diagnostics	40897030001
β-mercaptoethanol	Sidma-Aldrich Chemie	M3148