Test biotribologici e analisi della cartilagine articolare scivolando contro il metallo per impianti

Riepilogo

Questo protocollo descrive la preparazione, i test biotribologici e l'analisi dei cilindri osteocondriali che scivolano contro il materiale implantare metallico. Le misure di risultato incluse in questo protocollo sono l'attività metabolica, l'espressione genica e l'istologia.

Abstract

I difetti osteocondrali nei pazienti di mezza età potrebbero essere trattati con impianti metallici focali. Sviluppati per la prima volta per difetti nell'articolazione del ginocchio, gli impianti sono ora disponibili per la spalla, l'anca, la caviglia e la prima articolazione metatarsalfalangeale. Pur fornendo riduzione del dolore e miglioramento clinico, in molti pazienti si osservano cambiamenti degenerativi progressivi della cartilagine opposta. I meccanismi che portano a questo danno non sono pienamente compresi. Questo protocollo descrive un esperimento tribologico per simulare un accoppiamento metallo su cartilagine e un'analisi completa della cartilagine articolare. Il materiale implantare metallico viene testato contro i cilindri osteocondriali bovini come modello per la cartilagine articolare umana. Applicando carichi diversi e velocità di scorrimento, le condizioni fisiologiche di carico possono essere imitate. Per fornire un'analisi completa degli effetti sulla cartilagine articolare, l'istologia, l'attività metabolica e l'analisi dell'espressione genica sono descritti in questo protocollo. Il principale vantaggio dei test tribologici è che i parametri di carico possono essere regolati liberamente per simulare condizioni in vivo. Inoltre, potrebbero essere utilizzate diverse soluzioni di prova per indagare l'influenza della lubrificazione o degli agenti pro-infiammatori. Utilizzando l'analisi dell'espressione genica per geni specifici della cartilagine e geni catabolici, potrebbero essere rilevati primi cambiamenti nel metabolismo dei condrociti articolari in risposta al carico meccanico.

Introduzione

Il trattamento dei difetti osteocondrali è impegnativo e richiede un intervento chirurgico in molti casi. Per le lesioni osteocondrali focali nei pazienti di mezza età, gli impianti metallici focali sono un'opzione praticabile, specialmente dopo il fallimento del trattamento primario, come la stimolazione del midollo osseo (BMS) o l'impianto di condrociti autologi (ACI)¹. Le sostituzioni parziali della superficie possono essere considerate procedure di recupero che possono ridurre il dolore e migliorare la gamma di^{movimento 2}. Questi impianti sono tipicamente composti da una lega CoCrMo e sono disponibili in diverse dimensioni e configurazioni offset per adattarsi alla normale anatomia³. Sebbene inizialmente sviluppati per difetti sul condilo femorale mediale nel ginocchio, tali impianti sono ora disponibili e in uso per l'anca, la caviglia, la spalla e il^{gomito 4,5,6}. Per un risultato soddisfacente, è fondamentale valutare l'allineamento meccanico delle articolazioni e le condizioni della cartilagine opposta. Inoltre, l'impianto corretto senza sporgenza dell'impianto ha dimostrato di essere fondamentale⁷.

Studi clinici hanno dimostrato eccellenti risultati a breve termine in termini di riduzione del dolore e miglioramento della funzione nei pazienti di mezza età per varie^{località5,6,8}. Rispetto all'impianto di allografto, gli impianti metallici focali consentono il cuscinetto di peso precoce. Tuttavia, la cartilagine articolare opposta ha mostrato un'usura accelerata in un numero^{considerevole di pazienti 9,10}. Quindi, anche con un corretto posizionamento, in molti casi la degenerazione della cartilagine nativa sembra inevitabile, mentre i meccanismi sottostanti rimangono poco chiari. Simili cambiamenti degenerativi sono stati osservati dopo l'emiartroplastica bipolare dell'anca¹¹ e sono aumentati con l'attività e il^{carico 12}.

Gli esperimenti tribologici offrono la possibilità di studiare tali accoppiamenti in vitro e simulare diverse situazioni di carico che si verificano in condizioni fisiologiche¹³. L'uso di perni osteocondrali offre un semplice modello geometrico per indagare la tribologia della cartilagine articolare che scivola contro la cartilagine nativa^{o qualsiasi materiale implantare 14} e potrebbe essere ulteriormente utilizzato in interi modelli di simulazione^{articolare 15}. Gli abbinamenti metallo su cartilagine mostrano un'usura accelerata della cartilagine, disturbi della matrice extracellulare e una ridotta vitalità cellulare nella zona superficiale rispetto a un accoppiamento cartilagineo-cartilagine¹⁶. Danni alla cartilagine si sono verificati principalmente sotto forma di delaminazione tra le zone superficiali e centrali¹⁷. Tuttavia, i meccanismi che portano alla degenerazione della cartilagine non sono pienamente compresi. Questo protocollo fornisce un'analisi completa dell'attività biosintetica della cartilagine articolare. Con la determinazione dell'attività metabolica e dei livelli di espressione genica dei geni catabolici, potrebbero essere identificate le prime indicazioni per la rottura della cartilagine. Il vantaggio degli esperimenti tribologici in vitro è che i parametri di carico possono essere regolati per imitare varie condizioni di carico.

Pertanto, il seguente protocollo è adatto per simulare un accoppiamento metallo su cartilagine, che rappresenta un modello sperimentale di emiartroplastica.

Protocollo

1. Preparazione di cilindri metallici

1. Analizza le aste cilindriche cobalto-cromo-molibdeno (CoCrMo) che soddisfano le specifiche standard per gli impianti chirurgici per la loro composizione chimica utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) con spettroscopia a raggi X dispersiva di energia per protocollo del produttore per confermare i valori forniti.
   NOTA: La composizione elementare della lega CoCrMo utilizzata per questo esperimento è 65% Co, 28% Cr, 5% Mo e 2% altri.
2. Macinare a umido i campioni con carta da macinazione in carburo di silicio a partire da una granulometria di 500. Utilizzare carta da macinazione in ordine crescente fino a una granulometria di 4000.
3. Lucidare il cilindro con pasta da 3 μm e 1 μm per ottenere una rugosità superficiale che rientra nel livello di tolleranza dei requisiti di finitura superficiale per gli impianti chirurgici metallici (ISO 5832-12:2019) e impianti di sostituzione totale e parziale delle articolazioni (ISO 21534:2007).
   NOTA: La rugosità media della superficie viene determinata utilizzando un microscopio confocale.
4. Tagliare le aste CoCrMo (Ø di 6 mm) ai cilindri con una lunghezza di 10 mm.

2. Raccolta di cilindri osteocondrali

1. Utilizzare le articolazioni soffocanti dei bovini di animali maturi skeletally (di età compresa tra 18 e 24 mesi al momento del sacrificio) e conservarle contenute e raffreddate fino alla dissezione entro 24 ore dal sacrificio.
   NOTA: I giunti vengono acquistati dal macellaio locale. Il giunto rimane chiuso fino alla dissezione.
2. Per raccogliere tappi osteocondrali cilindrici in condizioni asettiche, disinfettare il ginocchio ed eseguire un'artrotomia ed esporre il condilo femorale mediale.
   NOTA: La dissezione deve essere eseguita con cautela per non danneggiare la superficie articolare.
3. Ispezionare la superficie articolare alla ricerca di danni macroscopici.
   NOTA: Scartare il campione se la cartilagine manca del suo aspetto biancastro, liscio e lucido o se c'è vesciche, fessure o difetti più grandi.
4. Allineare il tubo di taglio perpendicolare alla superficie articolare dell'area portante e guidare il dispositivo nella cartilagine e nell'osso subcondrale con colpi sodi con un martello. A una profondità di penetrazione di 15 mm, ruotare il dispositivo in senso orario con un movimento improvviso.
5. Rimuovere il dispositivo, inserire la manopola bianca e avvitarla fino a quando non è visibile l'estremità inferiore della spina osteocondrale.
6. Contrassegnare l'orientamento anteroposterior dei campioni con un marcatore sterile al fine di disporre di conseguenza il cilindro osteocondrale durante il test.
   NOTA: La rete tridimensionale di collagene e la sua complessa architettura facilitano le proprietà meccaniche uniche della cartilagine articolare e devono essere considerate nell'orientamento dei campioni.
7. Risciacquare il campione con soluzione salina tamponata da fosfati (PBS) per lavare via sangue e tessuto adiposo.
8. Ripetere i passaggi sopra menzionati per raccogliere il numero desiderato di spine osteocondrali (8 mm di diametro, 15 mm di lunghezza).
   NOTA: In genere, da 9 a 12 cilindri osteocondriali possono essere raccolti dall'area portante del peso sul condilo femorale mediale.
9. Posizionare i campioni nel mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale, integrato con antibiotici (penicillina 200 U/mL; streptomicina 0,2 mg/mL) e anfotericina B 2,5 μg/mL e conservarli a 4 °C fino alle prove per mantenere la vitalità.
10. Analizzare le spine osteocondrali di controllo immediatamente dopo la raccolta per stabilire i valori di base (vedere la sezione di analisi).

3. Prove tribologicalhe

1. Eseguire gli esperimenti utilizzando un tribometro alternativo disponibile in commercio con una configurazione cilindro su piastra. I requisiti per il dispositivo sono il carico verticale e il carico regolabile e la velocità di scorrimento. Inoltre, una cella liquida consente di eseguire i test in una soluzione lubrificante.
2. Determinare la pressione di contatto nel sistema CoCrMo-on-cartilage utilizzando una pellicola di misurazione della pressione. Posizionare la pellicola di misurazione della pressione sull'interfaccia e applicare il carico statico per 30 s per determinare la pressione di contatto iniziale, le dimensioni e la forma del contatto. A causa della convessità del cilindro metallico e della cartilagine articolare, l'area di contatto iniziale ha una forma ellittica in questa configurazione.
   NOTA: La pellicola di misurazione della pressione reagisce alla pressione applicata mostrando lo scolorimento rosso delle zone in cui la pressione di soglia viene raggiunta o superata. Per 1 N di carico, la pressione di contatto è stata determinata intorno a 2 MPa mediante confronto visivo con pressioni di contatto definite.
3. Fissare i cilindri osteocondriali sul supporto del campione inferiore con la marcatura allineata con la direzione di scorrimento e montare i cilindri CoCrMo sulla cella di carico superiore.
4. Aggiungere la soluzione di prova (PBS con acido ialuronico 3 g/L) nella cella liquida che si traduce nell'immersione del cilindro osteocondrale e nella copertura dell'interfaccia scorrevole metallo-cartilaginea.
5. Impostare i parametri di prova (forza normale prescritta, corsa e velocità di scorrimento), che vengono quindi applicati e mantenuti durante la prova.
   NOTA: la lunghezza del tratto del movimento alternativo deve essere impostata in base all'area di contatto per creare un'area di contatto migratoria (MCA). Per spine di 8 mm di diametro, una corsa di 2 mm consente un'adeguata reidratazione della cartilagine.
6. Avviare lo scorrimento reciproco del cilindro CoCrMo contro la cartilagine articolare immersa nella soluzione lubrificante con i parametri di carico impostati.
7. Monitorare il coefficiente di attrito (COF) durante gli esperimenti.
   NOTA: Il COF viene valutato automaticamente ma può essere calcolato usando l'equazione μ=F/W (μ - coefficiente di attrito; F - forza di attrito; W - carico normale applicato dal sistema).
8. Terminare l'esperimento dopo il periodo di test desiderato.
9. Rimuovere la spina osteocondrale dal portacampioni, sciacquarla con PBS e conservarla in mezzo fino a ulteriori analisi biologiche (vedi sotto).
10. Immergere i campioni di controllo nella soluzione di prova a temperatura ambiente per tutta la durata del test e analizzare insieme a campioni che sono stati esposti al carico meccanico.

4. Analisi

NOTA: Il cilindro osteocondrale viene analizzato per l'attività metabolica e l'espressione genica per indagare l'attività biologica; l'istologia viene eseguita per studiare l'integrità della superficie della cartilagine e la matrice sottostante.

1. Istologia
   1. Per l'analisi istologica, immergere le spine osteocondrali in una soluzione di formaldeide tamponata al 4% a temperatura ambiente fino a un'ulteriore lavorazione.
   2. Risciacquare i campioni con PBS e metterli in un recipiente di plastica.
   3. Aggiungere un eccesso della soluzione decalcificatore pronta all'uso in modo che tutti i campioni siano coperti.
   4. Applicare agitazione costante per 4 settimane per la completa decalcificazione.
   5. Dopo la decalcificazione, incorporare i campioni in glicoli solubili in acqua e resine e conservarli a -80 °C.
   6. Ottenere sezioni da 6 μm criosezione trasversale all'area di contatto.
   7. Successivamente, preparare i campioni per la colorazione Safranin O e la controsofferta Fastgreen utilizzando il protocollo di un produttore.
   8. Acquisire immagini istologiche utilizzando un microscopio e un processo utilizzando il software di elaborazione delle immagini.
2. Attività metabolica
   NOTA: L'attività metabolica dei condrociti nella cartilagine articolare viene studiata con un saggio tossicologico ex vivo a base di XTT.
   1. Risciacquare la spina osteocondrale utilizzando PBS e posizionare il campione in una piastra di Petri.
   2. Posizionare una piastra di 24 pozze di pozzo su una scala e azzerare la scala.
   3. Tagliare la cartilagine dall'innesto osteocondrale con un bisturi in un unico pezzo.
   4. Bisect la cartilagine in due pezzi uguali in modo che l'area di contatto sia equamente distribuita su entrambi i pezzi di cartilagine e tritare da metà a 1 mm³ pezzi. La seconda metà è usata per l'analisi dell'espressione genica.
   5. Trasferire la cartilagine tritata in un pozzo della piastra preparata a 24 pozzetti e determinare il peso del tessuto.
   6. Ripetere i passaggi sopra menzionati per ogni campione e aggiungere 1 mL di mezzo di crescita ad ogni pozzo della piastra.
   7. Aggiungere la soluzione XTT (490 μL di reagente di etichettatura XTT e 10 μL di reagente di attivazione) secondo le istruzioni e la miscela del produttore.
   8. Incubare la piastra a 37 °C e 5% CO₂ per 4 ore.
   9. Dopo l'incubazione, rimuovere il supernatante e trasferirlo in un tubo da 5 ml.
   10. Estrarre il prodotto tetrazolico aggiungendo 0,5 mL di dimetil solfossido (DMSO) al tessuto cartilagineo nella piastra da 24 po' e applicare un'agitazione continua per 1 h a temperatura ambiente.
   11. Rimuovere la soluzione DMSO e raggrupparla con la soluzione XTT raccolta in precedenza.
   12. Trasferire 100 μL del campione in triplicati in una piastra da 96 po' su un lettore di piastre e misurare l'assorbanza ad una lunghezza d'onda di 492 nm e una lunghezza d'onda di riferimento a 690 nm.
   13. Normalizzare i valori di assorbanza risultanti al peso umido di ogni campione ed eseguire analisi utilizzando il software.
3. Analisi dell'espressione genica
   1. Isolamento dell'RNA
      NOTA: L'isolamento dell'RNA viene effettuato utilizzando un kit commerciale(Tabella dei materiali)secondo le istruzioni fornite dal produttore con piccole modifiche.
      1. Tritare la seconda metà del tessuto cartilagineo ottenuto dalla spina osteocondrale in piccoli pezzi.
      2. Trasferirli in un tubo contenente perline di ceramica e 300 μL di Lysis Buffer (contenente l'1% β-mercaptoetanolo).
         NOTA: I campioni possono essere congelati in azoto liquido fino a un'ulteriore lavorazione.
      3. Scongelare i campioni per 2 minuti e utilizzare il liscime commerciale per l'omogeneizzazione del tessuto. Applicare 6500 giri/min per 20 s (fase di omogeneizzazione) quattro volte con una fase di raffreddamento di 2 minuti dopo ogni corsa (a 4 °C utilizzando il dispositivo di raffreddamento del liscigatore commerciale) per interrompere completamente il tessuto.
      4. Aggiungere 20 μL di proteinasi K e 580 μL di acqua priva di RNasi ad ogni tubo e incubarli a 55 °C per 30 min.
      5. Centrifugare i campioni per 3 minuti a 10.000 x g e trasferire il supernatante in un tubo da 1,5 ml.
      6. Aggiungere 0,5 volumi di etanolo al 90% ad ogni tubo e mescolare.
      7. Trasferire 700 μL del campione in una colonna di legame RNA posta in un tubo di raccolta da 2 ml e centrifugare a 8.000 x g per 15 s.
      8. Scartare il flusso e ripetere il passaggio di centrifugazione per il lisato completo.
      9. Aggiungere 350 μL di Buffer RW1 alla colonna, centrifugare a 8.000 x g per 15 s e scartare il flusso.
      10. Mescolare 10 μL di soluzione stock di DNasi e 70 μL di Buffer RDD. Aggiungere la soluzione alla membrana di purificazione dell'RNA e incubarla a temperatura ambiente per 15 minuti.
      11. Aggiungere 350 μL di Buffer RW1 alla colonna e centrifugare a 8.000 x g per 15 s. Scartare il flusso.
      12. Aggiungere 500 μL di Tampone RPE e centrifuga a 8.000 x g per 15 s. Scartare il flusso.
      13. Aggiungere 500 μL di Buffer RPE alla colonna di purificazione dell'RNA e centrifugare a 8.000 x g per 2 min.
      14. Posizionare la colonna in un tubo di raccolta da 1,5 ml e aggiungere 30 μL di acqua priva di RNasi. Centrifuga a 8.000 x g per 1 min.
      15. Conservare l'RNA isolato a -80 °C fino alla sintesi del cDNA.
   2. sintesi cDNA
      NOTA: Per sintetizzare dna complementare (cDNA) dall'RNA messaggero (mRNA) è stato utilizzato un kit commerciale (Table of Materials). L'RNA del batteriofago MS2 è stato aggiunto per stabilizzare l'RNA isolato durante la sintesi del cDNA.
      1. Scongelare e mescolare i reagenti. La composizione per una singola reazione è illustrata nella tabella 1.
      2. Aggiungere 16 μL di campione di RNA al volume per una singola reazione (14 μL).
      3. Eseguire la sintesi di cDNA in un ciclore termico utilizzando i seguenti parametri: 10 min a 25 °C (ricottura del primer), 60 min a 50 °C (sintesi del DNA), 5 min a 85 °C (denaturazione) e 5 min a 20 °C (fase di raffreddamento).
      4. Conservare cDNA a -20 °C fino alla reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (RT-qPCR).
   3. RT-qPCR
      NOTA: Per RT-qPCR di campioni bovini, primer e sonde sono stati progettati utilizzando software qPCR commerciale in tempo reale (ad es. IDT) per i geni GAPDH (Gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi), COL2A1 (Collagene tipo 2), ACAN (Aggrecan), COL1A1 (Collagene tipo 1), MMP-1 (Matrix Metalloproteinasi-1) e MMP-13 (Matrix Metalloproteinasi-13). I primer bovini e le sonde doppie tempra sono stati forniti dall'IDT. I reagenti utilizzati per una singola reazione per valutare l'efficienza e l'espressione genica sono esposti nella tabella 2.
      1. Distribuire la miscela principale di una singola reazione (9 μL) ad ogni pozzo di una piastra PCR da 96 po 'e aggiungere 1 μL di cDNA ad ogni reazione. Eseguire test per ogni campione in triplicati.
      2. Chiudere la piastra PCR utilizzando olio di tenuta e centrifuga a 877 x g per 10 min a 4 °C.
      3. Eseguire RT-qPCR utilizzando un ciclore termico di precisione con il seguente protocollo: 95 °C per 10 min, 45 cicli di amplificazione (95 °C per 10 s, ricottura per 30 s, sintesi cDNA) e 37 °C per 30 s.
         NOTA: Sono necessarie temperature di ricottura specifiche per ogni primer.
      4. Utilizzare GAPDH insieme ai geni bersaglio per confermare l'efficienza.
      5. Utilizzare il software fornito per calcolare l'efficienza di ogni gene.
      6. Normalizzare i valori della soglia di ciclo (CT) all'espressione del gene di riferimento GAPDH e utilizzare il metodo ΔΔCT per la quantificazione.

Risultati

L'area di contatto e la pressione di contatto devono essere confermate utilizzando una pellicola di misurazione della pressione (Figura 1). Le condizioni fisiologiche di carico possono essere confermate confrontandole con le impronte di riferimento per pressioni di contatto definite. Durante il test, il coefficiente di attrito viene monitorato costantemente. Con un'area di contatto migratoria, è possibile mantenere un basso coefficiente di attrito per almeno 1 h (Figura...

Discussione

Gli impianti metallici focali rappresentano una procedura di recupero per difetti osteocondrali, specialmente nei pazienti di mezza età e dopo un trattamento primario fallito. Sebbene gli studi clinici hanno dimostrato risultati promettenti a breve termine, una complicanza osservata è il danno alla cartilagine nativa^{opposta 10}. Studi catastali e biomeccanici mostrano chiare prove che un corretto impianto con posizionamento piatto o leggermente incassato mantiene pressioni di contatto naturali

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma?Aldrich Chemie GmbH	A-2942-100ML
buffered formaldehyde solution 4%	VWR	97131000
Cell Proliferation Kit II (XTT)	Roche Diagnostics	11465015001	XTT-based ex vivo toxicology assay
CoCrMo raw material	Acnis International		CoCrMo rods 6mm in diameter
CryoStar NX70 Cryostat	Thermo Fischer Scientific		cryosectioning device
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sidma-Aldrich Chemie	D 2438-10ML
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Sigma?Aldrich Chemie GmbH		medium
fetal bovine serum	Gibco
Hyaluronic acid	Anika Therapeutics Inc.		component of lubricating solution
iCycler	BioRad		thermal cycler
Leica microscope DM?1000	Leica		microscope for histology
LightCycler 480 Sealing Foil	Roche Diagnostics
LightCycler 96	Roche Diagnostics		thermal cycler for PCR
MagNA Lyser Green Beads	Roche Diagnostics	3358941001
Osteochondral Autograft Transfer System (OATS)	Arthrex Inc.		cutting tube for harvesting osteochondral cylinders
osteosoft	Merck	1017279010	decalcifier-solution
Penicillin /Streptomycin	Sigma?Aldrich Chemie GmbH	P4333-100ML
phosphate?buffered saline	Sigma?Aldrich Chemie GmbH		PBS
Prescale Low Pressure	Fujifilm		pressure indicating film
RNeasy Fibrous Tissue Kit	QIAGEN	74404
Synergy 2	BioTek Instruments		plate reader
Tetra?Falex MUST	Falex Tribology		Tribometer
Tissue? Tek O.C.T.	SAKURA	4583	embedding formulation
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche Diagnostics	40897030001
β-mercaptoethanol	Sidma-Aldrich Chemie	M3148