Testes biotribológicos e Análise de Cartilagem Articular Deslizando contra Metal para Implantes

Resumo

Este protocolo descreve a preparação, testes biotribológicos e análise de cilindros osteocondrais deslizando contra material de implante metálico. As medidas de desfecho incluídas neste protocolo são atividade metabólica, expressão genética e histologia.

Resumo

Defeitos osteocondriais em pacientes de meia-idade podem ser tratados com implantes metálicos focais. Desenvolvidos pela primeira vez para defeitos na articulação do joelho, os implantes estão agora disponíveis para o ombro, quadril, tornozelo e a primeira articulação metatarsalphalangeal. Ao mesmo tempo em que proporcionam redução da dor e melhora clínica, alterações degenerativas progressivas da cartilagem oposta são observadas em muitos pacientes. Os mecanismos que levam a esse dano não são totalmente compreendidos. Este protocolo descreve um experimento tribológico para simular um emparelhamento metal-sobre-cartilagem e uma análise abrangente da cartilagem articular. O material de implante metálico é testado contra cilindros osteocondriais bovinos como modelo para cartilagem articular humana. Aplicando cargas diferentes e velocidades deslizantes, as condições de carregamento fisiológico podem ser imitadas. Para fornecer uma análise abrangente dos efeitos sobre a cartilagem articular, histologia, atividade metabólica e análise de expressão genética estão descritos neste protocolo. A principal vantagem do teste tribológico é que os parâmetros de carregamento podem ser ajustados livremente para simular condições in vivo. Além disso, diferentes soluções de teste podem ser usadas para investigar a influência de agentes de lubrificação ou pró-inflamatórios. Usando a análise de expressão genética para genes específicos da cartilagem e genes catabólicos, podem ser detectadas alterações precoces no metabolismo de condrócitos articular em resposta ao carregamento mecânico.

Introdução

O tratamento de defeitos osteocondriais é exigente e requer cirurgia em muitos casos. Para lesões osteocondriais focais em pacientes de meia-idade, implantes metálicos focais são uma opção viável, especialmente após a falha do tratamento primário, como estimulação da medula óssea (SMO) ou implantação de condrócito autólogo (ACI)¹. Substituições parciais de superfície podem ser consideradas procedimentos de salvamento que podem reduzir a dor e melhorar a faixa de movimento². Esses implantes são tipicamente compostos de uma linha de terapia CoCrMo e estão disponíveis em diferentes tamanhos e configurações offset para corresponder à anatomia normal³. Embora inicialmente desenvolvidos para defeitos no condíle femoral medial no joelho, tais implantes estão agora disponíveis e em uso para o quadril, tornozelo, ombro e cotovelo^4,5,6. Para um desfecho satisfatório, é fundamental avaliar o alinhamento mecânico das articulações e a condição da cartilagem oposta. Além disso, a implantação correta sem a saliência do implante tem se mostrado fundamental⁷.

Estudos clínicos demonstraram excelentes resultados de curto prazo em termos de redução da dor e melhora da função em pacientes de meia-idade para diversos locais^5,6,8. Comparados com a implantação de aoenxerto, os implantes metálicos focais permitem o rolamento precoce do peso. No entanto, a cartilagem articular oposta mostrou desgaste acelerado em um número considerável de pacientes^9,10. Assim, mesmo com a colocação adequada, em muitos casos a degeneração da cartilagem nativa parece inevitável, enquanto os mecanismos subjacentes permanecem incertos. Alterações degenerativas semelhantes foram observadas após hemiartropa bipolar do quadril¹¹ e são aumentadas com atividade e carregamento¹².

Experimentos triológicos proporcionam a possibilidade de estudar tais pares in vitro e simular diferentes situações de carregamento ocorridas em condições fisiológicas¹³. O uso de pinos osteocondriais oferece um modelo de geometria simples para investigar a tribologia da cartilagem articular deslizando contra cartilagem nativa ou qualquer material de implante¹⁴ e pode ser usado ainda em modelos inteiros de simulação articular¹⁵. Os pares metálico-sobre-cartilagem mostram desgaste acelerado da cartilagem, interrupção da matriz extracelular e diminuição da viabilidade celular na zona superficial em comparação com um pareamento cartilagem-sobre-cartilagem¹⁶. Os danos na cartilagem ocorreram principalmente na forma de delaminação entre as zonas superficial e média¹⁷. No entanto, os mecanismos que levam à degeneração da cartilagem não são totalmente compreendidos. Este protocolo fornece uma análise abrangente da atividade biossintética da cartilagem articular. Pela determinação da atividade metabólica e dos níveis de expressão genética dos genes catabólicos, podem ser identificadas indicações precoces para a quebra da cartilagem. A vantagem dos experimentos triológicos in vitro é que os parâmetros de carregamento podem ser ajustados para imitar várias condições de carregamento.

Assim, o protocolo a seguir é adequado para simular um emparelhamento metal-sobre-cartilagem, representando um modelo experimental de hemiartropa.

Protocolo

1. Preparação de cilindros metálicos

1. Analise as hastes cilíndricas cobalto-cromo-molbdenum (CoCrMo) que preenchem as especificações padrão para implantes cirúrgicos para sua composição química usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) com espectroscopia de raios-X dispersiva de energia por protocolo do fabricante para confirmar valores fornecidos.
   NOTA: A composição elementar da alloy CoCrMo utilizada para este experimento é de 65% Co, 28% Cr, 5% Mo e 2% outros.
2. Moer as amostras com papel de moagem de carboneto de silício começando com um tamanho de grão de 500. Use papel de moagem em ordem crescente até um tamanho de grão de 4000.
3. Polir o cilindro com pasta de 3 μm e 1 μm para alcançar uma rugosidade superficial que esteja dentro do nível de tolerância dos requisitos de acabamento da superfície para implantes cirúrgicos metálicos (ISO 5832-12:2019) e implantes de substituição articular total e parcial (ISO 21534:2007).
   NOTA: A rugosidade média da superfície é determinada usando um microscópio confocal.
4. Corte as hastes CoCrMo (Ø de 6 mm) para cilindros com um comprimento de 10 mm.

2. Colheita de cilindros osteocondrais

1. Use juntas bovinas de animais maduros (idades entre 18 e 24 meses no momento do sacrifício) e mantenha-as contidas e resfriadas até a dissecção dentro de 24 horas após o sacrifício.
   NOTA: As juntas são compradas do açougueiro local. A articulação permanece fechada até a dissecação.
2. Para colher os plugues osteocondriais cilíndricos em condições assépticas, desinfetar o joelho e realizar uma artrotomia e expor o condíle femoral medial.
   NOTA: A dissecação deve ser realizada com cautela para não danificar a superfície articular.
3. Inspecione a superfície articular em busca de danos macroscópicos.
   NOTA: Descarte a amostra se a cartilagem não tiver sua aparência esbranquiçada, lisa e brilhante ou se houver bolhas, fissuras ou defeitos maiores.
4. Alinhe o tubo de corte perpendicular à superfície articular da área de rolamento de peso e conduza o dispositivo para dentro da cartilagem e osso subcondral por golpes firmes com um martelo. A 15 mm de profundidade de penetração, torça o dispositivo no sentido horário com um movimento repentino.
5. Retire o dispositivo, insira o botão branco e enrosque-o até que a extremidade inferior do plugue osteocondral esteja visível.
6. Marque a orientação anteroposterior das amostras com um marcador estéril, a fim de organizar o cilindro osteocondral em conformidade durante o teste.
   NOTA: A rede tridimensional de colágeno e sua arquitetura complexa facilitam as propriedades mecânicas únicas da cartilagem articular e devem ser consideradas na orientação das amostras.
7. Enxágüe a amostra com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para lavar sangue e tecido adiposo.
8. Repita as etapas mencionadas acima para colher o número desejado de tampões osteocondriais (diâmetro de 8 mm, 15 mm de comprimento).
   NOTA: Normalmente, 9 a 12 cilindros osteocondrais podem ser colhidos da área de rolamento de peso no condíle femoral medial.
9. Coloque as amostras no meio modificado da Águia de Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal, complementado com antibióticos (penicilina 200 U/mL; estreptomicina 0,2 mg/mL) e anfotericina B 2,5 μg/mL e armazená-las a 4 °C até o teste para manter a viabilidade.
10. Analise os plugues osteocondrais de controle imediatamente após a colheita para estabelecer valores de linha de base (ver seção de análise).

3. Testes triológicos

1. Realize os experimentos usando um tribometer recíproco comercialmente disponível com uma configuração de cilindro na placa. Os requisitos para o dispositivo são carregamento vertical e carga ajustável e velocidade de deslizamento. Além disso, uma célula líquida permite realizar os testes em uma solução lubrificante.
2. Determine a pressão de contato no sistema CoCrMo-on-cartilagem usando uma filme de medição de pressão. Coloque a película de medição de pressão na interface e aplique carga estática para 30 s para determinar a pressão de contato inicial, o tamanho do contato e a forma. Devido à convexidade do cilindro metálico e da cartilagem articular, a área de contato inicial tem uma forma elíptica nesta configuração.
   NOTA: O filme de medição de pressão reage à pressão aplicada mostrando descoloração vermelha de zonas onde a pressão do limiar é atingida ou excedida. Para 1 N de carga, a pressão de contato foi determinada em torno de 2 MPa por comparação visual com pressões de contato definidas.
3. Fixar os cilindros osteocondrais no suporte da amostra inferior com a marcação alinhada com a direção deslizante e montar os cilindros CoCrMo na célula de carga superior.
4. Adicione a solução de teste (PBS com ácido hialurônico de 3 g/L) na célula líquida que resulta em submergir o cilindro osteocondral e cobrir a interface de deslizamento metal-cartilagem.
5. Defina os parâmetros de teste (força normal prescrita, curso e velocidade de deslizamento), que são então aplicados e mantidos durante todo o teste.
   NOTA: O comprimento do curso do movimento recíproco deve ser definido de acordo com a área de contato para criar uma área de contato migratório (MCA). Para os plugues de 8 mm de diâmetro, um curso de 2 mm permite uma reidratação adequada da cartilagem.
6. Inicie o deslizamento recíproco do cilindro CoCrMo contra a cartilagem articular imersa na solução lubrificante com os parâmetros de carregamento definidos.
7. Monitore o coeficiente de atrito (COF) durante os experimentos.
   NOTA: O COF é avaliado automaticamente, mas pode ser calculado usando a equação μ=F/W (μ - coeficiente de atrito; F - força de fricção; W - carga normal aplicada pelo sistema).
8. Termine o experimento após o período de teste desejado.
9. Retire o plugue osteocondral do suporte da amostra, enxágüe-o com PBS e armazene-o em meio até uma análise biológica adicional (veja abaixo).
10. Submerse amostras de controle na solução de teste à temperatura ambiente durante a duração do teste e analise juntamente com amostras que foram expostas ao carregamento mecânico.

4. Análise

NOTA: O cilindro osteocondral é analisado para atividade metabólica e expressão genética para investigar a atividade biológica; a histologia é realizada para estudar a integridade da superfície da cartilagem e a matriz subjacente.

1. Histologia
   1. Para análise histológica, mergulhe os plugues osteocondral em solução de formaldeído tamponada de 4% à temperatura ambiente até um processamento posterior.
   2. Enxágüe as amostras com PBS e coloque-as em um vaso plástico.
   3. Adicione um excesso da solução de decalcificador pronta para uso para que todas as amostras sejam cobertas.
   4. Aplique agitação constante por 4 semanas para descalcificação completa.
   5. Após a decalcificação, incorpore as amostras em glicols solúveis em água e resinas e armazene-as a −80 °C.
   6. Obtenha seções de 6 μm por criosectioning transversal para a área de contato.
   7. Posteriormente, prepare as amostras para a coloração de Safranin O e contra-retenção fastgreen usando o protocolo do fabricante.
   8. Capture imagens histológicas usando um microscópio e processe usando software de processamento de imagens.
2. Atividade metabólica
   NOTA: A atividade metabólica dos condrócitos na cartilagem articular é investigada com um ensaio toxicológico ex vivo à base de XTT.
   1. Enxágüe o plugue osteocondral usando PBS e coloque a amostra em uma placa de Petri.
   2. Coloque uma placa de 24 poços em uma escala e zero a balança.
   3. Corte a cartilagem do enxerto osteocondral com um bisturi inteiro.
   4. Bissecte a cartilagem em duas partes iguais para que a área de contato seja igualmente distribuída em ambos os pedaços de cartilagem e pica-se de meia a 1 mm³. A segunda metade é usada para análise de expressão genética.
   5. Transfira a cartilagem picada em um poço da placa preparada de 24 poços e determine o peso do tecido.
   6. Repita as etapas mencionadas acima para cada amostra e adicione 1 mL de meio de crescimento a cada poço da placa.
   7. Adicione a solução XTT (490 μL de reagente de rotulagem XTT e 10 μL de reagente de ativação) de acordo com a instrução e mistura do fabricante.
   8. Incubar a placa a 37 °C e 5% de CO₂ por 4h.
   9. Após a incubação, remova o supernasal e transfira-o para um tubo de 5 mL.
   10. Extrair o produto tetrazolium adicionando 0,5 mL de sulfóxido de dimetila (DMSO) ao tecido da cartilagem na placa de 24 poços e aplique agitação contínua por 1h à temperatura ambiente.
   11. Remova a solução DMSO e colecione-a com a solução XTT coletada anteriormente.
   12. Transfira 100 μL da amostra em triplicados em uma placa de 96 poços em um leitor de placa e meça a absorvância em um comprimento de onda de 492 nm e um comprimento de onda de referência a 690 nm.
   13. Normalize os valores de absorção resultantes para o peso úmido de cada amostra e realize a análise utilizando software.
3. Análise de expressão genética
   1. Isolamento do RNA
      NOTA: O isolamento do RNA é realizado utilizando-se um kit comercial(Tabela de Materiais) deacordo com as instruções fornecidas pelo fabricante com pequenas alterações.
      1. Pique a segunda metade do tecido da cartilagem obtida a partir do plugue osteocondral em pequenos pedaços.
      2. Transfira-os para um tubo contendo contas cerâmicas e 300 μL de Tampão de Lysis (contendo 1% β-mercaptoetanol).
         NOTA: As amostras podem ser congeladas em nitrogênio líquido até um processamento posterior.
      3. Descongele as amostras por 2 minutos e utilize o lyser comercial para homogeneização do tecido. Aplique 6500 rpm para 20 s (etapa de homogeneização) quatro vezes com uma fase de resfriamento de 2 minutos após cada execução (a 4 °C usando o dispositivo de resfriamento comercial) para interromper totalmente o tecido.
      4. Adicione 20 μL de proteinase K e 580 μL de água sem RNase em cada tubo e incuba-os a 55 °C por 30 min.
      5. Centrifugar as amostras por 3 min a 10.000 x g e transferir o supernasal para um tubo de 1,5 mL.
      6. Adicione 0,5 volumes de 90% de etanol a cada tubo e misture.
      7. Transfira 700 μL da amostra para uma coluna de ligação de RNA colocada em um tubo de coleta de 2 mL e centrífuga a 8.000 x g para 15 s.
      8. Descarte o fluxo e repita a etapa de centrifugação para o lise completo.
      9. Adicione 350 μL de Buffer RW1 à coluna, centrífuga a 8.000 x g para 15 s e descarte o fluxo..
      10. Misture 10 μL de solução de estoque DNase e 70 μL de BUFFER RDD. Adicione a solução à membrana de purificação do RNA e incuba-a à temperatura ambiente por 15 minutos.
      11. Adicione 350 μL de Buffer RW1 à coluna e centrífuga a 8.000 x g para 15 s. Descarte o fluxo.
      12. Adicione 500 μL de Buffer RPE e centrífuga a 8.000 x g para 15 s. Descarte o fluxo.
      13. Adicione 500 μL de RPE tampão à coluna de purificação do RNA e centrífuga a 8.000 x g por 2 min.
      14. Coloque a coluna em um tubo de coleta de 1,5 mL e adicione 30 μL de água sem RNase. Centrifugar a 8.000 x g por 1 min.
      15. Armazene o RNA isolado a -80 °C até a síntese de cDNA.
   2. Síntese cDNA
      NOTA: Para sintetizar o DNA complementar (cDNA) do mensageiro RNA (mRNA) foi utilizado um kit comercial (Tabela de Materiais). O RNA do bacteriófago MS2 foi adicionado para estabilizar o RNA isolado durante a síntese de CDNA.
      1. Descongele e misture os reagentes. A composição para uma única reação é mostrada na Tabela 1.
      2. Adicione 16 μL de amostra de RNA ao volume para uma única reação (14 μL).
      3. Realize a síntese de cDNA em um cicloviário térmico utilizando os seguintes parâmetros: 10 min a 25 °C (ressarcimento de primer), 60 min a 50 °C (síntese de DNA), 5 min a 85 °C (desnaturação) e 5 min a 20 °C (fase de resfriamento).
      4. Armazene cDNA a -20 °C até a reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR).
   3. RT-qPCR
      NOTA: Para RT-qPCR de amostras bovinas, primers e sondas foram projetados usando software comercial de qPCR em tempo real (por exemplo, IDT) para os genes GAPDH (Glicealdeído 3-fosfato desidrogenase), COL2A1 (Colágeno tipo 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Colágeno tipo 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1) e MMP-13 (Matrix Metalloproteinase-13). Primers bovinos e sondas duplas saciadas foram fornecidos pelo IDT. Os reagentes utilizados para uma única reação para avaliar a eficiência e a expressão genética são exibidos na Tabela 2.
      1. Dispense a mistura mestre de uma única reação (9 μL) a cada poço de uma placa PCR de 96 poços e adicione 1 μL de cDNA a cada reação. Realizar testes para cada amostra em triplicados.
      2. Feche a placa PCR usando óleo de vedação e centrífuga a 877 x g por 10 min a 4 °C.
      3. Execute o RT-qPCR utilizando um cicloviário térmico de precisão com o seguinte protocolo: 95 °C para 10 min, 45 ciclos de amplificação (95 °C para 10 s, ressarcendo para 30 s, síntese de cDNA) e 37 °C para 30 s.
         NOTA: São necessárias temperaturas específicas de ressarcial para cada primer.
      4. Use GAPDH junto com os genes alvo para confirmar a eficiência.
      5. Use o software fornecido para calcular a eficiência de cada gene.
      6. Normalize os valores do limiar de ciclo (TC) à expressão do gene de referência GAPDH e use o método ΔΔCT para quantificação.

Resultados

A área de contato e a pressão de contato devem ser confirmadas por meio de um filme de medição de pressão(Figura 1). A condição de carregamento fisiológico pode ser confirmada comparando-se com impressões de referência para pressões de contato definidas. Durante o teste, o coeficiente de atrito é monitorado constantemente. Com uma área de contato migratória, um coeficiente de baixo atrito pode ser mantido por pelo menos 1 h(Figura 2). Utilizando Sa...

Discussão

Implantes metálicos focais representam um procedimento de salvamento para defeitos osteocondriais, especialmente em pacientes de meia-idade e após o tratamento primário falho. Embora estudos clínicos demonstrassem resultados promissores a curto prazo, uma complicação observada é danos à cartilagem nativa^{oposta 10}. Estudos de cadáveres e biomecânicos mostram evidências claras de que a implantação adequada com posicionamento plano ou ligeiramente recesso mantém pressões naturais de co...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma?Aldrich Chemie GmbH	A-2942-100ML
buffered formaldehyde solution 4%	VWR	97131000
Cell Proliferation Kit II (XTT)	Roche Diagnostics	11465015001	XTT-based ex vivo toxicology assay
CoCrMo raw material	Acnis International		CoCrMo rods 6mm in diameter
CryoStar NX70 Cryostat	Thermo Fischer Scientific		cryosectioning device
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sidma-Aldrich Chemie	D 2438-10ML
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Sigma?Aldrich Chemie GmbH		medium
fetal bovine serum	Gibco
Hyaluronic acid	Anika Therapeutics Inc.		component of lubricating solution
iCycler	BioRad		thermal cycler
Leica microscope DM?1000	Leica		microscope for histology
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche Diagnostics
LightCycler 96	Roche Diagnostics		thermal cycler for PCR
MagNA Lyser Green Beads	Roche Diagnostics	3358941001
Osteochondral Autograft Transfer System (OATS)	Arthrex Inc.		cutting tube for harvesting osteochondral cylinders
osteosoft	Merck	1017279010	decalcifier-solution
Penicillin /Streptomycin	Sigma?Aldrich Chemie GmbH	P4333-100ML
phosphate?buffered saline	Sigma?Aldrich Chemie GmbH		PBS
Prescale Low Pressure	Fujifilm		pressure indicating film
RNeasy Fibrous Tissue Kit	QIAGEN	74404
Synergy 2	BioTek Instruments		plate reader
Tetra?Falex MUST	Falex Tribology		Tribometer
Tissue? Tek O.C.T.	SAKURA	4583	embedding formulation
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche Diagnostics	40897030001
β-mercaptoethanol	Sidma-Aldrich Chemie	M3148