Essais et analyse biotribologiques du cartilage articulaire glissant contre le métal pour les implants

Résumé

Ce protocole décrit la préparation, les essais biotribologiques et l’analyse des cylindres ostéochondral glissant contre le matériel d’implant métallique. Les mesures des résultats incluses dans ce protocole sont l’activité métabolique, l’expression des gènes et l’histologie.

Résumé

Les défauts ostéochondral dans les patients entre deux âges pourraient être traités avec des implants métalliques focaux. D’abord développés pour des défauts dans l’articulation du genou, les implants sont maintenant disponibles pour l’épaule, la hanche, la cheville et la première articulation métatarsalphalangeal. Tout en fournissant la réduction de douleur et l’amélioration clinique, des changements dégénératifs progressifs du cartilage opposé sont observés dans beaucoup de patients. Les mécanismes menant à ces dommages ne sont pas entièrement compris. Ce protocole décrit une expérience tribologique pour simuler un appariement métal-sur-cartilage et une analyse complète du cartilage articulaire. Le matériel d’implant métallique est testé contre les cylindres ostéochondral bovins comme modèle pour le cartilage articulaire humain. En appliquant différentes charges et vitesses de glissement, les conditions physiologiques de chargement peuvent être imitées. Pour fournir une analyse complète des effets sur le cartilage articulaire, l’histologie, l’activité métabolique et l’analyse d’expression de gène sont décrites dans ce protocole. Le principal avantage des essais tribologiques est que les paramètres de chargement peuvent être ajustés librement pour simuler des conditions in vivo. En outre, différentes solutions d’essai pourraient être utilisées pour étudier l’influence de la lubrification ou des agents pro-inflammatoires. En utilisant l’analyse de l’expression génétique pour les gènes spécifiques au cartilage et les gènes cataboliques, des changements précoces dans le métabolisme des chondrocytes articulaires en réponse à la charge mécanique pourraient être détectés.

Introduction

Le traitement des défauts ostéochondral est exigeant et exige la chirurgie dans beaucoup de cas. Pour les lésions ostéochondral focales chez les patients d’âge moyen, les implants métalliques focaux sont une option viable, surtout après l’échec du traitement primaire, comme la stimulation de la moelle osseuse (BMS) ou l’implantation autologue de chondrocytes (ACI)¹. Les remplacements partiels de surface peuvent être considérés comme des procédures de récupération qui peuvent réduire la douleur et améliorer l’étendue du^{mouvement 2}. Ces implants sont généralement composés d’un alliage CoCrMo et sont disponibles en différentes tailles et configurations offset pour correspondre à l’anatomie normale³. Alors qu’initialement développé pour les défauts sur le condyle fémoral médial dans le genou, ces implants sont maintenant disponibles et en usage pour la hanche, la cheville, l’épaule et^{le coude 4,5,6}. Pour un résultat satisfaisant, il est crucial d’évaluer l’alignement articulaire mécanique et l’état du cartilage adverse. En outre, l’implantation correcte sans saillie de l’implant s’est montrée fondamentale^7.

Les études cliniques ont démontré d’excellents résultats à court terme en termes de réduction de la douleur et d’amélioration de la fonction chez les patients d’âge^{moyen pour divers endroits 5,6,8}. Comparés à l’implantation d’allogreffe, les implants métalliques focaux permettent un port précoce du poids. Cependant, le cartilage articulaire opposé a montré l’usure accélérée dans un nombre considérable de patients^9,10. Par conséquent, même avec le placement approprié, dans beaucoup de cas la dégénérescence du cartilage indigène semble inévitable, alors que les mécanismes sous-jacents restent peu clairs. Des changements dégénératifs similaires ont été observés après l’hémiarthroplastie bipolaire de^{la hanche 11} et sont augmentés avec l’activité et le^{chargement 12}.

Les expériences tribologiques offrent la possibilité d’étudier de tels appariements in vitro et de simuler différentes situations de chargement se produisant dans des conditions^{physiologiques 13}. L’utilisation d’épingles ostéochondral offre un modèle de géométrie simple pour étudier la tribologie du cartilage articulaire glissant contre le cartilage indigène ou tout matériel d’implant^{14 et} pourrait encore être employé dans les modèles entiers de simulation^{commune 15.} Les appariements métal-sur-cartilage montrent l’usure accélérée de cartilage, la perturbation extracellulaire de matrice, et la viabilité diminuée de cellules dans la zone superficielle comparée à un appariement de cartilage-sur-cartilage^16. Les dommages au cartilage se sont produits principalement sous forme de délamination entre les zones superficielles et moyennes^17. Cependant, les mécanismes menant à la dégénérescence de cartilage ne sont pas entièrement compris. Ce protocole fournit une analyse complète de l’activité biosynthétique du cartilage articulaire. Par la détermination de l’activité métabolique et des niveaux d’expression de gène des gènes cataboliques, des indications tôt pour la panne de cartilage pourraient être identifiées. L’avantage des expériences tribologiques in vitro est que les paramètres de chargement peuvent être ajustés pour imiter diverses conditions de chargement.

Par conséquent, le protocole suivant est approprié pour simuler un appariement métal-sur-cartilage, représentant un modèle expérimental d’hémiarthroplastie.

Protocole

1. Préparation de cylindres métalliques

1. Analyser les tiges cylindriques cobalt-chrome-molybdène (CoCrMo) en respectant les spécifications standard s’il s’agit d’implants chirurgicaux pour leur composition chimique à l’aide de microscopie électronique à balayage (SEM) avec spectroscopie radiographique dispersive par protocole du fabricant pour confirmer les valeurs fournies.
   REMARQUE: La composition élémentaire de l’alliage CoCrMo utilisé pour cette expérience est de 65% Co, 28% Cr, 5% Mo et 2% autres.
2. Moudre humidement les échantillons avec du papier de broyage de carbure de silicium commençant par une taille de grain de 500. Utilisez du papier broyeur en ordre croissant jusqu’à concurrence de 4000 grains.
3. Polir le cylindre avec 3 μm et 1 pâte de μm pour atteindre une rugosité de surface qui est dans le niveau de tolérance des exigences de finition de surface pour les implants chirurgicaux métalliques (ISO 5832-12:2019) et les implants de remplacement articulaires totaux et partiels (ISO 21534:2007).
   REMARQUE : La rugosité moyenne de surface est déterminée à l’aide d’un microscope confocal.
4. Couper les tiges CoCrMo (Ø de 6 mm) en cylindres d’une longueur de 10 mm.

2. Récolte de cylindres ostéochondral

1. Utilisez des articulations bovines étouffées d’animaux matures sur le plan squelettique (âgés de 18 à 24 mois au moment du sacrifice) et gardez-les contenues et refroidies jusqu’à la dissection dans les 24 heures suivant le sacrifice.
   REMARQUE : Les joints sont achetés auprès du boucher local. L’articulation reste fermée jusqu’à la dissection.
2. Pour récolter les bouchons ostéochondral cylindriques dans des conditions aseptiques, désinfectez le genou et effectuez une arthrotomie et exposez le condyle fémoral médial.
   REMARQUE : La dissection doit être effectuée avec prudence pour ne pas endommager la surface articulaire.
3. Inspecter la surface articulaire à la recherche de dommages macroscopiques.
   REMARQUE : Jetez l’échantillon si le cartilage n’a pas son aspect blanchâtre, lisse et brillant ou s’il y a des cloques, des fissures ou de plus grands défauts.
4. Alignez le tube de coupe perpendiculairement à la surface articulaire de la zone de port de poids et conduisez l’appareil dans le cartilage et l’os subchondral par des coups fermes avec un marteau. À 15 mm de profondeur de pénétration, tordez l’appareil dans le sens des aiguilles d’une montre avec un mouvement soudain.
5. Retirez l’appareil, insérez le bouton blanc et vissez-le jusqu’à ce que l’extrémité inférieure de la prise ostéochondrale soit visible.
6. Marquer l’orientation antéroposteriore des échantillons avec un marqueur stérile afin d’organiser le cylindre ostéochondral en conséquence pendant les essais.
   REMARQUE : Le réseau tridimensionnel de collagène et son architecture complexe facilitent les propriétés mécaniques uniques du cartilage articulaire et devraient être considérés dans l’orientation des échantillons.
7. Rincer l’échantillon avec de la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) pour laver le sang et les tissus adipeux.
8. Répétez les étapes mentionnées ci-dessus pour récolter le nombre désiré de bouchons ostéochondral (diamètre de 8 mm, longueur de 15 mm).
   REMARQUE : En règle générale, 9 à 12 cylindres ostéochondral peuvent être récoltés à partir de la zone de port de poids sur le condyle fémoral médial.
9. Placez les échantillons dans le milieu modifié de l’Aigle de Dulbecco contenant 10 % de sérum bovin fœtal, complété par des antibiotiques (pénicilline 200 U/mL; streptocycine 0,2 mg/mL) et amphotericine B 2,5 μg/mL et conservez-les à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient testés pour maintenir leur viabilité.
10. Analyser les bouchons ostéochondral de contrôle immédiatement après la récolte pour établir les valeurs de base (voir la section analyse).

3. Tests tribologiques

1. Effectuez les expériences à l’aide d’un tribomètre réciproque disponible dans le commerce avec une configuration cylindre sur plaque. Les exigences de l’appareil sont la charge verticale et la charge réglable et la vitesse de glissement. En outre, une cellule liquide permet d’effectuer les tests dans une solution lubrifiante.
2. Déterminez la pression de contact dans le système CoCrMo-on-cartilage à l’aide d’un film de mesure de pression. Placez le film de mesure de pression à l’interface et appliquez la charge statique pendant 30 s pour déterminer la pression initiale de contact, la taille et la forme de contact. En raison de la convexité du cylindre métallique et du cartilage articulaire, la zone de contact initiale a une forme elliptique dans cette configuration.
   REMARQUE : Le film de mesure de la pression réagit à la pression appliquée montrant la décoloration rouge des zones où la pression du seuil est atteinte ou dépassée. Pour 1 N de charge, la pression de contact a été déterminée autour de 2 MPa par comparaison visuelle avec les pressions de contact définies.
3. Fixez les cylindres ostéochondral sur le support inférieur de l’échantillon avec le marquage aligné avec la direction coulissante, et montez les cylindres CoCrMo sur la cellule de charge supérieure.
4. Ajouter la solution d’essai (PBS avec de l’acide hyaluronique de 3 g/L) dans la cellule liquide, ce qui entraîne la fusion du cylindre ostéochondral et le recouvrement de l’interface coulissante métal-cartilage.
5. Définissez les paramètres d’essai (force normale prescrite, course et vitesse de glissement), qui sont ensuite appliqués et maintenus tout au long de l’essai.
   REMARQUE : La longueur de course du mouvement de réciprocité doit être réglée en fonction de la zone de contact pour créer une zone de contact de migration (MCA). Pour les bouchons de 8 mm de diamètre, un AVC de 2 mm permet une réhydratation adéquate du cartilage.
6. Commencez à glisser réciproquement le cylindre CoCrMo contre le cartilage articulaire immergé dans la solution lubrifiante avec les paramètres de chargement définis.
7. Surveiller le coefficient de frottement (COF) pendant les expériences.
   REMARQUE : Le COF est évalué automatiquement mais peut être calculé à l’aide de l’équation μ=F/W (μ - coefficient de frottement; F - force de frottement; W - charge normale appliquée par le système).
8. Mettre fin à l’expérience après la période de test souhaitée.
9. Retirez le bouchon ostéochondral du porte-échantillon, rincez-le avec du PBS et rangez-le en milieu jusqu’à une analyse biologique plus poussée (voir ci-dessous).
10. Submergez les échantillons de contrôle dans la solution d’essai à température ambiante pendant toute la durée de l’essai et analysez avec des échantillons qui ont été exposés à la charge mécanique.

4. Analyse

NOTE : Le cylindre ostéochondral sont analysés pour l’activité métabolique et l’expression de gène pour étudier l’activité biologique ; l’histologie est exécutée pour étudier l’intégrité de surface de cartilage et la matrice sous-jacente.

1. Histologie
   1. Pour l’analyse histologique, immerger les bouchons ostéochondral dans la solution de formaldéhyde tamponné à 4% à température ambiante jusqu’à ce que le traitement ultérieur.
   2. Rincez les échantillons avec du PBS et placez-les dans un récipient en plastique.
   3. Ajoutez un excès de la solution de décalcifiant prêt à l’emploi afin que tous les échantillons soient couverts.
   4. Appliquer une agitation constante pendant 4 semaines pour une décalcification complète.
   5. Après décalcification, intégrer les échantillons dans des glycols et des résines solubles dans l’eau et les stocker à −80 °C.
   6. Obtenez 6 sections de μm en cryosection transversale à la zone de contact.
   7. Par la suite, préparez les échantillons pour la coloration Safranin O et le contre-coloration Fastgreen à l’aide du protocole d’un fabricant.
   8. Capturez des images histologiques à l’aide d’un microscope et d’un processus à l’aide d’un logiciel de traitement d’imagerie.
2. Activité métabolique
   REMARQUE : L’activité métabolique des chondrocytes dans le cartilage articulaire sont étudiées avec un essai toxicologique ex vivo basé sur XTT.
   1. Rincer le bouchon ostéochondral à l’aide de PBS et placer l’échantillon dans une boîte de Pétri.
   2. Placer une plaque de 24 puits sur une échelle et zéro l’échelle.
   3. Couper le cartilage de la greffe ostéochondrale avec un scalpel en un seul morceau.
   4. Couper le cartilage en deux morceaux égaux de sorte que la zone de contact soit également répartie sur les deux morceaux de cartilage et émincer de moitié à 1 mm³ morceaux. La deuxième moitié est utilisée pour l’analyse de l’expression des gènes.
   5. Transférer le cartilage haché dans un puits de la plaque préparée de 24 puits et déterminer le poids des tissus.
   6. Répétez les étapes mentionnées ci-dessus pour chaque échantillon et ajoutez 1 mL de milieu de croissance à chaque puits de la plaque.
   7. Ajouter la solution XTT (490 μL de réagenage d’étiquetage XTT et 10 μL de réageni d’activation) selon les instructions et le mélange du fabricant.
   8. Incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 4 h.
   9. Après l’incubation, retirer le surnatant et le transférer dans un tube de 5 mL.
   10. Extraire le produit du tétrazolium en ajoutant 0,5 mL de sulfure de diméthyle (DMSO) au tissu cartilagineux de la plaque de 24 puits et appliquer une agitation continue pendant 1 h à température ambiante.
   11. Supprimez la solution DMSO et mutualiser avec la solution XTT précédemment collectée.
   12. Transférer 100 μL de l’échantillon en triplicates dans une plaque de 96 puits sur un lecteur de plaque et mesurer l’absorption à une longueur d’onde de 492 nm et une longueur d’onde de référence à 690 nm.
   13. Normalisez les valeurs d’absorption qui en résultent au poids humide de chaque échantillon et effectuez une analyse à l’aide d’un logiciel.
3. Analyse de l’expression génique
   1. Isolement de l’ARN
      REMARQUE : L’isolement de l’ARN est effectué à l’aide d’un kit commercial(Tableau des matériaux)selon les instructions fournies par le fabricant avec de petites modifications.
      1. Hacher la deuxième moitié du tissu cartilagineux obtenu à partir de la prise ostéochondral en petits morceaux.
      2. Transférez-les dans un tube contenant des perles de céramique et 300 μL de tampon de lyse (contenant 1% β-mercaptoéthanol).
         REMARQUE : Les échantillons peuvent être congelés dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’ils soient traités plus avant.
      3. Décongeler les échantillons pendant 2 min et utiliser le lyser commercial pour l’homogénéisation du tissu. Appliquer 6500 tours pour 20 s (étape d’homogénéisation) quatre fois avec une phase de refroidissement de 2 min après chaque course (à 4 °C à l’aide du dispositif de refroidissement lyser commercial) pour perturber complètement le tissu.
      4. Ajouter 20 μL de proteinase K et 580 μL d’eau sans RNase à chaque tube et les incuber à 55 °C pendant 30 min.
      5. Centrifuger les échantillons pendant 3 min à 10 000 x g et transférer le supernatant dans un tube de 1,5 mL.
      6. Ajouter 0,5 volume d’éthanol à 90 % à chaque tube et mélanger.
      7. Transférer 700 μL de l’échantillon dans une colonne de liaison ARN placée dans un tube de collecte de 2 mL et une centrifugeuse à 8 000 x g pendant 15 s.
      8. Jetez le flow-through et répétez l’étape de centrifugation pour le lysate complet.
      9. Ajouter 350 μL de Buffer RW1 à la colonne, centrifugeuse à 8 000 x g pendant 15 s et jeter le flux.
      10. Mélanger 10 μL de solution de stock DNase et 70 μL de DDR tampon. Ajouter la solution à la membrane de purification de l’ARN et l’incuber à température ambiante pendant 15 min.
      11. Ajouter 350 μL de Buffer RW1 à la colonne et centrifugeuse à 8 000 x g pendant 15 s. Jetez le flux à travers.
      12. Ajouter 500 μL d’EPR tampon et de centrifugeuse à 8 000 x g pendant 15 s. Jetez le flux à travers.
      13. Ajouter 500 μL d’EPR tampon à la colonne de purification de l’ARN et à la centrifugeuse à 8 000 x g pendant 2 min.
      14. Placez la colonne dans un tube de collecte de 1,5 mL et ajoutez 30 μL d’eau sans RNase. Centrifugeuse à 8 000 x g pendant 1 min.
      15. Conserver l’ARN isolé à -80 °C jusqu’à la synthèse de l’ADN.
   2. synthèse cDNA
      REMARQUE : Pour synthétiser l’ADN complémentaire (CDNA) à partir de l’ARN messager (ARNm), un kit commercial (Tableau des matériaux) a été utilisé. L’ARN du bactériophage MS2 a été ajouté pour stabiliser l’ARN isolé pendant la synthèse de l’ADN.
      1. Décongeler et mélanger les reagents. La composition d’une seule réaction est indiquée dans le tableau 1.
      2. Ajouter 16 μL d’échantillon d’ARN au volume pour une seule réaction (14 μL).
      3. Effectuer la synthèse de l’ADN dans un cycleur thermique en utilisant les paramètres suivants : 10 min à 25 °C (annealing d’amorce), 60 min à 50 °C (synthèse de l’ADN), 5 min à 85 °C (dénaturation) et 5 min à 20 °C (phase de refroidissement).
      4. Conserver l’ADNd à -20 °C jusqu’à ce que la réaction quantitative en chaîne quantitative en temps réel de polymése (RT-qPCR).
   3. RT-qPCR (rt-qPCR)
      REMARQUE : Pour le RT-qPCR des échantillons bovins, les amorces et les sondes ont été conçues à l’aide d’un logiciel qPCR commercial en temps réel (p. ex., IDT) pour les gènes GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate de déshydrogénase), COL2A1 (Collagène de type 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Collagène de type 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1) et MMP-13 (Matrix Metalloproteinase-13). Des amorces bovines et des sondes à double étanchéation ont été fournies par IDT. Les reagents utilisés pour une seule réaction pour évaluer l’efficacité et l’expression des gènes sont affichés dans le tableau 2.
      1. Distribuez le mélange principal d’une seule réaction (9 μL) à chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits et ajoutez 1 μL de cDNA à chaque réaction. Effectuez des tests pour chaque échantillon en triplicates.
      2. Fermer la plaque PCR à l’aide d’huile d’étanchéité et de centrifugeuse à 877 x g pendant 10 min à 4 °C.
      3. Effectuez rt-qPCR à l’aide d’un cycleur thermique de précision avec le protocole suivant : 95 °C pendant 10 min, 45 cycles d’amplification (95 °C pour 10 s, annealing pour 30 s, synthèse cDNA) et 37 °C pour 30 s.
         REMARQUE : Des températures d’annelation spécifiques sont requises pour chaque amorce.
      4. Utilisez GAPDH avec les gènes cibles pour confirmer l’efficacité.
      5. Utilisez le logiciel fourni pour calculer l’efficacité de chaque gène.
      6. Normaliser les valeurs du seuil de cycle (CT) à l’expression du gène de référence GAPDH et utiliser la méthode ΔΔCT pour la quantification.

Résultats

La zone de contact et la pression de contact doivent être confirmées à l’aide d’un film de mesure dela pression ( figure 1). L’état physiologique de chargement peut être confirmé en comparant avec des empreintes de référence pour des pressions de contact définies. Pendant les essais, le coefficient de frottement est surveillé en permanence. Avec une zone de contact migrante, un faible coefficient de frottement peut être maintenu pendant au moins 1 h (fig...

Discussion

Les implants métalliques focaux représentent une procédure de récupération pour des défauts osteochondral, particulièrement dans les patients entre deux âges et après traitement primaire échoué. Bien que les études cliniques aient démontré des résultats prometteurs à court terme, une complication observée est dommages au cartilage indigène opposé^10. Les études cadavériques et biomécaniques montrent clairement que l’implantation correcte avec un positionnement plat ou légè...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma?Aldrich Chemie GmbH	A-2942-100ML
buffered formaldehyde solution 4%	VWR	97131000
Cell Proliferation Kit II (XTT)	Roche Diagnostics	11465015001	XTT-based ex vivo toxicology assay
CoCrMo raw material	Acnis International		CoCrMo rods 6mm in diameter
CryoStar NX70 Cryostat	Thermo Fischer Scientific		cryosectioning device
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sidma-Aldrich Chemie	D 2438-10ML
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Sigma?Aldrich Chemie GmbH		medium
fetal bovine serum	Gibco
Hyaluronic acid	Anika Therapeutics Inc.		component of lubricating solution
iCycler	BioRad		thermal cycler
Leica microscope DM?1000	Leica		microscope for histology
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche Diagnostics
LightCycler 96	Roche Diagnostics		thermal cycler for PCR
MagNA Lyser Green Beads	Roche Diagnostics	3358941001
Osteochondral Autograft Transfer System (OATS)	Arthrex Inc.		cutting tube for harvesting osteochondral cylinders
osteosoft	Merck	1017279010	decalcifier-solution
Penicillin /Streptomycin	Sigma?Aldrich Chemie GmbH	P4333-100ML
phosphate?buffered saline	Sigma?Aldrich Chemie GmbH		PBS
Prescale Low Pressure	Fujifilm		pressure indicating film
RNeasy Fibrous Tissue Kit	QIAGEN	74404
Synergy 2	BioTek Instruments		plate reader
Tetra?Falex MUST	Falex Tribology		Tribometer
Tissue? Tek O.C.T.	SAKURA	4583	embedding formulation
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche Diagnostics	40897030001
β-mercaptoethanol	Sidma-Aldrich Chemie	M3148