טביעת אצבע כרומטוגרפית לפי התאמת תבניות לנתונים שנאספו על ידי כרומטוגרפיית גז דו-ממדית מקיפה

Summary

פרוטוקול זה מציג גישה לטביעת אצבע ולחקור נתונים רב מימדיים שנאספו על ידי כרומטוגרפיית גז דו מימדית מקיפה יחד עם ספקטרומטריית מסה. אלגוריתמים ייעודיים לזיהוי תבניות (התאמת תבניות) מוחלים כדי לחקור את המידע הכימי המוצפן בשבר הנדיף של שמן זית כתית מעולה (כלומר, וולטילום).

Abstract

עיבוד והערכת נתונים הם צעדים קריטיים של כרומטוגרפיית גז דו מימדית מקיפה (GCxGC), במיוחד כאשר הם מצמדים לספקטרומטריית מסה. המידע העשיר המוצפן בנתונים עשוי להיות בעל ערך רב אך קשה לגשת אליו ביעילות. צפיפות הנתונים ומורכבותם עלולים להוביל לזמנים ארוכים של פירוט ולדרוש הליכים מייגעים ותלויי אנליסטים. כלי עיבוד נתונים יעילים אך נגישים, אם כן, הם המפתח המאפשר התפשטות וקבלה של טכניקה רב ממדית מתקדמת זו במעבדות לשימוש יומיומי. פרוטוקול ניתוח הנתונים המוצג בעבודה זו משתמש בטביעות אצבע כרומטוגרפיות והתאמת תבניות כדי להשיג את המטרה של פירוק אוטומטי ביותר של כרומטוגרמות דו-ממדיות מורכבות לתכונות כימיות בודדות לזיהוי מתקדם של דפוסים אינפורמטיביים בתוך כרומטוגרמות בודדות ולאורך קבוצות של כרומטוגרמות. הפרוטוקול מספק עקביות ואמינות גבוהות עם התערבות מועטה. במקביל, פיקוח אנליסטים אפשרי במגוון הגדרות ופונקציות אילוץ שניתן להתאים אישית כדי לספק גמישות ויכולת להסתגל לצרכים ויעדים שונים. התאמת תבניות מוצגת כאן כגישה רבת עוצמה לחקור וולטילום שמן זית כתית מעולה. יישור צולב של פסגות מבוצע לא רק עבור מטרות ידועות, אלא גם עבור תרכובות untargeted, אשר מגדיל באופן משמעותי את כוח האפיון עבור מגוון רחב של יישומים. דוגמאות מוצגות כדי להדגים את הביצועים עבור סיווג והשוואה של דפוסים כרומטוגרפיים מקבוצות מדגם שנותחו בתנאים דומים.

Introduction

כרומטוגרפיית גז דו מימדית מקיפה בשילוב עם זיהוי ספקטרומטרי מסה בזמן הטיסה (GC×GC-TOF MS) היא כיום הגישה האנליטית האינפורמטיבית ביותר לאפיון כימי של דגימות מורכבות^1,2,3,4,5. ב- GC×GC, עמודות מחוברות באופן סדרתי ומתממשקות על-ידי אפנן (למשל, ממשק מיקוד תרמי או מבוסס שסתום) הלכוד רכיבים מרחפים מעמודת המימד הראשון⁽¹D) לפני הזרקתן מחדש לעמודת המימד השני (²D). פעולה זו מתבצעת בתוך פרק זמן אפנון קבוע (P_M), בדרך כלל נע בין 0.5-8 שניות. על ידי אפנון תרמי, התהליך כולל לכידת קריו והתמקדות של הלהקה eluting עם כמה יתרונות עבור כוח ההפרדה הכולל.

למרות ש- GC×GC היא טכניקת הפרדה דו-ממדית, התהליך מייצר ערכי נתונים רציפים. ממיר הגלאי אנלוגי לדיגיטלי (A/D) משיג את פלט האות הכרומטוגרפי בתדר מסוים. לאחר מכן, הנתונים מאוחסנים בתבניות קנייניות ספציפיות אשר לא רק מכיל את הנתונים הדיגיטליים אלא גם מטה-נתונים קשורים (מידע אודות הנתונים). ממיר A/D המועסקים במערכות GC×GC מסייע במיפוי עוצמת האות הכרומטוגרפי למספר דיגיטלי (DN) כפונקציה של זמן בשני הממדים האנליטיים. גלאים חד-ערוציים (למשל, גלאי יינון להבות (FID), גלאי לכידת אלקטרונים (ECD), גלאי כימילומינות גופרית (SCD) מייצרים ערכים בודדים לכל זמן דגימה, ואילו גלאים רב-ערוציים (למשל, גלאי ספקטרומטרי מסה (MS)) מייצרים ערכים מרובים (בדרך כלל, על פני טווח ספקטרלי) לכל זמן דגימה לאורך הריצה האנליטית.

כדי להציג נתונים ^{דו-ממדיים}באופן חזותי, ההרחבה מתחילה ברסטר של ערכי נתונים בודדים של תקופת אפנון (או מחזור) כעמודת פיקסלים (רכיבי תמונה המתאימים לאירועי גלאי). לאורך זמן ההפרדה הדו-ממדית (ציר Y, מלמטה למעלה) מוצגת באופן חזותי זמן ההפרדה הדו-ממדי. עמודות פיקסל מעובדות ברצף כך שה-abscissa (ציר X, משמאל לימין) מדווח על זמן ^הפרדתצבע 1 D. הזמנה זו מציגה את הנתונים הדו-ממדיים במערכת קואורדינטות קרטזית ימנית, כאשר ^פקודתהשמירה הדו-ממדית היא האינדקס הראשון למערך.

עיבוד נתונים של כרומטוגרמות ^{דו-ממדיות}מעניק גישה לרמה גבוהה יותר של מידע מאשר נתונים גולמיים, ומאפשר זיהוי שיא ^{דו-ממדי,}זיהוי שיא, חילוץ נתוני תגובה לניתוח כמותי וניתוח חוצה השוואות.

ניתן להתייחס לדפוסי השיא ^{הדו-ממדיים}כאל טביעת האצבע הייחודית של הדגימה ולזהות תרכובות כתכונות minutiae לניתוח חוצה השוואתי יעיל. גישה זו, המכונה טביעת אצבע מבוססת תבנית^6,7, נוצרה בהשראת טביעת אצבע ביומטרית⁶. מערכות אימות טביעות אצבע ביומטריות אוטומטיות, למעשה, מסתמכות על מאפיינים ייחודיים של קצות האצבעות: bifurcations רכס וסופים, מקומיים ומופקים מחשיפות בדיו או תמונות מפורטות. מאפיינים אלה, הנקראים תכונות minutiae, הם לאחר מכן מוצלבים עם תבניות מאוחסנות זמינות^8,9.

כפי שהוזכר לעיל, כל דפוס הפרדת GC×GC מורכב מפסגות ^{דו-ממדיות}המופצות באופן רציונלי על פני מישור דו-ממדי. כל פסגה תואמת לניתוח יחיד, בעלת הפוטנציאל האינפורמטיבי שלה, וניתן להתייחס אליה כאל תכונה אחת לניתוח דפוסים השוואתי.

כאן, אנו מציגים גישה יעילה עבור טביעת אצבע כימית על ידי GC×GC-TOF MS שמציעות יינון טנדם. המטרה היא לקטלג באופן מקיף וכמותי תכונות מתוך קבוצה של כרומטוגרמות.

בהשוואה לתוכנה מסחרית קיימת או לשגרה פנימית^10,11 המשתמשים בגישה של תכונות שיא, טביעת אצבע מבוססת תבנית מאופיינת בספציפיות גבוהה, יעילות וזמן חישובי מוגבל. בנוסף, יש לו גמישות מהותית המאפשרת יישור צולב של תכונות minutia (כלומר, ^{פסגות 2}D) בין כרומטוגרמות לא מיושרות באופן חמור כמו אלה שנרכשו על ידי מכשור שונה או במחקרי מסגרת ארוכים^12,13,14.

הפעולות הבסיסיות של השיטה המוצעת מתוארות בקצרה כדי להנחות את הקורא להבנה טובה של מורכבות התבנית ^{הדו-ממדית}וכוח המידע. לאחר מכן, על ידי חקירת מטריצת נתוני פלט המכשיר, מתבצע זיהוי כימי וניתוחים ממוקדים ידועים הממוקמים מעל החלל הדו-ממדי. התבנית של פסגות ממוקדות נבנית ומוחלת על סדרה של כרומטוגרמות שנרכשו באותה אצווה אנליטית. מטה-נתונים הקשורים לשעות שמירה, חתימות ספקטרליות ותגובות (מוחלטות ויחסיות) מופקים מדפוסים מיושרים מחדש של פסגות ייעודיות ומאומצים כדי לחשוף הבדלים קומפוזיציוניים בערכת המדגם.

כשלב נוסף וייחודי של התהליך, מתבצעת גם טביעת אצבע משולבת לא ממוקדת וממוקדת (UT) על כרומטוגרמות ממוקדות מראש כדי להרחיב את פוטנציאל טביעת האצבע לניתוחים ידועים ולא ידועים כאחד. התהליך מייצר תבנית UT לניתוח השוואתי מקיף באמת שניתן להפוך לאוטומטי ברובו.

כצעד אחרון, השיטה מבצעת את היישור הצולב של תכונות בשני אותות גלאי מקבילים המיוצרים באנרגיות ייחון אלקטרונים גבוהות ונמוכות (70 ו-12 eV).

הפרוטוקול די גמיש בניתוחים תומכים של כרומטוגרמה אחת או קבוצה של כרומטוגרמות ועם כרומטוגרפיה משתנה ו /או גלאים מרובים. כאן, הפרוטוקול מוצג עם חבילת תוכנות GC×GC זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים)המשולבת לספריית MS ותוכנת חיפוש (ראה טבלת חומרים). חלק מהכלים הדרושים זמינים בתוכנות אחרות וכלים דומים יכולים להיות מיושמים באופן עצמאי מתיאורים בספרות על ידי רייכנבך ועמיתים לעבודה^{15,16,17,18,19}. נתונים גולמיים להדגמה נגזרים ממחקר על שמן זית כתית מעולה (EVO) שנערך במעבדת המחברים¹⁴. בפרט, השבר הנדיף (כלומר, וולטילום) של שמני EVO איטלקיים נדגם על ידי מיקרו-אקסטרציה של פאזה מוצקה (HS-SPME) ומנותח על ידי GC×GC-TOF MS כדי ללכוד טביעות אצבעות אבחון לאיכות והסמכה חושית של דגימות. פרטים על דוגמאות, תנאי דגימה והגדרה אנליטית מסופקים בטבלת החומרים.

שלבים 1-6 מתארים עיבוד מקדים של הכרומטוגרמות. שלבים 7-9 מתארים עיבוד וניתוח של כרומטוגרמות בודדות. שלבים 10-12 מתארים יצירה והתאמה של תבניות, שהן הבסיס לניתוח בין מדגמים. שלבים 13-16 מתארים החלת הפרוטוקול על-פני קבוצה של כרומטוגרמות, עם שלבים 14-16 לניתוח UT.

Protocol

1. ייבוא נתונים גולמיים

הערה: פעולה זו יוצרת מערך רסטר דו-ממדי לפריטים חזותיים ועיבוד.

1. הפעל את תוכנת התמונה.
2. בחר | קובץ יבא ; לנווט ולבחור את קובץ הנתונים הגולמי שנרכש על ידי מערכת MS GC×GC-TOF בשם "כינור 101.lsc"(קובץ משלים 1); לאחר מכן, לחץ על פתח. הכרומטוגרמה נפתחת בתוכנה זו.
   הערה: תבנית קובץ נתונים גולמיים תלויה ביצרן המכשיר. התוכנה מייבאת מגוון של תבניות קובץ המפורטות במדריך למשתמש.
3. בתיבת הדו-שיח 'ייבוא', הגדר את תקופת האפנון (P_M) ל- 3.5 שניות; לאחר מכן, לחץ על אישור.
   הערה: ייתכן שתוכנות רכישה מסוימות לא יתעדו את תקופת האפנון.
4. בחר | קובץ שמירת תמונה בשם; לנווט לתיקיה הרצויה; הזן את השם "שמן 1 RAW.gci" (קובץ משלים 2); לאחר מכן, לחץ על שמור.

2. הסטת שלב האפנון

הערה: פעולה זו מכניסה את כל הפסגות בכל מחזור אפנון לאותה עמודת תמונה, כולל הפסגות העוטפות את סוף תקופת האפנון לזמן הריק של תקופת האפנון הבאה²⁰.

1. בחר | עיבוד שלב ההזזה.
2. בתיבת הדו-שיח 'שלב הזזה', הגדר את סכום ההזזה ל- -0.8 שניות; לאחר מכן, לחץ על אישור.

3. תיקון בסיסי²¹

1. בחירת | גרפי צייר מלבן.
2. לחץ וגרור כדי לצייר מלבן בתמונה שבו לא מזוהים פסגות.
3. בחר כלים | הצג נתונים באופן חזותי; שים לב לכוונה ולסטיית התקן של אות הגלאי, כאן, 21.850 ± 1.455 SD מספר דיגיטלי ללא יחידות SD (DN); לאחר מכן, סגור את הכלי.
4. בחר | עיבוד תקן תוכנית בסיסית.

4. צביעת התמונה הכרומטוגרפית באמצעות מפת ערכים ומפת צבע²⁰

1. בחר תצוגה | צביעה.
2. בתיבת הדו-שיח 'צביעה', בחרו בכרטיסיה 'ייבוא/ייצוא'; בחר את מפת הצבעים המותאמת אישית #AAAA (קובץ משלים 3) המסופקת כחומר משלים; לאחר מכן, לחץ על יבא.
3. בפקדי מיפוי הערכים, הגדר את טווח הערכים לערכים המינימליים והמקסימום; לאחר מכן, לחץ על אישור.

5. זיהוי פסגות ^{דו-ממדיות}(כלומר כתמים) לניתוח¹⁸

1. בחר | עיבוד זהה כתמים באמצעות הגדרות ברירת המחדל; לאחר מכן, שים לב כי כמה פסגות מפוצלות ויש גילויים מזויפים.
2. בחר קבע תצורה של | הגדרות | זיהוי כתמים; לאחר מכן הגדר החלקה ל- 0.1 עבור הממד הראשון ו- 2.0 עבור הממד השני והגדר נפח מינימלי (כלומר, סף עבור הערכים המסוכמו) ל- 1.00 E6; לאחר מכן, לחץ על אישור.
3. בחר | עיבוד זהה כתמים באמצעות ההגדרות החדשות; לאחר מכן, לבחון את השיפורים.

6. סינון פסגות ^{דו-ממדיות}

הערה: פעולה זו מתבצעת כדי להסיר באופן אוטומטי זיהויים חסרי משמעות עקב דימומים בעמודה לאורך ^{ה- 1}D ושביתות או זנבות לאורך ^{הדו-ממדי.}

1. בחר | עיבוד זיהוי בועה אינטראקטיבי.
2. שים לב להגדרות זיהוי הכתמים; לאחר מכן, לחץ על זהה.
3. בבונה המסננים המתקדמים, לחץ על הוסף; לאחר מכן, בתיבת הדו-שיח אילוץ חדש, בחר שמירה II; לאחר מכן, לחץ על אישור.
4. במחוונים Constraint, הגדר את זמני השמירה ^{הדו-ממדיים}המינימליים והמקסימליים עבור המסנן כדי להפחית את מספר הפסגות הכוזבות מבלי לאבד פסגות אמיתיות.
5. לחץ על החל; לאחר מכן, לחץ על כן כדי לשמור בהגדרות הזיהוי עם המסנן החדש.
   הערה: ייתכן שיידרשו כלים מתקדמים יותר כדי להתמודד עם בעיות זיהוי מסוימות, כגון זיהוי שיא יונים או פירוק עבור ביטולים משותפים¹⁹.

7. כיול מדדי שמירה ליניאריים

הערה: בצע שלב זה²² (I^T) עבור זמני השמירה הספציפיים על-פני קבוצת תקני אינדקס השמירה (RI) (בדרך כלל n-alkanes).

1. בחר קבע תצורה של | | שולחן RI אינדקס שמירה (Col I).
2. בתיבת הדו-שיח תצורת טבלת RI, לחץ על יבא; לאחר מכן, בחר את קובץ הכיול RI (בתבנית CSV עם שם, זמן שמירה ואינדקס שמירה) בשם "טבלת LRI.csv" – (קובץ משלים 4).
3. בחר | קובץ שמור תמונה א '. נווט אל התיקיה הרצויה; הזן את השם "שמן 1 LRI מכויל.gci" (קובץ משלים 5); לאחר מכן, לחץ על שמור.

8. חיפוש ספקטרום השיא בספריית NIST17 MS²³

1. בחר קבע תצורה של | הגדרות | ספריית חיפוש.
2. בתיבת הדו-שיח 'ספריית חיפוש', הגדר את סוג הספקטרום לשיא MS, סף אינטנסיביות ל- 100, סוג חיפוש NIST לפשוט (דמיון), סוג עמודת NIST RI לקוטב רגיל וסובלנות NIST RI ל- 10; לאחר מכן, לחץ על אישור. חיפוש MS NIST מציע הגדרות רבות אחרות המוגדרות ברירות המחדל כאן.
3. בחר | עיבוד חפש בספריהאת כל הכתמים .

9. סקירה ותיקון של זיהויי ניתוח

1. בלוח הכלים, הגדר את מצב הסמן ל- Blob | בחר כתמים.
2. בתצוגת תמונה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על השיא הרצוי.
3. בתיבת הדו-שיח מאפייני Blob, בדוק מאפייני Blob; לאחר מכן, לחץ על רשימת כניסות.
4. בדוק את רשימת החיסול; לאחר מכן, אם הזיהוי שגוי, בחר את סימן הביקורת לצד הזיהוי הנכון.
5. בתיבת הדו-שיח מאפייני Blob, הזן את שם הקבוצה כדי לייעד מחלקה כימית וכל מטה-נתונים רצויים אחרים; לאחר מכן, לחץ על אישור.
6. בחר | קובץ שמירת תמונה בשם; לנווט לתיקיה הרצויה; הזן את השם "שמן 1 צבעוני לבניית תבנית.gci" (קובץ משלים 6); לאחר מכן, לחץ על שמור.
   הערה: קובץ זה כלול בארכיון המשלים, אותו ניתן לפתוח עבור שלב 10.

10. צור תבנית עם פסגות ממוקדות¹⁵

1. בתצוגת תמונה (עדיין במצב בחר כתמים משלב 9.1), בחר את הפסגות הרצויות בלחיצה על השיא הראשון ו- CTRL + לחץ על הפסגות הנוספות.
2. בלוח הכלים, לחץ על לחצן הוסף לתבנית.
3. לאחר השלמת התבנית, בחר קובץ | שמור תבנית; ציין את התיקיה ואת שם הקובץ; לאחר מכן, לחץ על שמור.
4. בחר | קובץ סגור תמונה.
   הערה: בשלב זה, הוראות אלה ממשיכות עם התבנית שנוצרה כדי לכלול את פסגות היעד הרצויות, הזמינות כ"tamplate.bt ממוקדות"(קובץ משלים 7).

11. התאם והחל את התבנית

הערה: התאמה מזהה את תבנית התבנית בפסגות שזוהו כרומטוגרמה חדשה. החלת הזיהויים של ערכות ההתאמה ומטה-נתונים אחרים בכרומטוגרמה החדשה מהתבנית.

1. בחר | קובץ פתח תמונה; לנווט ולבחור את "שמן 2 COLORIZED.gci" (קובץ משלים 8) קובץ כרומטוגרמה (אשר מעובד מראש); לאחר מכן, לחץ על פתח.
2. בלוח הכלים, הגדר את מצב הסמן לתבנית | בחר אובייקטים.
3. בחר | תבנית טען תבנית.
4. בתיבת הדו-שיח טעינת תבנית, לחץ על עיון; לנווט ולבחור את תבנית הפסגותהייעודיות" template.bt ממוקדת " (קובץ משלים 7); לאחר מכן, לחץ על פתח.
5. בתיבת הדו-שיח טעינת תבנית, לחץ על טעןולאחר מכן על בטל.
6. בתצוגת תמונה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על שיא תבנית; לאחר מכן, בדוק את מאפייני האובייקט שלו, כולל ה- qCLIC ו- MS ההפניה.
7. בחר | תבנית התאמה אינטראקטיבית ותבנית המרה.
8. בממשק התאמה אינטראקטיבית, לחץ על התאם הכל; לאחר מכן, סקור את התוצאות התואמות הן בטבלה והן בתמונה, שבה כל שיא תבנית מסומן בעיגולים לא ממולאים, ואם מתבצעת התאמה, קיים קישור לעיגול מלא עבור הפסגה שזוהתה.
9. ערוך את ההתאמות לפי הצורך; כאשר אתה מרוצה, לחץ על החל כדי להעביר מטא-נתונים מהתבנית לכרומטוגרמה.
   הערה: אילוצים תואמים, כגון qCLIC, מסייעים להתאים את התבנית הנכונה בין הפסגות שזוהו בכרומטוגרמה החדשה. פרמטרי אילוץ כוללים את סוג חתימת MS המשמשת כהפניית תבנית ( MS או Blob MSשיא) ואת ערכי הסף עבור דמיון ספקטרלי (גורם התאמה ישירה (DMF) ומקדם התאמה הפוכה (RMF)). כאן, הפרמטרים נקבעים בהתבסס על מחקרים^{קודמים 13,14} כדי להגביל התאמות שליליות שווא: שיא MS ו- DMF וסף דמיון RMF 700.

12. להפוך את התבנית עבור כרומטוגרפיה שונה באופן משמעותי

הערה: שלב זה אינו הכרחי אלא אם התנאים הכרומטוגרפיים משתנים באופן משמעותי וגורמים לתבנית להיות מיושרת באופן שגוי עם כרומטוגרמה חדשה, כגון יכול להיות המקרה במהלך מחקרים ארוכי טווח או לאחר התקנת עמודה חדשה. במקרים כאלה, ניתן להפוך את התבנית באופן גיאומטרי במישור ההחזקה הכרומטוגרפי כדי להתאים טוב יותר לכרומטוגרמה החדשה^12,13. בדוגמה זו, תבניות השיא של התבנית והכרומטוגרמה דומות, אך שונות בגיאומטריה של זמני השמירה, כגון תנאים כרומטוגרפיים שונים.

1. חזור על שלבים 11.2–11.5, למעט ניווט, בחירה וטעינה של תבנית ייעודית 2.bt ( קובץמשלים 9).
2. בחר | תבנית תבנית התאמה אינטראקטיבית; לאחר מכן, לחץ על ערוך המרה.
3. בממשק תבנית המרה, שנה את קנה המידה, התרגומים וההטיות של ¹D ^{ו- 2}D כדי ליישר טוב יותר את התבנית עם הפסגות שזוהו; לאחר מכן, לחץ על שינוי צורה של תבנית.
4. באמצעות התבנית שהשתנתה, לחץ על ערוך התאמה; לאחר מכן, חזור על שלבים 11.8-11.9.

13. בצע ניתוח משולב לא ממוקד וממוקד על פני קבוצה של כרומטוגרמות

הערה: תבנית משולבת לא ממוקדת וממוקדת (UT), המכונה גם תבנית תכונה ^24,25, כאשר היא מותאמת לכל קבוצה של כרומטוגרמות, יוצרת התכתבויות בין אנליטים לא מאוטרים וממוקדים, ולאחר מכן מופקות תכונות מדגם צולבות עקביות לזיהוי תבניות.

1. בצע עיבוד מקדים (שלבים 1-6) והתאמת תבניות UT (שלבים 11.1-11.9) עבור כל הכרומטוגרמות בערכה (כלומר, כרומטוגרמות ^{דו-ממדיות}של שמנים). לחלופין, הפוך שלב זה לאוטומטי עם תוכנת פרוייקט או תוכנה דומה, לא מתואר כאן.
2. הפעל את תוכנת החוקר.
3. בחר | קובץ ניתוח פתוח; לאחר מכן, בחר ופתח את "תכונה Jove su 70 eV.gca" (קובץ משלים 10).
4. לחץ על אישור כדי לפתוח ולבחון את התוצאות.
5. לחץ על הכרטיסיה תרכובות כדי לסקור ערכים וסטטיסטיקות של מדדים עבור ניתוחים ספציפיים (כלומר, ניתוחים ממוקדים עם שמות כימיים משויכים) או ניתוחים לא ממוקדים עם (#) מזהים המיושרים בין כל הכרומטוגרמות, ולאחר מכן בצע את השלבים הבאים.
   1. לחץ על הכרטיסיה תכונות כדי לסקור ערכים וסטטיסטיקות עבור מדדים ספציפיים על-פני כרומטוגרמות.
   2. לחץ על הכרטיסיה סיכום כדי לסקור את סטטיסטיקת הסיכום עבור תרכובות ותכונות כאחד. אם הכרומטוגרמות הן ממעמדות שונים, כמו במקרה זה שמנים המופקים מזיתים שנקטפו בשני אזורים שונים באיטליה, הכרטיסייה סיכום מפרטת את סטטיסטיקת יחס פישר (F ו- FDR), המספקים תובנות על תכונות להפליה בין כיתות.
   3. הצג תרשימים שונים בכל הכרטיסיות, ואם תרצה, בצע ניתוח רכיבים ראשי (PCA) בכרטיסיה תכונות.

14. שנה את התבנית UT לניתוח MS מקבילי

הערה: הניתוח בוצע הן עם 70 eV ו 12 eV (כלומר, גבוה ונמוך) אנרגיות יינון אלקטרונים^26,27.

1. פתח אחד מ-12 הכרומטוגרמות של ה-eV, למשל, "שמן 1 12 eV RAW.gci"(קובץ משלים 11),בצע עיבוד מקדים (שלבים 1-6) וטען את התבנית UT "תבנית UT 70 relaxed.bt"(קובץ משלים 12)כמתואר בשלבים 11.1-11.6. קבצים מסופקים כחומר משלים.
2. במידת הצורך, התאם את התבנית כך שתתאים לשיאים שזוהו של 12 eV כמתואר בשלב 12. כאן, אין חוסר התאמה משמעותי כי אותות טנדם הם מולטיפלקסים. עם זאת, יש לציין כי מכיוון שהגדרות היוניזציה השונות מייצרות פיצולים שונים, יש צורך להרגיע אילוצים עבור אילוצי qCLIC בדמיון ספקטרלי של DMF ו- RMF (לא הוכח כאן).
3. בחר | קובץ שמור תבנית; ציין את התיקיה ואת שם הקובץ, למשל, "תבנית UT 12.bt" (קובץ משלים 13); לאחר מכן, לחץ על שמור.

15. בצע ניתוח משולב לא ממוקד וממוקד על פני 12 כרומטוגרמות eV

1. בחר | קובץ ניתוח פתוח; לאחר מכן בחר ופתח את "תכונה Jove su 12 eV.gca" - קובץ משלים 14 קובץ מסופק.
2. לחץ על אישור כדי לפתוח ולבחון תוצאות.
3. לחץ על הכרטיסיה תרכובות כדי לסקור ערכים מטריים, עיין ב- 12 תגובות וסטטיסטיקות של eV עבור ניתוחים ספציפיים (כלומר, ניתוחים ממוקדים עם שמות כימיים משויכים) או על ניתוחים לא מאוטרים עם מזהים (#) המיושרים בין כל הכרומטוגרמות, ולאחר מכן בצע את השלבים הבאים.
   1. לחץ על הכרטיסיה תכונות כדי לסקור ערכים וסטטיסטיקות עבור מדדים ספציפיים על-פני כרומטוגרמות.
   2. לחץ על הכרטיסיה סיכום כדי לסקור את סטטיסטיקת הסיכום עבור תרכובות ותכונות הן ב 12 eV. אם הכרומטוגרמות הן ממעמדות שונים, כמו במקרה זה שמנים המופקים מזיתים שנקטפו בשני אזורים שונים באיטליה, הכרטיסייה סיכום מפרטת את סטטיסטיקת יחס פישר (F ו- FDR), המספקים תובנות על תכונות להפליה בין כיתות.
   3. הצג את התרשימים השונים הזמינים בכל הכרטיסיות, ואם תרצה, בצע ניתוח רכיבים ראשי (PCA) בכרטיסיה תכונות.

תוצאות

GC×GC-TOF MS דפוסים של שמן זית כתית מעולה באיכות גבוהה להציג על 500 ²D פסגות מעל סף יחס אות לרעש (SNR) של 100. סף כזה הוגדר על ידי חקירות קודמות על תנודתיות מזון^14,27 כאות היחסי המינימלי מעל הסף כדי להשיג ספקטרום אמין לניתוח חוצה השוואתי. הרכיבים מפוזרים על פני המרחב הכרומטוגרפי בהתאם לשימור היחסי שלהם בשני הממדים הכרומטוגרפיים, ובאופן ספציפי בהתבסס על התנודתיות/הקוטביות שלהם ^ב-1D והתנודתיות בשתי ^ה-2D. כאן, שילוב העמודות הוא קוטבי × חצי קוטבי (כלומר, קרבוואקס 20M × OV1701).

תבנית ^{הדו-ממדית}מראה רמה גבוהה של סדר. דפוסי שמירה יחסיים עבור סדרות ומחלקות הומולוגיות מוצגות באיור 1A עם ביאורים (גרפיקה לקבוצות ובועות לפסגות) עבור פחמימנים רוויים ליניאריים (שחור), פחמימנים בלתי רוויים (צהוב), קו אלדהידים רוויים (כחול), אלדהידים חד בלתי רוויים (אדום), אלדהידים רב בלתי רוויים (סלמון), אלכוהול ראשוני (ירוק) וחומצות שומן קצרות שרשרת (ציאנו).

לאחר מכן ניתן לזהות פסגות ^{דו-ממדיות}שזוהו על-ידי השוואת ספקטרום ה- MS הממוצע המופק מכל הספקטרום ^{הדו-ממדי}(ספקטרוםהכתמים) או מהספקטרום הגדול ביותר (ספקטרוםהשיא). איור 2 מדגים את הפלט של חיפוש ספקטרום השיא עבור Blob 5 ומחזיר התאמה של דמיון גבוה (10 הלהיטים הראשונים) עבור (E)-2-hexenal. מסדי נתונים שנחקרו הם אלה שנבחרו מראש על ידי האנליסט בשלב 8 של השיטה.

הזיהוי מאומת על-ידי יצירת אינדקס שמירה פעילה. ערך I^T הניסיוני חושב עבור הפסגות ^{הדו-ממדיות, כך}שבשלב זה החיפוש בספריה מתעדף תוצאות עם ערכים קוהרנטיים של I^Tעם כרטיסיות . ניתן להתאים אישית חלונות רגישות בהתבסס על ניסיון אנליסט, מהימנות ערכי מסד נתונים של הפניות בהתאם לשלב הנייח ותנאים אנליטיים המוחלים. כלים חדשים לכיול חכם של מדדי שימור ליניארי ללא כיול ניסיוני עם n-alkanes, פותחו לאחרונה ונדונו במחקר של רייכנבאך ואח^'19.

ניתן לאמץ את האוסף של פסגות ^{דו-ממדיות}שזוהו (כלומר, פסגות ממוקדות) כדי לבנות תבנית של פסגות ממוקדות כדי ליצור באופן מיידי התכתבויות אמינות בין אותו תרכובת בכל הכרומטוגרמות לדוגמה. אוסף פסגות התבניות הייעודיות מוצג באופן חזותי באיור 1B. עיגולים אדומים תואמים ל-196 התרכובות הממוקדות, כולל שני תקנים פנימיים (IS) המקושרים לפסגות תבניות עם קווי חיבור. IS משמש לנורמליזציה של תגובה וקווי חיבור מסייעים לדמיין איזו מה- IS הכלול תאומץ כדי לנרמל כל תגובת שיא/blob ^{דו-ממדית.}

באיור 1B, עיגולים מלאים מציינים התאמות חיוביות בין שיא התבנית לבין התבנית בפועל, בעוד עיגולים ריקים מיועדים לפסגות תבנית שעבורן ההתאמה לא אומתה. התאמות שליליות כוזבות יכולות להיות מוגבלות על ידי בחירה מתאימה של פרמטרי סף, ספקטרום הפניה ופונקציות אילוץ^13,14,18,19. עבור דפוסים מורכבים עם co-elutions מרובים, פונקציות זיהוי שיא יונים המבוססים על deconvolution ספקטרלי מומלץ יכול להיות אופציה תקפה¹⁹. מטא-נתונים של שיא תבנית מוצגים בחלונית המוגדלת של איור 1B עבור (E)-2-hexenal.

הספציפיות של התאמת תבניות מסתמכת על האפשרות להחיל פונקציות אילוץ המגבילות התכתבות חיובית לאותם פסגות מועמדים, כי, נופל בתוך חלון החיפוש של האלגוריתם, יש דמיון ספקטרלי MS מעל סף מסוים. במקרה זה, בשלב 11, סף הדמיון²³ נקבע על 700 על פי ניסויים קודמים שמטרתם להגדיר פרמטרים אופטימליים המגבילים התאמות שליליות כוזבות¹⁴. אזורים מסומנים במאפייני שיא התבנית באיור 1B מציגים את המידע אודות מחרוזת ספקטרום MS של ההפניה ופונקציית האילוץ qCLIC (כלומר, (match("

על ידי החלת התבנית על כל הכרומטוגרמות של קבוצה, אפשר להיתקל במצבים מאתגרים כמו במקרה של אי התאמה חלקית של דפוסים. זה יכול להיות בגלל חוסר עקביות בטמפרטורת התנור, זרימת גז נושא / אי יציבות לחץ, או בגלל התערבות ידנית במערכת כמו במקרה של החלפת טורים או החלפת לולאת אפנן^{נימי 14,28}. איור 3 מציג מצב של אי-התאמות חלקיות בין התבנית הייעודית לכרומטוגרמה עצמה. עבור אי-התאמות מינימליות, המרות תבנית אינטראקטיביות(איור 3, לוח הבקרה) יכולות למקם מחדש פסגות תבנית להתאמה טובה יותר. לאחר מיקום מחדש, ניתן להתאים את התבנית כדי ליצור התכתבויות. בדוגמה, שיאי התבנית (איור 3, שלב 12) תואמים כראוי לתבנית ^{הדו-ממדית}בפועל. במקרה של אי-התאמות חמורות, שלא נדונו כאן, החזרה על פעולות התאמה-שינוי-עדכון יכולה להתאים באופן איטרטיבי את מיקום פסגות התבנית לתבנית השיא בפועל^12,13,14.

כאן, הפסגות הממוקדות (כלומר, ניתוחים ידועים) מספקות כ-40% מהתוצאה הכרומטוגרפית (196 פסגות ממוקדות של כ-500 פסגות הניתנות לגילוי בממוצע). 60% האחרים של תרכובות, יחד עם המידע שהם מביאים, אינם נלקחים בחשבון בניתוח ממוקד. כדי להפוך את החקירה באמת מקיף, יישור צולב עקבי של פסגות ²D untargeted צריך גם להיות מוקם. היישום הראשון שבו התאמת תבניות הורחבה לכל האנליסטים הניתנים לגילוי עסק בתנודתיות המורכבת של קפה קלוי⁷. תהליך זה הוא אוטומטי עם תוכנה (למשל, חוקר), המוצגת כאן בשלבים 14-15.

בתהליך זה, תמונות ממוקדות מראש השייכות למדגם שנקבע במחקר (20 דגימות) משמשות להגדרת פסגות אמינות על ידי הצלבת כל תבניות התמונה²⁹. לאחר מכן, כרומטוגרמה מורכבת בנויה שממנה ניתן לזהות פסגות ואזורי שיא אמינים של UT (כלומר, טביעת רגל של פסגות ^{דו-ממדיות)}במה שמכונה תבנית תכונה¹⁷.

עבור ניתוחים שנרכשו ב 70 eV, התהליך קבע 144 פסגות אמינות עם אמינות רגועה²⁹, 76 מהם שייכים לרשימת הפסגות הממוקדות. בהתבסס על 144 פסגות אמינות אלה, התהליך מיישר את כל הכרומטוגרמות באופן עקבי עם זמני השמירה הממוצעים של הפסגות האמינות ולאחר מכן משלב אותן כדי ליצור כרומטוגרמה מרוכבת. איור 4 מציג רשימה של כל הדגימות המסומנות לפי אזור הייצור של השמן (משמאל) ורשימת הפסגות/נפחי הכתמים האמינים בכל מדגם (מימין).

תבנית התכונות הלא מאוטרת מורכבת מפסגות ^{דו-ממדיות}מאנליטים שזוהו בכרומטוגרמה המשולבת, המוצגת באיור 5A, המותאמות לתבנית הפסגות האמינות (n = 168 – עיגולים אדומים לפסגות ממוקדות ועיגולים ירוקים לפסגות לא ממוקדות). ספקטרום המסה של הפסגות המורכבות, כמו גם זמני השמירה שלהן, נרשמים בתבנית התכונה כפי שמוצג עבור (Z)-3-hexenol אצטט באזור המוגדל. אזורי שיא מוצגים באיור 5B כגרפיקה בצבע אדום; במקום זאת הם מוגדרים על ידי קווי המתאר של כל הפסגות ^{הדו-ממדיות}שזוהו בכרומטוגרמה המשולבת (n = 3578).

כאשר זיהוי דפוסים ללא השגחה על ידי ניתוח רכיבים ראשי מוחל על התפלגות פסגות ממוקדות בתוך 20 הדגימות המנותחות, השמנים הסיציליאניים והטוסקניים מקובצים בנפרד ומציעים שתנאי פדו-אקלים וטרואר ישפיעו על השכיחות היחסית של תנודתיות. התוצאות מוצגות באיור 6A ותוצאות PCA מהתפלגות הפסגות האמינות מוצגות באיור 6B. שתי הגישות נותנות תוקף צולב לכך שלשמנים מאזורים גיאוגרפיים שונים יש חתימות כימיות שונות, בעוד שחתימות כימיות קוהרנטיות, בין אם הן תרכובות ממוקדות או לא מאופות, או שתיהן, ממופות.

לבסוף, התוכנה מאפשרת יישור מחדש מהיר ויעיל של דפוסים בערוצי זיהוי מקביליים. ביישום זה, היישור מחדש מוצע עבור אותות יינון טנדם. מקור היונים של מולטיפלקסים MS בין שתי אנרגיות יינון (כלומר, 70 ו 12 eV) בתדר רכישה של 50 הרץ לכל^{ערוץ 30}. שני הדפוסים הכרומטוגרפיים המתקבלים מיושרים באופן הדוק בעוד נתונים ספקטרליים (כלומר, חתימות ותגובות ספקטרליות) מביאים מידע משלים עם טווחי תגובה דינמיים שונים^26,27. התבניות המיושרות מאפשרותחילוץ תכונות (פסגות דו-ממדיות ואזורי שיא) עם מזהים חד-משמעיים (כלומר, שמות כימיים לפסגות ממוקדות ומספר מספור ייחודי עבור פסגות ואזורי שיא לא מפורקים).

התאמת תבניות מאפשרת יישור צולב יעיל. במצב זה, אין הרבה חוסר התאמה, אבל אילוצי MS חייב להיות רגוע כדי לאפשר התאמות עבור פסגות UT. מצד שני, אזורי שיא נבחרים של UT, ללא אילוצי MS, מותאמים באופן מיידי ללא התאמות שליליות כוזבות. איור 5C מציג שטח מוגדל של כרומטוגרמה של 12 eV שבה תבנית התכונה הבנויה מנתוני 70 eV תואמת. פסגות UT אמינות מותאמות באופן חיובי בגלל אילוצי qCLIC שהורדו (למשל, סף DMF ב- 600). יש לציין, ב 12 eV, יש פחות פסגות זוהו בשל הפיצול המוגבל המושרה על ידי אנרגיית יינון נמוכה.

איור 1: התוויית מתאר של Bidimensional ותבנית ממוקדת. (A)חלקת מתאר של החלק הנדיף של שמן זית כתית מעולה מטוסקנה. דפוסים מסודרים של סדרות ומעמדות הומולוגיים מודגשים בצבעים וקווים שונים: פחמימנים רוויים ליניאריים (קו שחור וקווי מתאר דו-ממדיים) פחמימנים ^בלתירוויים (צהוב), אלדהידים רוויים ליניאריים (כחולים) אלדהידים חד בלתי רוויים (אדום), אלדהידים רב בלתי רוויים (סלמון), אלכוהול ראשוני (ירוק) וחומצות שומן קצרות שרשרת (צ'יאנו). (B)תבנית ייעודית מוגזמת של ניתוחים ידועים (עיגולים בצבע אדום) עם קווי חיבור המקשרים בין תקנים פנימיים (ISS). לוחות מציגים מאפייני שיא/Blob ^{דו-ממדיים}(Decanal) או מאפייני שיא תבנית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: חיפוש איפקס טרשת נפוצה. הפלט של חיפוש MS איפקס עבור Blob 5. רשימת ערכי מסד הנתונים עם התאמת הדמיון הגבוהה ביותר ומטה-נתונים קשורים הזמינים מהספריה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: יישור מחדש של תבנית. זרימת עבודה הממחישה את השלבים המאפשרים יישור מחדש של התבנית על-ידי המרה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ממשק חוקר GC. פאנל חוקרים עם כל התמונות שנבחרו המסומנות לפי אזור הייצור של השמן (משמאל) ורשימת הפסגות/נפחי הכתמים האמינים בכל דגימה (מימין). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תבנית ממוקדת ותבנית UT. (A)פסגות אמינות כתוצאה מהעיבוד האוטומטי בשלב 11; עיגולים אדומים תואמים לניתוחים ידועים בעוד עיגולים ירוקים אינם ידועים. בחלונית 'על-גבי תבנית', מאפייני אובייקט תבנית מוצגים עבור (Z)-3-הקסלתי. (B) אזור מוגדל המציג את פסגות UT (עיגולים אדומים וירוקים) ואזורי שיא (גרפיקה אדומה) של תבנית UT תואמים לשמן לדוגמה שנרכש באנרגיית יינון של 70 eV. (C) תבנית UT תואמת על שמן מדגם שנרכש ב 12 אנרגיית יינון eV. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: PCA טוען חלקות. הם מראים את ההתאמה הטבעית של דגימות (שמנים מטוסקנה וסיציליה) כפי שהם וכתוצאה מכך (A) הפצת פסגות ממוקדות או (B) UT פסגות הפצה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קבצים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קבצים אלה.

Discussion

הדמיה של נתוני MS ×GC-TOF היא צעד בסיסי להבנה נאותה של התוצאות שהושגו על ידי הפרדות דו-ממדיות מקיפות. עלילות תמונה עם צביעה מותאמת אישית מאפשרת לאנליסטים להעריך הבדלי תגובת גלאי ובכך את ההתפלגות הדיפרנציאלית של רכיבים לדוגמה. גישה חזותית זו משנה לחלוטין את נקודת המבט של האנליסטים על הפרשנות וההרחבה של כרומטוגרמות. צעד ראשון זה, לאחר שהובן ונ בשימוש בטוח על ידי כרומטוגרפים, פותח נקודת מבט חדשה בעיבוד נוסף.

היבט בסיסי נוסף של עיבוד נתונים הוא הנגישות למטריצת הנתונים המלאה (כלומר, נתונים ותגובות ספקטרליים של MS) עבור כל נקודות הדגימה, שכל אחת מהן תואמת לאירוע גלאי יחיד. במובן זה 2 D פסגות אינטגרציה, ^כךאוסף של אירועי גלאי המתאים ניתוח יחיד מייצגים צעד קריטי. בפרוטוקול הנוכחי, זיהוי פסגות ^{דו-ממדיות}מבוסס על אלגוריתם קו פרשת המים¹⁸ עם כמה התאמות הכלולות בשיפור רגישות הגילוי במקרה של תרכובות שיתוף-eluting חלקיות. כדי להפוך את התהליך הזה לספציפי יותר, יש לבצע דה-קונבולוציה, ולאמץ נהלים מתוחכמים יותר. הדבר אפשרי על-ידי ביצוע זיהוי שיא יון עבור נתוני MS; האלגוריתם מעבד את מערך הנתונים ומבודד את התגובה מניתוח יחיד המבוסס על פרופילים ספקטרליים^19,31.

שלב חשוב אך קריטי של הפרוטוקול, ושל כל תהליך פרשנות נתונים GC×GC-MS, מתייחס לזיהוי אנליטים. הליך זה, המוצע בשלבים 8 ו -9, בהיעדר ניתוח מאשר עם סטנדרטים אותנטיים, חייב להתבצע בקפידה על ידי האנליסט. פעולות אוטומטיות זמינות בכל תוכנה מסחרית; הם כוללים הערכת דמיון לחתימה ספקטרלית של MS מול ספקטרום הייחוס שנאסף (כלומר, ספריות ספקטרליות) והערכת יחסי מאפיינים בין יונים מזהים/מכמתים. עם זאת, נדרשים קריטריונים מאשרים נוספים כדי להסיק זיהוי של isomers. הפרוטוקול מציע אימוץ מדדי שמירה ליניאריים כדי לתעדף את רשימת המועמדים; המגבלה כאן מתייחסת לזמינות של נתוני שמירה ולעקביות שלהם.

המאפיין העיקרי שהופך גישה זו לייחודית הוא התאמת תבנית^12,13,15,29. התאמת תבניות מאפשרת זיהוי תבניות ^{דו-ממדי}בצורה יעילה, ספציפית ואינטואיטיבית מאוד. ניתן להגדיר אותו, במונחים של רגישות וספציפיות, על-ידי החלת ערכי סף ו/או פונקציות אילוץ מותאמים אישית בעוד האנליסט יכול לפקח על ההליך על-ידי אינטראקציה פעילה עם פרמטרי פונקציית שינוי צורה. הייחודיות של תהליך זה מסתמכת על האפשרות ליישר מידע פסגות ממוקדות ולא ממוקדות בין דגימות של אצווה אחידה, אלא גם בין דגימות שנרכשו באותם תנאים נומינליים למרות חוסר התאמה בינוני עד חמור. היתרונות של פעולה זו מתייחסים לאפשרות לשמר את כל זיהויי הניתוחים הממוקדים, שהיא משימה שגוזלת זמן רב עבור האנליסט, ואת כל המטה-נתונים שנשמרו עבור פסגות ממוקדות ולא ממוקדות מהפעלות פירוט קודמות.

התאמת תבניות היא גם יעילה מאוד במונחים של זמן חישובי; קבצי MS נתונים ברזולוציה נמוכה מורכבים מכ- 1-2 Gb של נתונים ארוזים בעוד שניתוחי MS ברזולוציה גבוהה עשויים להגיע ל- 10-15 Gb לכל הפעלה אנליטית יחידה. התאמת תבניות אינה מעבדת את מטריצת הנתונים המלאה בכל פעם, אך בתחילה, מבצעת יישור זמן שמירה בין כרומטוגרמות באמצעות פסגות תבנית לאחר מכן, מעבדת פסגות מועמדים בתוך חלון החיפוש עבור דמיון שלהם תואם עם הפניה בתבנית. במקרה של חוסר התאמה חמור, המצב המאתגר ביותר, טרנספורמציות פולינומיאליות מסדר שני גלובליות ביצעו ביצועים טובים יותר משיטות מקומיות תוך צמצום זמן חישובי¹³.

עבור טכניקת GC×GC להתפשט באופן נרחב מעבר לאקדמיה ומעבדות מחקר, כלי עיבוד נתונים צריכים להקל על פעולות בסיסיות לבדיקת הדמיה וכרומטוגרמות; זיהוי של אנליטים צריך להציע את האפשרות לאמץ אלגוריתמים ונהלים סטנדרטיים (למשל, אלגוריתם חיפוש NIST וכיול I^T); וניתוח חוצה השוואתי צריך להיות אינטואיטיבי, יעיל ונתמך על ידי כלים אינטראקטיביים. הגישה המוצעת עונה על צרכים אלה תוך הצעת אפשרויות וכלים מתקדמים להתמודדות עם מצבים מורכבים כגון ניתוח אלוציה משותפת, כיול ניתוחים מרובים, ניתוח סוג קבוצה ויישור זיהוי מקבילי.

הספרות המוזכרת מכסה היטב תרחישים אפשריים רבים שבהם GC×GC, ובאופן כללי יותר, כרומטוגרפיה דו מימדית מקיפה, מציעים פתרונות ייחודיים ותוצאות אמינות שלא ניתן להשיג על ידי ¹D-כרומטוגרפיה בניתוח ריצה אחת. ^5,32,33 למרות GC×GC הוא הכלי החזק ביותר המגביר את יכולת ההפרדה ורגישות, תמיד יש מגבלות כוח ההפרדה, רגישות, ויכולות מערכתיות אחרות. ככל שהתקרבו לגבולות מערכתיים אלה, ניתוח הנתונים הופך בהדרגה לקשה יותר. לכן, המחקר והפיתוח חייבים להמשיך ולשפר את הכלים האנליטיים העומדים לרשותנו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min.	Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia	PN 054796	Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min.
2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from .	Mega, Legnano, Milan, Italy	PN MEGA-1701
Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC	SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK
Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy	Project VIOLIN (Ager - Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare)		Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14
Gas chromatograph: Model 7890B GC	Agilent Technologies Wilmington DE, USA
GC Image GC×GC edition V 2.9	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Image processing software	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Mass spectrometer: BenchTOF-Select	Markes International Llantrisant, UK
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6)	Merck-Millipore/Supelco	PN: 68982
Modulator controller: Optimode v2.0	SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy
Modulator: KT 2004 loop type	Zoex Corporation Houston, TX, USA
MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3	National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD		https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17
n-alkanes C8-C40 for retention indexing	Merck-Millipore/Supelco	PN: 40147-U
n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv	Merck-Millipore/Supelco	PN: 100795
Solid Phase Microextraction fiber	Merck-Millipore/Supelco	PN 57914-U
α- /β-thujone (CAS 546-80-5)	Merck-Millipore/Sigma Aldrich	PN: 04314