Huellas dactilares cromatográficas por coincidencia de plantillas para los datos recopilados por cromatografía de gases bidimensional integral

Resumen

Este protocolo presenta un enfoque para la huella digital y explorar los datos multidimensionales recogidos por la cromatografía de gases bidimensional integral acoplada a la espectrometría de masas. Los algoritmos de reconocimiento de patrones dedicados (coincidencia de plantillas) se aplican para explorar la información química cifrada en la fracción volátil del aceite de oliva virgen extra (es decir, volatilome).

Resumen

El procesamiento y la evaluación de datos son pasos críticos de la cromatografía de gases bidimensional integral (GCxGC), particularmente cuando se acoplan a la espectrometría de masas. La rica información cifrada en los datos puede ser muy valiosa pero difícil de acceder de manera eficiente. La densidad y complejidad de los datos pueden conducir a largos tiempos de elaboración y requerir procedimientos laboriosos y dependientes de los analistas. Por lo tanto, las herramientas de procesamiento de datos eficaces pero accesibles son clave para permitir la difusión y aceptación de esta técnica multidimensional avanzada en los laboratorios para su uso diario. El protocolo de análisis de datos presentado en este trabajo utiliza huellas dactilares cromatográficas y coincidencia de plantillas para lograr el objetivo de la deconstrucción altamente automatizada de cromatogramas bidimensionales complejos en características químicas individuales para el reconocimiento avanzado de patrones informativos dentro de cromatogramas individuales y a través de conjuntos de cromatogramas. El protocolo ofrece alta consistencia y confiabilidad con poca intervención. Al mismo tiempo, la supervisión de analistas es posible en una variedad de entornos y funciones de restricción que se pueden personalizar para proporcionar flexibilidad y capacidad para adaptarse a diferentes necesidades y objetivos. La coincidencia de plantillas se muestra aquí como un enfoque poderoso para explorar extra-virgin Volatilome de aceite de oliva. La alineación cruzada de picos se realiza no solo para objetivos conocidos, sino también para compuestos no segmentados, lo que aumenta significativamente el poder de caracterización para una amplia gama de aplicaciones. Se presentan ejemplos para evidenciar el desempeño para la clasificación y comparación de patrones cromatográficos de conjuntos de muestras analizados en condiciones similares.

Introducción

La cromatografía de gases bidimensional integral combinada con la detección espectrométrica de masas en tiempo de vuelo (GC×GC-TOF MS) es hoy en día el enfoque analítico más informativo para la caracterización química de muestras complejas^1,2,3,4,5. En GC×GC, las columnas están conectadas en serie e interconectadas por un modulador (por ejemplo, una interfaz de enfoque térmica o basada en válvulas) que atrapa los componentes de eluting de la primera dimensión⁽¹D) columna antes de su reinyección en la segunda dimensión⁽²D) columna. Esta operación se realiza dentro de un período de tiempo de modulación fija(P_M),que generalmente oscila entre 0,5–8 s. Mediante la modulación térmica, el proceso incluye la crio-captura y el enfoque de la banda de eluting con algunos beneficios para la potencia de separación general.

Aunque GC×GC es una técnica de separación bidimensional, el proceso produce valores de datos secuenciales. El convertidor analógico a digital (A/D) del detector obtiene la salida de la señal cromatográfica a una frecuencia determinada. Luego, los datos se almacenan en formatos propietarios específicos que no solo contienen los datos digitalizados, sino también los metadatos relacionados (información sobre los datos). El convertidor A/D empleado en los sistemas GC×GC ayuda a mapear la intensidad de la señal cromatográfica a un número digital (DN) en función del tiempo en las dos dimensiones analíticas. Los detectores de un solo canal (por ejemplo, detector de ionización de llama (FID), detector de captura de electrones (ECD), detector de quimioluminiscencia de azufre (SCD), etc.) producen valores únicos por tiempo de muestreo, mientras que los detectores multicanal (por ejemplo, detector espectrométrico de masas (MS)) producen múltiples valores (normalmente, en un rango espectral) por tiempo de muestreo a lo largo del ciclo analítico.

Para visualizar datos ^2D,la elaboración comienza con la rasterización de un solo período de modulación (o ciclo) valores de datos como una columna de píxeles (elementos de imagen correspondientes a eventos del detector). A lo largo de la ordenada (eje Y, de abajo a arriba) se visualiza el tiempo de separación ^2D. Las columnas de píxeles se procesan secuencialmente para que la abscisa (eje X, de izquierda a derecha) informe de un tiempo de separación ^1D. Esta ordenación presenta los datos ^2Den un sistema de coordenadas cartesianas diestro, con el ordinal de retención ^1Dcomo primer índice en la matriz.

El procesamiento de datos de cromatogramas ^2Dda acceso a un nivel de información más alto que los datos sin procesar, lo que permite la detección de picos ^2D,la identificación de picos, la extracción de datos de respuesta para análisis cuantitativos y análisis comparativos cruzados.

Los patrones de pico ^2Dse pueden tratar como la huella digital única de la muestra y los compuestos detectados como características de minucias para un análisis comparativo cruzado efectivo. Este enfoque, conocido como huellas dactilares basadas en plantillas^6,7,se inspiró en las huellas dactilares biométricas^6. Los sistemas automáticos de verificación biométrica de huellas dactilares, de hecho, se basan en características únicas de la yema de los dedos: bifurcaciones y terminaciones de crestas, localizadas y extraídas de impresiones entintada o imágenes detalladas. Estas características, denominadas características de minucias, se cruzan con las plantillas almacenadas disponibles^8,9.

Como se mencionó anteriormente, cada patrón de separación GC×GC se compone de picos ^2Ddistribuidos racionalmente en un plano bidimensional. Cada pico corresponde a un solo anallito, tiene su potencial informativo y se puede tratar como una sola característica para el análisis comparativo de patrones.

Aquí, presentamos un enfoque eficaz para la huella química por GC×GC-TOF MS con ionización en tándem. El objetivo es catalogar de forma exhaustiva y cuantitativa las características de un conjunto de cromatogramas.

En comparación con el software comercial existente o las rutinas internas^10,11 que emplean un enfoque de características máximas, la huella digital basada en plantillas se caracteriza por una alta especificidad, eficiencia y tiempo computacional limitado. Además, tiene una flexibilidad intrínseca que permite la alineación cruzada de características de minucias (es decir, picos ^2D)entre cromatogramas gravemente desalineados como los adquiridos por diferentes instrumentaciones o en estudios de marco de largo plazo^12,13,14.

Las operaciones básicas del método propuesto se describen brevemente para guiar al lector a una buena comprensión de la complejidad del patrón ^2Dy la potencia de la información. Luego, al explorar la matriz de datos de salida del instrumento, se realiza la identificación química y se conocen analitos dirigidos ubicados sobre el espacio bidimensional. La plantilla de picos dirigidos se construye y se aplica a una serie de cromatogramas adquiridos dentro del mismo lote analítico. Los metadatos relacionados con los tiempos de retención, las firmas espectrales y las respuestas (absolutas y relativas) se extraen de patrones re-alineados de picos específicos y se adoptan para revelar diferencias de composición en el conjunto de muestras.

Como un paso adicional y único del proceso, también se realiza una huella digital combinada no dirigida y dirigida (UT) en cromatogramas pre-dirigidos para extender el potencial de huellas dactilares a analitos conocidos y desconocidos. El proceso produce una plantilla de UT para un análisis comparativo verdaderamente completo que se puede automatizar en gran medida.

Como paso final, el método realiza la alineación cruzada de características en dos señales de detectores paralelos producidas con altas y bajas energías de ionización de electrones (70 y 12 eV).

El protocolo es bastante flexible en el apoyo a análisis de un solo cromatograma o un conjunto de cromatogramas y con cromatografía variable y/o múltiples detectores. Aquí, el protocolo se demuestra con una suite de software GC×GC disponible comercialmente (consulte tabla de materiales)combinada con una biblioteca de MS y un software de búsqueda (consulte tabla de materiales). Algunas de las herramientas necesarias están disponibles en otro software y herramientas similares podrían implementarse independientemente de las descripciones en la literatura de Reichenbach y sus compañeros de trabajo^{15,16,17,18,19.} Los datos brutos para la demostración se derivan de un estudio de investigación sobre aceite de oliva virgen extra (EVO) realizado en el laboratorio de los autores¹⁴. En particular, la fracción volátil (es decir, volatilome) de los aceites EVO italianos es muestreada por microextracción de fase sólida del espacio de cabeza (HS-SPME) y analizada por GC×GC-TOF MS para capturar huellas dactilares de diagnóstico para la calidad y calificación sensorial de las muestras. Los detalles sobre las muestras, las condiciones de muestreo y la configuración analítica se proporcionan en la Tabla de materiales.

Los pasos 1 a 6 describen el preprocesamiento de los cromatogramas. Los pasos 7 a 9 describen el procesamiento y análisis de cromatogramas individuales. Los pasos 10 a 12 describen la creación y la coincidencia de plantillas, que son la base para el análisis de muestras cruzadas. Los pasos 13 a 16 describen la aplicación del protocolo a través de un conjunto de cromatogramas, con los pasos 14 a 16 para el análisis ut.

Protocolo

1. Importación de datos sin procesar

NOTA: Esto crea una matriz ráster bidimensional para la visualización y el procesamiento.

1. Inicie el software de imagen.
2. Seleccionar | de archivo Importar; navegue y elija el archivo de datos sin procesar adquirido por el sistema GC×GC-TOF MS llamado "VIOLIN 101.lsc"(Archivo suplementario 1); a continuación, haga clic en Abrir. El cromatograma se abre en este software.
   Nota : formato de archivo de datos sin procesar depende del fabricante del instrumento. El software importa una variedad de formatos de archivo enumerados en la guía del usuario.
3. En el cuadro de diálogo Importar, establezca el Período de modulación(P_M) en 3,5 s; a continuación, haga clic en Aceptar.
   Nota : algunos software de adquisición no pueden registrar el período de modulación.
4. Seleccionar | de archivo Guardar imagen como; vaya a la carpeta deseada; introduzca el nombre "Aceite 1 RAW.gci" (Archivo Suplementario 2); a continuación, haga clic en Guardar.

2. Cambio de la fase de modulación

NOTA: Esto pone todos los picos en cada ciclo de modulación en la misma columna de imagen, incluyendo los picos que envuelven alrededor del final del período de modulación en el tiempo de vacío del siguiente período de modulación²⁰.

1. Seleccionar | de procesamiento Fase de desplazamiento.
2. En el cuadro de diálogo Fase de desplazamiento, establezca la Cantidad de desplazamiento en -0,8 s; a continuación, haga clic en Aceptar.

3. Corrección de referencia²¹

1. Seleccionar | gráfico Dibujar rectángulo.
2. Haga clic y arrastre para dibujar un rectángulo en la imagen donde no se detecten picos.
3. Seleccionar herramientas | Visualizar datos; tenga en cuenta la media y la desviación estándar de la señal del detector, aquí, 21.850 ± 1.455 SD número digital sin unidad (DN); a continuación, cierre la herramienta.
4. Seleccionar | de procesamiento Línea base correcta.

4. Colorear la imagen cromatográfica usando un mapa de valor y un mapa de color²⁰

1. Seleccionar | Ver Colorear.
2. En el cuadro de diálogo Colorear, seleccione la ficha Importar/Exportar; seleccione el mapa de color personalizado #AAAA (Archivo suplementario 3) proporcionado como material complementario; a continuación, haga clic en Importar.
3. En los controles Asignación de valores, establezca el intervalo de valores en los valores mínimo y máximo; a continuación, haga clic en Aceptar.

5. Detección de picos ²D (es decir, blobs) para analitos¹⁸

1. Seleccionar | de procesamiento Detectar blobs con la configuración predeterminada; luego, observe que algunos picos están divididos y hay detecciones espurias.
2. Seleccione Configurar | Configuración | Detección de blobs; a continuación, establezca Suavizado en 0,1 para la primera dimensión y 2,0 para la segunda dimensión y establezca Volumen mínimo (es decir, umbral para los valores sumados) en 1,00 E6; a continuación, haga clic en Aceptar.
3. Seleccionar | de procesamiento Detectar blobs con la nueva configuración; a continuación, observe las mejoras.

6. ^{Filtración de}picos 2 D

NOTA: Esto se hace para eliminar automáticamente las detecciones sin sentido debido a hemorragias de columna a lo largo de la ¹D y huelgas o relaves a lo largo de la ²D.

1. Seleccionar | de procesamiento Detección interactiva de blobs.
2. Tenga en cuenta la configuración de detección de blobs; a continuación, haga clic en Detectar.
3. En el generador Filtro avanzado, haga clic en Agregar; a continuación, en el cuadro de diálogo Nueva restricción, seleccione Retención II; a continuación, haga clic en Aceptar.
4. En los controles deslizantes Restricción, establezca los tiempos de retención ^2Dmínimo y máximo para que el filtro reduzca el número de picos falsos sin perder los picos verdaderos.
5. Haga clic en Aplicar; a continuación, haga clic en Sí para guardar en la configuración de detección con el nuevo filtro.
   NOTA: Es posible que se necesiten herramientas más avanzadas para hacer frente a problemas particulares de detección, como la detección de picos iónicos o la deconvolución para co-eluciones¹⁹.

7. Calibración de índices de retención lineal

Nota : realice este paso²² (I^T) para los tiempos de retención específicos en el conjunto de estándares de índice de retención (RI) (normalmente n-alcanos).

1. Seleccione Configurar | Tabla de RI | Índice de retención (Col I).
2. En el cuadro de diálogo Configuración de tabla de INSTANCIAS RESERVADAS, haga clic en Importar; a continuación, seleccione el archivo de calibración de instancias reservadas (en formato CSV con nombre, tiempo de retención e índice de retención) denominado "Tabla LRI.csv" – (Archivo suplementario 4).
3. Seleccionar | de archivo Guardar imagen A. Desplácese hasta la carpeta deseada; introduzca el nombre "Aceite 1 LRI CALIBRATED.gci" (Expediente Suplementario 5); a continuación, haga clic en Guardar.

8. Búsqueda de los espectros de pico en la biblioteca NIST17 MS²³

1. Seleccione Configurar | Configuración | Buscar en biblioteca.
2. En el cuadro de diálogo Biblioteca de búsqueda, establezca Tipo de espectro en MS máxima, Umbral de intensidad en 100, Tipo de búsqueda nist en Simple (similitud), Tipo de columna DE IR de NIST en Polar estándar y Tolerancia de RI de NIST en 10; a continuación, haga clic en Aceptar. NIST MS Search ofrece muchos otros ajustes que se establecen en los valores predeterminados aquí.
3. Seleccionar | de procesamiento Buscar en la biblioteca de todos los blobs.

9. Revisar y corregir las identificaciones de analitos

1. En la paleta de herramientas, establezca el modo de cursor en Blob | Seleccione Blobs.
2. En la vista Imagen, haga clic con el botón derecho en el pico deseado.
3. En el cuadro de diálogo Propiedades del blob, inspeccione las propiedades del blob; a continuación, haga clic en Lista de aciertos.
4. Inspeccione la lista de aciertos; a continuación, si la identificación es incorrecta, seleccione la marca de verificación junto a la identificación correcta.
5. En el cuadro de diálogo Propiedades del blob, escriba el Nombre del grupo para designar la clase química y cualquier otro metadato deseado; a continuación, haga clic en Aceptar.
6. Seleccionar | de archivo Guardar imagen como; vaya a la carpeta deseada; introduzca el nombre "Aceite 1 COLORIZADO para la construcción de la plantilla.gci" (Archivo suplementario 6); a continuación, haga clic en Guardar.
   Nota : este archivo se incluye en el archivo suplementario, que puede abrirse para el paso 10.

10. Crea una plantilla con picos específicos¹⁵

1. En la vista imagen (todavía en el modo Seleccionar blobs del paso 9.1), seleccione los picos deseados con un clic en el primer pico y CTRL + clic en los picos adicionales.
2. En la paleta de herramientas, haga clic en el botón Agregar a plantilla.
3. Cuando se complete la plantilla, seleccione | de archivo Guardar plantilla; especifique la carpeta y el nombre de archivo; a continuación, haga clic en Guardar.
4. Seleccionar | de archivo Cerrar imagen.
   Nota: En este punto, estas instrucciones continúan con la plantilla creada para incluir los picos de destino deseados, disponibles como "tamplate.bt de destino" (Archivo suplementario 7).

11. Emparejar y aplicar la plantilla

Nota : coincidencia reconoce el patrón de plantilla en los picos detectados un nuevo cromatograma. La aplicación de las identificaciones de conjuntos coincidentes y otros metadatos en el nuevo cromatograma de la plantilla.

1. Seleccionar | de archivo Abrir imagen; vaya y seleccione el archivo de cromatograma "Oil 2 COLORIZED.gci"(Archivo suplementario 8)(que está preprocesado); a continuación, haga clic en Abrir.
2. En la paleta de herramientas, establezca el modo de cursor en Plantilla | Seleccione Objetos.
3. Seleccionar | de plantilla Cargar plantilla.
4. En el cuadro de diálogo Cargar plantilla, haga clic en Examinar; desplácese hasta la plantilla de picos específicos "Targeted template.bt"(Archivo suplementario 7); a continuación, haga clic en Abrir.
5. En el cuadro de diálogo Cargar plantilla, haga clic en Cargary, a continuación, en Descartar.
6. En la vista Imagen, haga clic con el botón derecho en un pico de plantilla; a continuación, inspeccione sus propiedades de objeto, incluido el qCLIC y la referencia MS.
7. Seleccionar | de plantilla Plantilla interactiva de coincidencia y transformación.
8. En la interfaz De coincidencia interactiva, haga clic en Coincidir con todo; a continuación, revise los resultados coincidentes tanto en la tabla como en la imagen, en la que cada pico de plantilla se marca con círculos sin rellenar y, si se realiza una coincidencia, hay un vínculo a un círculo relleno para el pico detectado.
9. Edite las coincidencias como desee; cuando esté satisfecho, haga clic en Aplicar para transferir metadatos de la plantilla al cromatograma.
   Nota : restricciones de coincidencia, como el qCLIC, ayudan a hacer coincidir el patrón correcto entre los picos detectados del nuevo cromatograma. Los parámetros de restricción incluyen el tipo de firma MS utilizado como referencia de plantilla(MS de pico o MS de blob)y los valores de umbral para la similitud espectral (factor de coincidencia directa (DMF) y factor de coincidencia inversa (RMF)). Aquí, los parámetros se establecen en base a estudios anteriores^13,14 para limitar las coincidencias de falsos negativos: umbral de similitud de MS y DMF y RMF máximo 700.

12. Transformar la plantilla para cromatografía sustancialmente diferente

Nota : este paso no es necesario a menos que las condiciones cromatográficas varían sustancialmente haciendo que la plantilla se desalinee con un nuevo cromatograma, como puede ser el caso en estudios a largo plazo o después de instalar una nueva columna. En tales casos, la plantilla se puede transformar geométricamente en el plano cromatográfico de retención-tiempos para ajustarse mejor al nuevo cromatograma^12,13. En este ejemplo, los patrones de pico de la plantilla y el cromatograma son similares, pero difieren en la geometría de los tiempos de retención, como se vería para diferentes condiciones cromatográficas.

1. Repita los pasos del 11.2 al 11.5, excepto que desplácese hasta, seleccione y cargue la plantilla de destino 2.bt ( Archivo suplementario9).
2. Seleccionar | de plantilla Plantilla de coincidencia interactiva; a continuación, haga clic en Editar transformación.
3. En la interfaz Transformar plantilla, varíe las escalas ¹D y ^2D,las traducciones y las cizalladuras para alinear mejor la plantilla con los picos detectados; a continuación, haga clic en Transformar plantilla.
4. Con la plantilla transformada, haga clic en Editar coincidencia; a continuación, repita los pasos 11.8–11.9.

13. Realizar análisis combinados no dirigidos y dirigidos a través de un conjunto de cromatogramas

NOTA: Una plantilla combinada no dirigida y dirigida (UT), también denominada plantilla de entidad ^{24 , 25,}cuando coincide con cada uno de un conjunto de cromatogramas, establece correspondencias entre los analitos no dirigidos y dirigidos, a continuación, se extraen entidades de muestra cruzada coherentes para el reconocimiento de patrones.

1. Realice el preprocesamiento (pasos 1–6) y la coincidencia de plantillas ut (pasos 11.1–11.9) para todos los cromatogramas del conjunto (es decir, cromatogramas ^2Dde aceites). Como alternativa, automatice este paso con software de proyecto o software similar, no descrito aquí.
2. Inicie el software Investigator.
3. Seleccionar | de archivo Análisis abierto; a continuación, seleccione y abra "Feature Jove su 70 eV.gca" (Archivo Suplementario 10).
4. Haga clic en Aceptar para abrir y examinar los resultados.
5. Haga clic en la pestaña Compuestos para revisar los valores métricos y las estadísticas de analitos específicos (es decir, analitos dirigidos con nombres químicos asociados) o analitos no dirigidos con identificadores (#) alineados en todos los cromatogramas, luego realice los pasos a continuación.
   1. Haga clic en la pestaña Atributos para revisar los valores y las estadísticas de métricas específicas en los cromatogramas.
   2. Haga clic en la pestaña Resumen para revisar las estadísticas de resumen tanto para compuestos como para entidades. Si los cromatogramas son de diferentes clases, como en este caso los aceites producidos a partir de aceitunas cosechadas en dos regiones diferentes de Italia, entonces la pestaña Resumen enumera las estadísticas de la proporción de Fisher (F y FDR), que proporcionan información sobre las características para discriminar entre clases.
   3. Vea varios gráficos en todas las pestañas y, si lo desea, realice análisis de componentes principales (PCA) en la pestaña Atributos.

14. Modificar la plantilla ut para el análisis de EM paralelo

NOTA: El análisis se realizó con energías de ionización de electrones de 70 eV y 12 eV (es decir, altas y bajas)^26,27.

1. Abra uno de los 12 cromatogramas de eV, por ejemplo, "Oil 1 12 eV RAW.gci"(Archivo suplementario 11),realice el preprocesamiento (pasos 1–6) y cargue la plantilla de UT "UT template 70 relaxed.bt"(Supplementary File 12)como se describe en los pasos 11.1–11.6. Los archivos se proporcionan como material complementario.
2. Si es necesario, ajuste la plantilla para que se ajuste a los 12 picos de eV detectados como se describe en el paso 12. Aquí, no hay desalineación significativa porque las señales en tándem están multiplexadas. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que debido a que los diferentes ajustes de ionización producen diferentes fragmentaciones, es necesario relajar las restricciones para las restricciones qCLIC en la similitud espectral DMF y RMF (no demostrada aquí).
3. Seleccionar | de archivo Guardar plantilla; especifique la carpeta y el nombre del archivo, por ejemplo, "Ut template 12.bt"(Archivo suplementario 13); a continuación, haga clic en Guardar.

15. Realizar análisis combinados no dirigidos y dirigidos a través de 12 cromatogramas de eV

1. Seleccionar | de archivo Análisis abierto; a continuación, seleccione y abra "Feature Jove su 12 eV.gca" - Archivo suplementario 14 archivo proporcionado.
2. Haga clic en Aceptar para abrir y examinar los resultados.
3. Haga clic en la pestaña Compuestos para revisar los valores de las métricas, consulte las respuestas y estadísticas de 12 eV para analitos específicos (es decir, analitos dirigidos con nombres químicos asociados) o analitos no dirigidos con (#) identificadores alineados en todos los cromatogramas y, a continuación, realice los pasos a continuación.
   1. Haga clic en la pestaña Atributos para revisar los valores y las estadísticas de métricas específicas en los cromatogramas.
   2. Haga clic en la pestaña Resumen para revisar las estadísticas de resumen de compuestos y características a 12 eV. Si los cromatogramas son de diferentes clases, como en este caso los aceites producidos a partir de aceitunas cosechadas en dos regiones diferentes de Italia, entonces la pestaña Resumen enumera las estadísticas de la proporción de Fisher (F y FDR), que proporcionan información sobre las características para discriminar entre clases.
   3. Vea los distintos gráficos disponibles en todas las fichas y, si lo desea, realice análisis de componentes principales (PCA) en la ficha Atributos.

Resultados

GC×GC-TOF MS patrones de alta calidad extra-virgin Volatilome de aceite de oliva exhiben alrededor de 500 ²D picos por encima de una relación señal-ruido (SNR) umbral de 100. Tal umbral fue definido por investigaciones anteriores sobre volátiles alimentarios^14,27 como la señal relativa mínima sobre el umbral para obtener espectros confiables para el análisis comparativo cruzado. Los componentes se distribuyen sobre el espacio cromatográfico según su retención relativa en las dos dimensiones cromatográficas, y específicamente en base a su volatilidad/polaridad en la ^1Dy volatilidad en la ^2D. Aquí, la combinación de columnas es polar × semipolar (es decir, carbowax 20M × OV1701).

El patrón ^2Dmuestra un alto grado de orden. Los patrones de retención relativos para series y clases homólogas se muestran en la Figura 1A con anotaciones (gráficos para grupos y burbujas para picos) para hidrocarburos saturados lineales (negro), hidrocarburos insaturados (amarillo), aldehídos saturados lineales (azul), aldehídos monoinsaturados (rojo), aldehídos poliinsaturados (salmón), alcoholes primarios (verde) y ácidos grasos de cadena corta (ciano).

Los picos ²D detectados pueden entonces identificarse comparando el espectro medio de la EM extraído de todo el pico ²D (espectrode blobs) o del espectro más grande (espectrode ápice). La Figura 2 ilustra la salida de la búsqueda del espectro de vértices para el blob 5 y devuelve una coincidencia de alta similitud (primeros 10 aciertos) para (E)-2-hexenal. Las bases de datos exploradas son aquellas preseleccionadas por el analista en el paso 8 del método.

La identificación se valida mediante la indexación de retención activa. El valor experimental de I^T se calculó para los picos ^2D,de modo que en esta etapa la búsqueda en la biblioteca prioriza los resultados con valores coherentes de I^Ttabulado. Las ventanas de tolerancia se pueden personalizar en función de la experiencia del analista, la fiabilidad de los valores de la base de datos de referencia según la fase estacionaria y las condiciones analíticas aplicadas. Nuevas herramientas para la calibración inteligente de índices de retención lineales sin calibración experimental con n-alcanos, han sido desarrolladas recientemente y discutidas en un estudio de Reichenbach et al¹⁹.

La colección de picos ²D identificados (es decir, picos dirigidos) se puede adoptar para construir una plantilla de picos específicos para establecer rápidamente correspondencias confiables entre el mismo compuesto en todos los cromatogramas de muestra. La colección de picos de plantilla de destino se visualiza en la Figura 1B. Los círculos rojos corresponden a los 196 compuestos objetivo, incluidos dos estándares internos (IS) vinculados a picos de plantilla con líneas de conexión. Los IS se usan para la normalización de la respuesta y las líneas de conexión ayudan a visualizar cuál de los IS incluidos se adoptará para normalizar cada respuesta de pico/blob ^2D.

En la Figura 1B,los círculos rellenos indican coincidencias positivas entre el pico de la plantilla y el patrón real, mientras que los círculos vacíos son para los picos de la plantilla para los que no se verificó la correspondencia. Las coincidencias de falsos negativos pueden limitarse mediante una selección adecuada de parámetros de umbral, espectros de referencia y funciones de restricción^13,14,18,19. Para patrones complejos con múltiples co-eluciones, las funciones de detección de picos de iones que se basan en la deconvolución espectral son aconsejables y podrían ser una opción válida¹⁹. Los metadatos de pico de plantilla se muestran en el panel ampliado de la Figura 1B para (E)-2-hexenal.

La especificidad de la coincidencia de plantillas se basa en la posibilidad de aplicar funciones de restricción que limitan la correspondencia positiva a aquellos picos candidatos que, dentro de la ventana de búsqueda del algoritmo, tienen similitud espectral ms por encima de un cierto umbral. En este caso, en el paso 11, los umbrales de similitud²³ se establecieron en 700 de acuerdo con experimentos anteriores destinados a definir parámetros óptimos que limiten las coincidencias de falsos negativos^14. Las áreas resaltadas de las propiedades de pico de la plantilla en la Figura 1B muestran la información sobre la cadena de espectro MS de referencia y la función de restricción qCLIC (es decir, (Match("

Al aplicar la plantilla a todos los cromatogramas de un conjunto, uno podría encontrar situaciones desafiantes como en el caso de la desalineación parcial de los patrones. Esto puede deberse a inconsistencias en la temperatura del horno, inestabilidades de flujo/presión de gas portador, o debido a una intervención manual en el sistema como en el caso de la sustitución de columnas o el reemplazo de lazo capilar del modulador^14,28. La Figura 3 muestra una situación de desalineación parcial entre la plantilla de destino y el cromatograma real. Para desalineaciones mínimas, las transformaciones de plantilla interactivas(Figura 3,panel de control) pueden reposicionar los picos de la plantilla para un mejor ajuste. Una vez reposicionada, la plantilla se puede emparejar para establecer correspondencias. En el ejemplo, los picos de la plantilla(Figura 3,paso 12) coinciden correctamente con el patrón ^2Dreal. En caso de desalineaciones graves, no discutidas aquí, la repetición de acciones de coincidencia-transformación-actualización puede adaptar iterativamente la posición de los picos de la plantilla al patrón de pico real^12,13,14.

Aquí, los picos objetivo (es decir, los analitos conocidos) proporcionan alrededor del 40% del resultado cromatográfico (196 picos dirigidos de aproximadamente 500 picos detectables en promedio). El otro 60% de los compuestos, junto con la información que aportan, no se tienen en cuenta en el análisis dirigido. Para que la investigación sea verdaderamente exhaustiva, también se debe establecer una alineación cruzada consistente de picos ^2Dno segmentados. La primera aplicación donde la coincidencia de plantillas se extendió a todos los analitos detectables se ocupó de la volatilome compleja del café tostado⁷. Este proceso se automatiza con un software (por ejemplo, Investigador), que se muestra aquí en los pasos 14 a 15.

En este proceso, las imágenes pre-dirigidas que pertenecen al conjunto de muestras en estudio (20 muestras) se utilizan para definir picos confiables mediante la coincidencia cruzada de todos los patrones de imagen²⁹. Posteriormente, se construye un cromatograma compuesto a partir del cual se pueden identificar picos y regiones de picos confiables de UT (es decir, huella de picos ^2D)en la llamada plantilla de características^17.

Para los análisis adquiridos a 70 eV, el proceso determinó 144 picos confiables con confiabilidad relajada^29,76 de los cuales pertenecen a la lista de picos objetivo. Basado en estos 144 picos confiables, el proceso alinea todos los cromatogramas consistentemente con los tiempos de retención promedio de los picos confiables y luego los combina para crear un cromatograma compuesto. La Figura 4 muestra una lista de todas las muestras etiquetadas según la región de producción del aceite (izquierda) y la lista de picos/volúmenes de blobs confiables en cada muestra (derecha).

La plantilla de entidad no segmentada se compone de picos ^2Dde analitos detectados en el cromatograma compuesto, que se muestran en la Figura 5A, que coinciden con la plantilla reliable-peaks (n = 168 – círculos rojos para picos específicos y círculos verdes para picos no segmentados). Los espectros de masas de los picos compuestos, así como sus tiempos de retención, se registran en la plantilla de características como se muestra para el acetato de (Z)-3-hexenol en el área ampliada. Las regiones de pico se muestran en la Figura 5B como gráficos de color rojo; en su lugar, se definen por los contornos de todos los picos ^2Ddetectados en el cromatograma compuesto (n = 3578).

Cuando el reconocimiento de patrones no supervisados por el análisis de componentes principales se aplica a la distribución de picos específicos dentro de las 20 muestras analizadas, los aceites sicilianos y de la Toscana se agrupan por separado, lo que sugiere que las condiciones pedoclimáticas y el terroir afectan la prevalencia relativa de volátiles. Los resultados se muestran en la Figura 6A y los resultados de la PCA de la distribución de picos confiables se muestran en la Figura 6B. Los dos enfoques validan de forma cruzada que los aceites de diferentes áreas geográficas tienen diferentes, mientras que se mapean firmas químicas coherentes, ya sean compuestos dirigidos o no dirigidos, o ambos.

Por último, el software permite una re-alineación rápida y efectiva de los patrones a través de canales de detección paralelos. En esta aplicación, se propone la re-alineación para las señales de ionización en tándem. La fuente iónica de los multiplexes ms entre dos energías de ionización (es decir, 70 y 12 eV) a una frecuencia de adquisición de 50 Hz por canal³⁰. Los dos patrones cromatográficos resultantes están estrechamente alineados, mientras que los datos espectrales (es decir, las firmas espectrales y las respuestas) aportan información complementaria con diferentes rangos dinámicos de respuesta^26,27. Los patrones alineados permiten extraer características^{(picos 2D}y regiones de picos) con identificadores unívocos (es decir, nombres químicos para picos específicos y números únicos para picos no segmentados y regiones de picos).

La coincidencia de plantillas permite una alineación cruzada efectiva. En esta situación, no hay mucha desalineación, pero las restricciones de MS deben relajarse para permitir coincidencias para los picos de UT. Por otra parte, las pico-regiones destacadas UT, que no tienen ninguna restricción ms, se corresponden con juego puntualmente sin ningunas coincidencias negativas falsas. La Figura 5C muestra un área ampliada de un cromatograma de 12 eV donde se hace coincidir la plantilla de características creada a partir de datos de 70 eV. Los picos confiables de UT se corresponden positivamente debido a las restricciones de qCLIC bajadas (por ejemplo, umbral dmf en 600). A tener en cuenta, a 12 eV, hay menos picos detectados debido a la fragmentación limitada inducida por la baja energía de ionización.

Figura 1: Gráfica de contorno bidimensional y plantilla de destino. (A) Gráfica de contorno de la fracción volátil de un aceite de oliva virgen extra de la Toscana. Los patrones ordenados de series y clases homólogas se resaltan con diferentes colores y líneas: hidrocarburos saturados lineales (línea negra y contornos ^2D)hidrocarburos insaturados (amarillo), aldehídos saturados lineales (azul), aldehídos monoinsaturados (rojos), aldehídos poliinsaturados (salmón), alcoholes primarios (verde) y ácidos grasos de cadena corta (ciano). (B) Plantilla dirigida sobreimpuesta de analitos conocidos (círculos de color rojo) con líneas de conexión que enlazan estándares internos (ISs). Los paneles muestran metadatos de propiedades de pico/blob ^2D(Decanal) o propiedades de pico de plantilla. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2: Búsqueda de Apex MS. Salida de la búsqueda de APEX MS para el blob 5. Lista de las entradas de la base de datos con la coincidencia de similitud más alta y los metadatos relacionados disponibles en la biblioteca. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3: Realineación de plantillas. Flujo de trabajo que ilustra los pasos que permiten la re-alineación de la plantilla por transformación. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 4: Interfaz de GC Investigator. Panel del investigador con todas las imágenes seleccionadas etiquetadas de acuerdo con la región de producción del aceite (izquierda) y la lista de picos / volúmenes de blobs confiables en cada muestra (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 5: Plantilla de destino y UT. a)los picos fiables resultantes del tratamiento automatizado en la etapa 11; los círculos rojos corresponden a analitos conocidos, mientras que los círculos verdes son desconocidos. En el panel superpuesto, se muestran las propiedades del objeto de plantilla para el (Z)-3-hexenal. (B)Área ampliada que muestra los picos de UT (círculos rojos y verdes) y las regiones de pico (gráficos rojos) de la plantilla de UT emparejados en una muestra de aceite adquirida a 70 eV de energía de ionización. (C) Plantilla ut emparejado en una muestra de aceite adquirido a 12 eV de energía de ionización. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 6: Gráficas de carga de PCA. Muestran la conformación natural de las muestras (aceites de toscana y Sicilia) como resultado de (A) distribución de picos dirigidos o (B) distribución de picos UT. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Discusión

La visualización de los datos de GC×GC-TOF MS es un paso fundamental para una comprensión adecuada de los resultados logrados por las separaciones bidimensionales integrales. Las gráficas de imagen con coloración personalizada permiten a los analistas apreciar las diferencias de respuesta del detector y, por lo tanto, la distribución diferencial de los componentes de la muestra. Este enfoque visual cambia por completo la perspectiva de los analistas sobre la interpretación y elaboración de cromatogramas. Este primer paso, una vez entendido y utilizado con confianza por los cromatógrafos, abre una nueva perspectiva en el procesamiento posterior.

Otro aspecto fundamental del procesamiento de datos es la accesibilidad a la matriz de datos completa (es decir, datos espectrales y respuestas de MS) para todos los puntos de muestra, cada uno de los cuales corresponde a un solo evento de detector. En este sentido, la integración de picos ^2D,de modo que la colección de eventos detectores correspondientes a un solo analito representan un paso crítico. En el protocolo actual, la detección de picos ^2Dse basa en el algoritmo de cuenca¹⁸ con algunas adaptaciones incluidas para mejorar la sensibilidad de detección en caso de compuestos co-eluting parciales. Para que este proceso sea más específico, se debe hacer la deconvolución y adoptar procedimientos más sofisticados. Esto es posible mediante la realización de una detección de pico de iones para los datos de EM; el algoritmo procesa la matriz de datos y aísla la respuesta de analitos individuales basados en perfiles espectrales^19,31.

Un paso importante pero crítico del protocolo, y de cualquier proceso de interpretación de datos GC×GC-MS, se relaciona con la identificación de analitos. Este procedimiento, propuesto en los pasos 8 y 9, en ausencia de un análisis confirmatorio con estándares auténticos, debe ser conducido cuidadosamente por el analista. Las acciones automatizadas están disponibles en cualquier software comercial; incluyen la evaluación de la similitud de la firma espectral ms contra los espectros de referencia recogidos (es decir, bibliotecas espectrales) y la evaluación de las relaciones características entre los iones calificador/cuantificador. Sin embargo, se necesitan criterios confirmatorios adicionales para desambiguar la identificación de isómeros. El protocolo propone la adopción de índices de retención lineales para priorizar la lista de candidatos; el límite aquí se relaciona con la disponibilidad de datos de retención y su coherencia.

La principal característica que hace que este enfoque sea único es la coincidencia de plantillas^12,13,15,29. La coincidencia de plantillas permite el reconocimiento de patrones ^2Dde una manera muy efectiva, específica e intuitiva. Se puede establecer, en términos de sensibilidad y especificidad, mediante la aplicación de valores de umbral personalizados y / o funciones de restricción, mientras que el analista puede supervisar el procedimiento interactuando activamente con los parámetros de la función de transformación. La peculiaridad de este proceso se basa en la posibilidad de alinear de forma cruzada la información de picos dirigidos y no dirigidos entre muestras de un lote uniforme, pero también entre muestras adquiridas con las mismas condiciones nominales a pesar de la desalineación media a grave. Las ventajas de esta operación se relacionan con la posibilidad de preservar todas las identificaciones de analitos dirigidos, que es una tarea que consume mucho tiempo para el analista, y todos los metadatos guardados para picos específicos y no dirigidos de sesiones de elaboración anteriores.

La coincidencia de plantillas también es muy efectiva en términos de tiempo computacional; los archivos de datos de EM de baja resolución constan de aproximadamente 1 a 2 Gb de datos empaquetados, mientras que los análisis de EM de alta resolución pueden alcanzar los 10 a 15 Gb por cada ejecución analítica única. La coincidencia de plantillas no procesa la matriz de datos completa cada vez, sino que, al principio, realiza la alineación en tiempo de retención entre cromatogramas utilizando picos de plantilla y, a continuación, procesa los picos candidatos dentro de la ventana de búsqueda para su coincidencia de similitud con la referencia en la plantilla. En caso de desalineación severa, la situación más desafiante, las transformaciones polinómicas globales de segundo orden tuvieron un mejor desempeño que los métodos locales, al tiempo que recisó el tiempo computacional^13.

Para que la técnica GC×GC se extienda ampliamente más allá de la academia y los laboratorios de investigación, las herramientas de procesamiento de datos tienen que facilitar las operaciones básicas para la visualización y la inspección de cromatogramas; la identificación de analitos debe ofrecer la posibilidad de adoptar algoritmos y procedimientos estandarizados (por ejemplo, algoritmo de búsqueda nist y calibración I^T); y el análisis comparativo cruzado debe ser intuitivo, eficaz y estar respaldado por instrumentos interactivos. El enfoque propuesto aborda estas necesidades al tiempo que ofrece opciones y herramientas avanzadas para hacer frente a situaciones complejas como la co-elución de analitos, la calibración de múltiples analitos, el análisis de tipo de grupo y la alineación de detección paralela.

La literatura referenciada cubre bien muchos escenarios posibles donde GC×GC y, más generalmente, cromatografía bidimensional integral, ofrecen soluciones únicas y resultados confiables que no se pueden lograr mediante ¹cromatografía D en análisis de una sola ejecución. ^5,32,33 Aunque GC×GC es la herramienta más poderosa que aumenta la capacidad de separación y la sensibilidad, siempre hay limitaciones a la potencia de separación, la sensibilidad y otras capacidades sistémicas. A medida que se acercan estos límites sistémicos, el análisis de datos se vuelve progresivamente más difícil. Por lo tanto, la investigación y el desarrollo deben seguir mejorando las herramientas analíticas de que disponemos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min.	Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia	PN 054796	Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min.
2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from .	Mega, Legnano, Milan, Italy	PN MEGA-1701
Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC	SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK
Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy	Project VIOLIN (Ager - Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare)		Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14
Gas chromatograph: Model 7890B GC	Agilent Technologies Wilmington DE, USA
GC Image GC×GC edition V 2.9	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Image processing software	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Mass spectrometer: BenchTOF-Select	Markes International Llantrisant, UK
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6)	Merck-Millipore/Supelco	PN: 68982
Modulator controller: Optimode v2.0	SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy
Modulator: KT 2004 loop type	Zoex Corporation Houston, TX, USA
MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3	National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD		https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17
n-alkanes C8-C40 for retention indexing	Merck-Millipore/Supelco	PN: 40147-U
n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv	Merck-Millipore/Supelco	PN: 100795
Solid Phase Microextraction fiber	Merck-Millipore/Supelco	PN 57914-U
α- /β-thujone (CAS 546-80-5)	Merck-Millipore/Sigma Aldrich	PN: 04314